酸探针用于检测braf基因突变
[0130] 本发明提出的磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸探针在和靶链配对前后，荧光增强显 著，对错配碱基区分明显，有望应用于基因组的单碱基错配分析。于是，本发明首先进行 了该探针对于人类黑色素瘤braf基因突变的检测。在braf基因中，发生于1860位点的 T-A的突变，占据了黑色素瘤基因突变的很大一部分。于是，本发明采用与实施例3同 样的修饰策略，针对该位点设计合成了一个新的20个碱基的核酸探针braf-SO,用于检测 该突变，Braf-S0序列：5' -TCG AGA TTT CTC TGT AGC TA-3'（黑体T表示芘修饰位点）； Braf-wt序列：5'-TAG CTA CAG TGA AAT CTC GA-3';braf-mut序列：5'-TAG CTA CAG AGA AAT CTC GA-3'。从图9中可以看出，braf-S0本身荧光发射极其微弱，当和完全配对的突 变序列barf-mut结合后，荧光强度显著增强；而和野生型序列braf-wt结合后，荧光强度几 乎没有增加。同时记录在378nm处的荧光强度，可以发现，相比于单链探针，荧光增强倍数 高达38. 6倍。针对野生型和突变型的显著差异，表明该探针有望应用于实体生物样本中的 检测。
[0131] 2、磷酸位置芘修饰核酸探针用于区分braf基因V600突变型和野生型细胞
[0132] 本发明继续将核酸探针braf-SO应用于包含Braf基因V600突变型和野生型细胞 的检测。
[0133] 分别从BRAF基因V600位点突变型及野生型的A375细胞和HEK-293A细胞中，利 用trizol法提取总RNA，使用逆转录试剂盒（promega，CAS:A3500)获得cDNA文库。逆转 录反应体系为：4以1]\%(：12,24 110\逆转录131^€6^24 1(1犯13,0.54 11?嫩酶抑制剂， 15UAMV酶，ΙμL01igo(dT)15,以及lyg总RNA。逆转录程序为：42°C15min，95°C5min， 4°C5min。继而分别采用能够扩增突变型和野生型BRAF基因序列的引物对cDNA进行扩 增。使用的引物如下：上游引物5' -TGGTGTGAGGGCTCCAGCTTGT-3' ；下游引物为5'-ATGGGA CCCACTCCATCCAGATTTCT-3'（用于突变型）和 5' -ATGGGACCCACTCCATCCAGATTTCA-3'（用于 野生型），所有引物配置为10μΜ浓度的储备液。第一次PCR反应体系为20μL，包含10μ1 PCR反应预混液GoTaqPCRmasterπ?χ(2Χ)，7μ1 (ΜΗ20，1μ1上游引物，ΙμL下游引物， 141〇0嫩。？〇?程序为95°(：，5111丨11;95 1€308,60°(：1111丨11，72°(：，1111丨11，35个循环；反应结束 后4°C冷却。该PCR产物稀释10倍至200μL作为模板母液，进行不对称PCR反应。反应 体系为50yL，包含10yL上游引物，5yL下游引物，PCR反应预混液TakaraTaqVersion 2.0(2\)25以1^，模板溶液5以1^和(1(1!120 5以匕？〇?扩增反应在￥64衍96孔热循环仪上 完成，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸lmin，设定循环次数50,反应结束后4°C冷却。 每组反应平行进行5次，反应结束合并反应液，加入10μΜ浓度的探针溶液30μL和ddH20 20μL，按照前文所述荧光测量方法进行测量。发射狭缝和激发狭缝宽度均为10_。
[0134] 结果如图10所示。从图中可以看出，相比于单独荧光探针的荧光发射强度，野生 型的PCR反应体系荧光强度只有很小幅度的增加，而突变型的PCR反应体系荧光强度增强 十分明显，最大发射波长378nm处的强度增强可达10倍以上。由此可知，磷酸位置芘修饰 的寡聚核苷酸探针可以通过不对称PCR对包含单碱基突变的细胞进行有效区分。
[0135] 实验例4花修饰的i-motif核酸序列在不同pH值下的焚光性能实验
[0136] -、在不同pH值下的焚光性能测定
[0137] 表2花修饰的i-motif核酸序列
[0138]
[0139] 荧光光谱的测量条件：寡聚核苷酸浓度1μM，10mMΚΗ2Ρ04-Κ2ΗΡ04缓冲液（pH分别 为7. 4、5. 7)，100mMNaCl。使用CaryEclipse荧光光度计在常温下测量。激发波长：425nm; 激发狭缝：5nm;发射狭缝：5nm;检测高压：600V;扫描速度：240nm/min。系统对谱线做平滑 处理。
[0140] 实验结果见图11，从结果可见，三条茈修饰的核酸序列在酸性条件下荧光较弱，在 pH7. 4条件下焚光增强。
[0141] 二、茈修饰的i-motif核酸的荧光强度与pH值的线性关系考察
[0142] 荧光光谱的测量条件：i-s-S-pery浓度1μΜ，10mMΚΗ2Ρ04-Κ2ΗΡ04缓冲液（pH分别 为5· 0、5· 7、6· 2、6· 8、7· 4、8)，100mMNaCl。使用Cary Eclipse荧光光度计在常温下测量。 激发波长：425nm ;激发狭缝：5nm ;发射狭缝：5nm ;检测高压：600V ;扫描速度：240nm/min〇 系统对谱线做平滑处理。实验结果见图12,从试验结果可见，pH值与茈修饰的核酸序列荧 光强度存在线性对应关系。
【主权项】
1. 发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物，其特征在于，其为式I所示结构的化 合物：其中，所述Base(碱基）选自胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤；Rl选自芘，茈或萘酰 胺；R2为甲基，乙基或异丙基；R3为甲基，乙基或异丙基；DMTr为对二甲氧基三苯甲基；η为 1-8的任意整数，优选为1-6的任意整数，更优选为1-4的任意整数。2. 按照权利要求1所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物，其特征在于： 当Rl为芘时，R2为甲基，乙基或异丙基；R3为甲基，乙基或异丙基；DMTr为对二甲氧基 三苯甲基；η为1或4 ; 当Rl为茈时，R2为甲基，乙基或异丙基；R3为甲基，乙基或异丙基；DMTr为对二甲氧基 三苯甲基；η为3 ; 当Rl为萘酰胺时，R2为甲基，乙基或异丙基；R3为甲基，乙基或异丙基；DMTr为对二甲 氧基三苯甲基；η为2。3. 权利要求2所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的中间体，其特征在 于，其为式VI-式IX所示：4. 一种制备权利要求2所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法， 其特征在于，包括： (1)将芘丁酸还原得到芘丁醇；(2)在无水、无氧环境和氮气保护下，将芘丁醇与双二 异丙基氨基氯化磷反应，得到芘修饰的亚磷中间体；（3)在无水、无氧环境、氮气保护和催 化剂存在的条件下，将芘修饰的亚磷中间体和DMT保护的脱氧核苷反应，得到芘修饰的脱 氧核苷亚磷酰胺单体化合物； 或者：（1)在无水、无氧环境和氮气保护下，将芘甲醇与双二异丙基氨基氯化磷反应， 得到芘修饰的亚磷中间体；(2)在无水、无氧环境、氮气保护和催化剂存在的条件下，将芘 修饰的亚磷中间体和DMT保护的脱氧核苷反应，得到芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合 物； 或者：（1)在无水、无氧环境和氮气保护下，将茈丙醇与双二异丙基氨基氯化磷反应， 得到茈修饰的亚磷中间体；(2)在无水、无氧环境、氮气保护和催化剂存在的条件下，将茈 修饰的亚磷中间体和DMT保护的脱氧核苷反应，得到茈修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合 物； 或者：（1)在无水、无氧环境和氮气保护下，将N，N-二甲胺基萘酰胺基乙醇与双二异丙 基氨基氯化磷反应，得到萘酰胺修饰的亚磷中间体；（2)在无水、无氧环境、氮气保护和催 化剂存在的条件下，将萘酰胺修饰的亚磷中间体和DMT保护的脱氧核苷反应，得到萘酰胺 修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。5. 按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述催化剂为四氮唑； 所述脱氧核苷选自胸腺嘧啶脱氧核苷、胞嘧啶脱氧核苷、腺嘌呤脱氧核苷或鸟嘌呤脱 氧核苷中的任意一种。6. 权利要求1或2所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物在制备寡聚核苷 酸探针中的应用。7. -种荧光寡聚核苷酸探针，其特征在于：含有权利要求1或2所述的发色团修饰的 亚磷酰胺单体化合物。8. 按照权利要求7所述的荧光寡聚核苷酸探针，其特征在于：含有1个或1个以上权 利要求1或2所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。9. 按照权利要求7或8所述的荧光寡聚核苷酸探针，其特征在于：权利要求1或2所 述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物位于寡聚核苷酸链的任意位置，优选为位 于寡聚核苷酸链的中部。10. 权利要求7或8所述的发色团修饰的脱氧核苷寡聚核苷酸探针在制备单碱基多态 性检测试剂、目标基因或RNA检测以及PCR过程中的单碱基错配检测中的应用。
【专利摘要】本发明公开了发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用。本发明将芘、苝或萘酰胺等发色团与双二异丙基氨基氯化磷相连接得到亚磷中间体，再与DMT保护的脱氧核苷反应，得到发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。通过DNA的固相合成，将其定点插入到寡聚核苷酸中得到发色团修饰的双链结构稳定的荧光寡聚核苷酸探针。该荧光寡聚核苷酸探针本身没有荧光发射，只有和完全配对的靶链结合后，荧光增强可达23.5倍且响应速度快；对于错配碱基识别明显，几乎没有荧光发射，可以明显区分出单碱基错配，能应用于基因单碱基突变分析和PCR反应过程检测等，在单碱基多态性检测和生化样品中核酸检测等方面中应用前景广泛。
【IPC分类】C09K11/06, C07H19/10, C07F9/22, C12N15/11, C07H21/04, C07H1/00, C12Q1/68, C07F9/576
【公开号】CN105348343
【申请号】CN201510836634
【发明人】汤新景, 李鹏飞, 王志轩
【申请人】北京大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月25日