收获原代骨髓间充质干细胞。
[0028] S12、对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养至第三代骨髓间充质干细胞：
[0029] 将原代骨髓间充质干细胞调整至I X IO6~I X 108个/25ml，加入培养基进行培养， 优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10 6~10 smol/L的氢化可的松、 80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。当细胞生长到融合时，PBS漂洗2~3次， 加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按 1 :2~1 :3比例传代接种培养至细胞生长到融合，重复上述操作继续传代，艮P PBS漂洗2~ 3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消 化，按1 :2~1 :3比例传代接种培养至细胞生长到融合，即获得第三代骨髓间充质干细胞。
[0030] 步骤S2的具体过程为：
[0031] 取三维细胞培养支架于蒸馏水中复溶，复溶过程中可添加助溶剂如乙酸或乙醇促 进三维细胞培养支架溶解，优选地，助溶剂为乙酸，且乙酸的质量分数为5% -15%。取第三 代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以I X IO8~I X 10 w个/L细胞浓度与复 溶后的三维细胞培养支架共同接种于培养基中进行培养。
[0032] 优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10 6~10 smol/L的氢化 可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。其中，氢化可的松能够参与细胞的 糖代谢、脂类代谢等，调节骨髓间充质干细胞的增值，促进骨髓间充质干细胞功能表达。青 霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链霉素能够作 用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗 药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将 青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对骨髓间 充质干细胞的生长及活性造成的不良影响。因此，采用该血清培养基培养间充质干细胞不 仅可以促进骨髓间充质干细胞生长和增殖，而且可避免培养过程中产生的细菌对细胞活性 造成的影响。
[0033] 另外，该步骤中所采用的三维细胞培养支架可以是胶原支架与纳米晶胶原基骨的 混合物、也可以是胶原支架与脱细胞软骨的混合物、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的混合 物，亦或是胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的混合物。
[0034] 其中，胶原是具有三螺旋结构的蛋白质，不能被蛋白酶利用，不易被降解，而通过 胶原制备的胶原支架不仅机械性能较好，而且具有一定的生物活性、生物相容性以及三维 多孔结构。
[0035] 纳米晶胶原基骨具有三维孔洞网络结构，机械强度较好，具有一定的生物相容性， 但其生物相容性低于胶原支架。
[0036] 因此，将胶原支架和纳米晶胶原基骨组合在一起作为三维细胞培养支架，能够提 高三维细胞培养支架整体的机械性能和生物相容性及生物活性，以更好地模拟骨髓微环 境，并维持骨髓间充质干细胞生长的三维空间，促进骨髓间充质干细胞的生长和增殖，并提 高骨髓间充质干细胞的细胞活性。优选地，三维细胞培养支架中含有的胶原支架的质量为 0. 2~lg，纳米晶胶原基骨的质量为0. 2~lg。
[0037] 脱细胞软骨是生物新鲜组织经过物理方法处理，脱去组织中的所有细胞、抗原等 物质后所得到的产物，主要包括大量对细胞黏附、增殖有利的蛋白多糖和II型胶原等，具有 良好的生物相容性、柔韧性、低抗原性，在体外培养过程中无降解变形，保留了培养前的结 构，其力学性质与天然的软骨很相近，还具有能提供对细胞黏附有益的信号分子，但脱细胞 软骨不具有三维孔隙结构，细胞黏附面积较少，且造成细胞分布不均匀，接触培养基的面积 较少等缺陷，因此，将脱细胞软骨配合具有三维多孔结构的纳米晶胶原基骨和/或胶原支 架共同作为三维细胞培养支架可解决单独使用脱细胞软骨所存在的缺陷；而脱细胞软骨 能够释放有利于细胞生长和增殖的营养因子，能够进一步提高三维细胞培养支架整体的生 物相容性，从而可实现人工模拟骨髓三维微环境进行体外培养骨髓间充质干细胞，不仅可 增加骨髓间充质干细胞的生长面积，使得骨髓间充质干细胞在三维细胞培养支架上分布均 匀，提高骨髓间充质干细胞与培养基的接触面积，而且可促进骨髓间充质干细胞与三维细 胞培养支架的黏附性，从而更有利于骨髓间充质干细胞的生长和增殖，并能够促进骨髓间 充质干细胞保持其细胞活性及干细胞特性，不易分化。优选地，三维细胞培养支架中含有的 胶原支架或纳米晶胶原基骨的质量为0. 2~Ig和脱细胞软骨匀浆的浓度为15-50g/L。
[0038] 在本发明中，胶原支架的制备过程为：取胶原溶于乙酸溶液中，获得胶原溶胀液； 胶原溶胀液经真空脱泡处理后，于_5°C~-198Γ温度下冷冻0. 5~2小时，然后再进行冻 干即可。
[0039] 纳米晶胶原基骨的制备过程为：制备钙磷质量分数比为I. 0~2. 5的溶液，加入I 型胶原溶液中，离心去上清，冷冻干燥，再加入聚乳酸即复合形成纳米晶胶原基骨三维框架 材料；其中，钙磷质量分数比为I. 〇~2. 5的溶液是由可溶性钙盐和可溶性磷酸盐的混合而 成。
[0040] 脱细胞软骨的制备过程为：取关节软骨浸泡于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液 中，经粉碎、梯度离心制成软骨微丝，经脱细胞处理后，离心冲洗，加入DNA酶和RNA酶消化 后，重复离心，收获沉淀物即脱细胞软骨。
[0041] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本 发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。
[0042] 本发明中提供的胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的制备过程如下：
[0043] 1、胶原支架的制备，包括以下步骤：
[0044] 1)取新鲜牛腱，去除肌肉、脂肪，并尽可能去除筋膜；用三蒸水反复清洗后，装于 PE自封袋中-30 °C保存；
[0045] 2)于冷冻状态下，用手术刀将牛腱削为薄片，然后于组织捣碎机中捣碎；
[0046] 3)称取60克左右牛腱粉碎物，用0· 05 % (w/v)的醋酸洗必泰浸泡5min消毒，然 后用〇. 9%的生理盐水多次洗涤，纱布过滤，尽可能洗去残留的醋酸洗必泰；
[0047] 4)将消毒后的牛腱于含有0. 25%胰酶的PBS消化液（pH = 7. 4)中，37°C下消化 24小时；
[0048] 5)消化结束后，加入几滴H2O2,浸泡10-15分钟，去除残留的胰酶；然后用三蒸水反 复清洗，洗去H 2O2;
[0049] 6)在消化好的牛腱中加入少量3%的乙酸溶液，用组织捣碎机搅拌为粘稠状混合 物，再加入1000毫升3%的乙酸溶液，于4°C溶胀72小时；
[0050] 7)用布氏漏斗将未溶胀的牛腱颗粒分离，溶胀物于离心机中离心（2000r/15min)， 以分离不溶物；
[0051] 8)用5% NaCl溶液盐析离心上清液；
[0052] 9)沉淀物再经3 %的乙酸溶胀后，重复步骤7)和8);
[0053] 10)然后于三蒸水中，用截留分子量为