anKW，ChenF，JonesEBG，et al .Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids production by and okara- utilizing potential of thraustochytrids[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2001,27(4): 199-202.)，Quilodran尝试破囊壶菌以土豆加工废渣为 碳源所得DHA产量55· lmg/L/d(Quilodr&n B，Hinzpeter I，Quiroz A,et al .Evaluation of liquid residues from beer and potato processing for the production of docosahexaenoic acid(C22:6n_3，DHA)by native thraustochytrid strains[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25(12):2121_2128.)〇
[0033] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述丙氨酸母液被稀释为在所述发酵 培养基中丙氨酸的终浓度为〇. 132~26.4g/L，更优选的是0.5~1.5g/L，最优选的是0.88g/ L〇
[0034] 由于丙氨酸母液的营养成分较为单一，而且其中某些产物等对菌体生长极为不 易，所以直接从平板挑单菌落至以丙氨酸母液为氮源的发酵培养基中，菌体无法大量繁殖， 为使菌体大量繁殖并获得较高的DHA产量，在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述 发酵培养基中还包括辅助因子，所述辅助因子选自酵母粉、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨和无 机微量元素中的任意一种。
[0035]在上述方案中，作为优选，所述辅助因子为所述酵母粉。
[0036]在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述发酵培养基中所述酵母粉的浓度 为0.1~2g/L，更优选的是，所述酵母粉的浓度为0.2~0.7g/L，最优选的是，所述酵母粉的 浓度为〇.4g/L。
[0037] 在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述大豆蛋白胨的浓度为0.1~2g/L， 更优选的是，所述大豆蛋白胨的浓度为〇.2g/L;所述牛肉膏蛋白胨的浓度为0.1~2g/L，更 优选〇.2g/L;所述无机微量元素的浓度为0.05~10mg/L，更优选的是5mg/L。该无机微量元 素中包含有Na，Cu，Mn，Zn，Mo，Mn，S和P等元素。
[0038] 在上述方案中，作为优选，所述的用于生产DHA的发酵培养基中还含有浓度为40g/ L~120g/L的葡萄糖和质量百分比为20%的无机盐。最优选的，葡萄糖的浓度为80g/L。更优 选地，无机盐选用海水晶。
[0039]本发明还提供一种生产DHA的方法，在上述任一所述的发酵培养基中接种能合成 DHA的微生物进行培养，生产DHA。
[0040]因为DHA为胞内油脂，提高生物量可以获得更高的DHA产量，所以在本发明的其中 一个实施例中，作为优选，所述能合成DHA的微生物为裂殖壶菌或破囊壶菌，所述裂殖壶菌 或破囊壶菌在所述发酵培养基中的接种量为10%~20%。更优选的是，最佳的接种量14%。 且于温度26°C下培养3天。
[0041 ] 实施例1
[0042] 本发明中利用的丙氨酸母液由安徽华恒生物工程有限公司提供，丙氨酸母液中的 丙氨酸浓度为132g/L。
[0043] 本发明公开了一种利用丙氨酸母液代替传统氮源发酵生产DHA的方法。该方法包 括以下步骤：（1)将丙氨酸母液稀释至一定浓度配制发酵培养基；（2)发酵培养基中添加一 定量的酵母粉用作辅助因子促进丙氨酸的利用；（3)配制好的发酵培养基接种一定量的菌 种用于DHA的发酵生产。
[0044] 本发明可以利用工业生产丙氨酸的母液代替传统发酵过程中使用的氮源，不仅可 以解决丙氨酸母液难以处理的问题，而且大大减少了 DHA发酵生产的成本。
[0045]本发明的目的在于提供一种利用丙氨酸母液生产DHA的方法。本发明对发酵过程 中的辅助因子的来源及用量、氮源的添加量以及菌株接种量都进行了研究，以获得能够产 生大量DHA的各个参数的合适范围。
[0046]由于丙氨酸母液的营养成分较为单一，而且母液中所包含的有机酸和美拉德反应 的产物等对菌体生长极为不利，所以直接从平板挑单菌落至以丙氨酸母液为单一氮源的发 酵培养基中，菌体无法大量繁殖，所以拟添加适宜的辅助因子，然后确定最优辅助因子的最 适添加量。发酵过程中最主要的营养成分为碳源和氮源，拟确定葡萄糖和丙氨酸母液的最 适添加量，以获得最高产量的DHA。因为DHA为胞内油脂，提高生物量可以获得更高的DHA产 量，所以拟确定最佳的接种量以提高生物量。
[0047] 利用丙氨酸母液发酵生产DHA，具体的工艺步骤为：
[0048] 1)丙氨酸母液的稀释以及最适碳源氮源浓度的确定
[0049]丙氨酸母液中的丙氨酸浓度为132g/L，在菌体进入油脂积累阶段后，过高的氮源 浓度会抑制油脂的积累，所以需要对母液进行稀释，以DHA产量为标准确定氮源的最适添加 量，同时确定氮源的最适添加量以获得较高的DHA产量。
[0050] 2)确定最优的辅助因子来源及最适添加浓度
[0051] 分别尝试了菌体在微生物源的酵母粉、植物源的大豆蛋白胨、动物源的牛肉膏蛋 白胨、添加无机微量元素的丙氨酸母液、单一的无机氮源尿素中的生长情况，以确定最佳的 辅助因子。然后依据DHA的产量，确定该辅助因子的最适添加量。
[0052] 3)最适接种量的确定
[0053] DHA为胞内油脂，所以获得更高的生物量便可以得到更高产量的DHA。因为丙氨酸 母液中含有大量的有机酸、色素等不利于菌体正常生长代谢的成分，所以不利于菌体的大 量积累，从而影响DHA的产量。最简单经济的提高生物量的方式是加大接种量，所以以DHA产 量为标准确定最适的接种量。
[0054] 利用本发明的方法，将丙氨酸母液作为唯一氮源，代替传统的氮源生产DHA，可以 将丙氨酸母液中的丙氨酸安全利用，不仅解决了丙氨酸生产公司处理丙氨酸母液的难题， 而且大大降低了DHA的生产成本，最终DHA产量可以达到3.86g/L，远高于Fan尝试裂殖壶菌 以豆渣为底物所得DHA产量35.3~72.1mg/L(Fan K W，Chen F，Jones E B G，et al .Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids production by and okara- utilizing potential of thraustochytrids[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2001,27(4): 199-202.)，Quilodran尝试破囊壶菌以土豆加工废渣为 碳源所得DHA产量55· lmg/L/d(Quilodr&n B，Hinzpeter I，Quiroz A,et al .Evaluation of liquid residues from beer and potato processing for the production of docosahexaenoic acid(C22:6n_3，DHA)by native thraustochytrid strains[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25(12):2121_2128.)〇
[0055] -、碳源和氮源的最适添加量
[0056] 碳源和氮源是裂殖壶菌正常生长代谢过程中最重要的营养物质。在菌体生长阶 段，充足的氮源有利于菌体的大量繁殖。但是进入油脂积累阶段，过剩的氮源会阻碍油脂的 积累。所以适宜的氮源浓度有利于获得更高的DHA产量。因为丙氨酸母液中的丙氨酸浓度为 132g/L，所以对丙氨酸母液进行稀释。
[0057] 取裂殖壶菌或破囊壶菌按照10%的接种量接种于含有不同浓度葡萄糖