一种l-酪氨酸的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-酪氨酸的制备方法。
【背景技术】
[0002] L-酪氨酸(L-Tyrosine)是一种重要的生化试剂，是合成多肽类激素、抗生素、L-多 巴等药物的主要原料，广泛地应用于医药、食品添加剂、生物化工和饲料等领域，在医药上 能用作甲状腺功能亢进症治疗。目前制备L-酪氨酸的方法主要有水解法、发酵法和合成法 三种;水解法是最主要的生产方法，但是由于水解液中氨基酸种类较多，而传统的分离纯化 方法也难以得到纯度较高的产品，造成原辅料的消耗和产品的流失，产品质量较难达标，从 而限制了产品的销售和经济效益。
[0003] 反向微胶团萃取是从胶体或叫胶团萃取发展而来的。早期的关于反向微胶团的研 究是针对水在反向微胶团的溶解，主要用于二次采油。进入80年代以后，研究的重点转向应 用于蛋白质和其他生物大分子的分离。反向微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形 成的纳米级的一种聚体，表面活性剂的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触，而极性头则 排列在内形成极性核，极性核溶于水后就形成了"水池"。当含有氨基酸的水溶液与含反向 微胶团的有机溶剂相混合时，氨基酸以带电离子状态进入反向微胶团的"水池"内或微胶团 球粒的界面分子膜层内而被分离。如刘亚萍等在《反向微胶团萃取分离酪氨酸的研究》(氨 基酸和生物资源，2001，23(2): 32~35)中使用Α0Τ反胶团体系萃取分离L-酪氨酸，优化了萃 取、反萃取的工艺条件，但其萃取方法还有待改进，萃取效果还有待提高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了分离效率高，产品纯度高 的L-酪氨酸的制备方法。
[0005] 本发明的目的可通过下列技术方案来实现:一种L-酪氨酸的制备方法，所述制备 方法包括如下步骤：
[0006] 将短杆菌接种到培养基上，发酵培养得到发酵液，将发酵液进行离心、超滤得超滤 液，调整超滤液的PH值和离子强度；
[0007] 将表面活性剂加入到超临界萃取器中，与超临界流体形成超临界流体反胶团体 系；
[0008] 将调整后的超滤液加入到超临界萃取器中，在超临界流体反|父团体系中对超滤液 中的L-酪氨酸进行超临界萃取，得萃取产物；
[0009] 将反萃取水相溶液和萃取产物加入到超临界萃取器中进行超临界反萃取，反萃取 后取水相进行纳滤、结晶、冷冻干燥，制得纯化L-酪氨酸。
[0010] 本发明采用发酵的方法制备L-酪氨酸，具有效率高，专一性强的优点，所得L-酪氨 酸产品的杂质少，纯度高。发酵后采用离心和超滤的方法去除发酵液中的细胞碎片和蛋白 质、核酸聚合物等大分子物质，这些物质不进入反胶团，使得反胶团能够循环利用，可以回 收有机溶剂和表面活性剂。
[0011] 对发酵液的分离和纯化过程采用超临界萃取和反胶团萃取相结合的方式进行，具 有萃取效率高、后续处理简单、溶剂使用量小、低毒等优点。超临界萃取毒性和污染小，具有 广泛的应用，但对极性物质氨基酸的溶解性较低。反胶团萃取本质上仍属于溶剂萃取，存在 后处理能耗大、溶剂损耗多、对环境有污染等问题。将反胶团应用到超临界流体技术中，利 用反胶团体系具有极性与非极性的桥梁，既可克服超临界流体不能溶解强极性物质的难 题，又可避免反胶团萃取过程中存在的后处理问题。
[0012] 超临界萃取和反萃取后，表面活性剂进入到C02超临界流体中，L-酪氨酸进入到反 萃取水相溶液。经过减压和控温表面活性剂可得到完全的回收，所得L-酪氨酸萃取液通过 纳滤、结晶、冷冻干燥的方式，制成纯化L-酪氨酸。整个过程安全、高效、节能，纳滤对L-酪氨 酸的截留率搞，冷冻干燥方式所得产品的活性和纯度高，品相好，水溶性好。
[0013] 作为优选，所述超滤液采用盐酸调节PH值至4.2-5.6,加入KC1或NaCl调节离子强 度至 0 · 23-0 · 50mol/L。
[0014] 在超临界流体反胶团体系中，表面活性剂的极性头朝向反胶团的内部，反胶团的 内壁带负电荷，而L-酪氨酸是一种两性电解质，水相的PH值决定了 L-酪氨酸的离子化程度。 在PH值小于L-酪氨酸的等电点时，L-酪氨酸带正电荷，与A0T/DTDPA反胶团内所带负电荷的 性质相反，由于静电引力，可使超滤液中的L-酪氨酸转移到反胶团中。另一方面，在酸性条 件下，L-酪氨酸在水中的溶解度会增加，从而在A0T/DTDPA反胶团内部水环境里的溶解度也 会增加。因此，PH值的降低有利于L-酪氨酸的反胶团萃取，但同时随着PH值的降低，H+浓度 增大，必然导致H+与L-酪氨酸阳离子竞争结合A0T/DTDPA阴离子，从而不利于L-酪氨酸的萃 取。另外，也为了提高萃取的L-酪氨酸的纯度，避免与L-酪氨酸等电点接近的其它氨基酸被 同时萃取，将超滤液的PH值控制在上述范围内。
[0015]如前所述，DTDPA增加了萃取体系的抗无机盐能力，使L-酪氨酸在较高的离子强度 下也能被萃取，但是离子强度不能无限增加。其原因在于:较高的离子强度会影响反胶团内 壁的静电屏蔽的程度，降低L-酪氨酸分子与反胶团内壁的静电作用力。减小表面活性剂极 性头之间的相互斥力，减小反胶团的W0值和反胶团尺寸，使立体性相互(排除）作用增大， 从而降低L-酪氨酸在反胶团中的溶解性，甚至使已溶解的L-酪氨酸从反胶团中反萃取出 来。另一方面，较多的K+、Na+与L-酪氨酸存在竞争效应，不利于L-酪氨酸进入到反胶团内部 与A0T/DTDPA阴离子结合。
[0016] 作为优选，所述表面活性剂为A0T/DTDPA混合液，Α0Τ和DTDPA混合液与超临界流体 的摩尔比为1:(23-40)。
[0017]本发明采用表面活性剂A0T/DTDPA的混合与超临界流体形成超临界流体反胶团对 L-酪氨酸进行萃取，具有更高的分离效率，反萃时也更加容易。其原因在于，Α0Τ具有两条非 极性尾，极性基团较小，所形成的反胶团空间较大，有利于L-酪氨酸分子的进入;DTDPA为双 子表面活性剂，具有独特的结构和优异的表面活性，有利于在水和C0 2界面上形成分散的空 间结构，并且表面活性剂Α0Τ和DTDPA的非极性尾与C02的亲和性强，形成的反胶团所需的内 聚能低，且反胶团之间的相互作用也较弱。
[0018]而且，A0T/DTDPA混合液所形成的反胶团体系萃取能力优于传统单纯使用单一的 表面活性剂反胶团体系。Α0Τ在形成反胶团时可不用添加辅助表面活性剂且具有较好的强 度，DTDPA的CMC值比传统的表面活性剂低1-3个数量级，形成反胶团的能力强，其疏水尾能 紧密堆积在L-酪氨酸表面，可显著提高L-酪氨酸萃取率。并且DTDPA增加了萃取体系的抗无 机盐能力，使L-酪氨酸在较高的离子强度下也能被萃取。适当的无机盐浓度有利于DTDPA的 CMC值的降低，这可能是因为无机盐电解出的正电离子在溶液中不断趋近DTDPA带负电的亲 水头基，使其负电作用范围和强度大卫缩小和减弱，导致DTDPA分子间的静电斥力大大减 小，在分子热运动状态下更易缔合成胶团。AOT和DTDPA混合液与超临界流体的摩尔比控制 在上述范围内，是因为低于该比例范围则不能形成反胶团，随着该比例的增大，反胶团数目 增加，能够增溶更多的L-酪氨酸，当比例增加到上述范围的上限时，反胶团体系达到饱和 不能容解更多的AOT/DTDPA。
[0019] 作为优选，所述表面活性剂中AOT和DTDPA的摩尔比为(4-9): 3 AOT和DTDPA的摩尔 比在该比例范围内时，A0T和DTDPA的配合性好，分离效果好，萃取效率高。
[0020]作为优选，所述表面活性剂中添加有10-20%v/v的THF。。
[0021]在超临界流体和A0T/DTDPA形成的反胶团体系中由于反胶团的数量和浓度都很 大，相互之间容易发生聚积，影响L-酪氨酸进入反胶团内部，从而降低了L-酪氨酸的萃取 率。因此，本发明在进行超临界萃取时添加了适量的THF用以分散反胶团，并促进L-酪氨酸 进入反胶团内部，加快L-酪氨酸的萃取，提高L-酪氨酸的萃取率。
[0022]作为优选，所述超临界萃取和超临界反萃取中的超临界流体为C02。
[0023] 超临界流体C02临界温度低，临界压力适中，无毒无害，成本低廉，来源丰富，是一 种清洁型的环境友好溶剂。超临界流体C0 2反胶团极性内核中能形成微水池，存在极性微环 境，把在超临界流体C02中不能溶解的L-酪氨酸屏蔽在微水池中，以反胶团的形式分散在无 极性的超临界流体C〇2主体相中，从而弥补超临界流体C〇2不能溶解强极性物质的不足。
[0024] 作为优选，所述反萃取水相溶液为PH值为8.5-10.2，离子强度为1.2-2. Omol/L的 KC1或NaCl的缓冲溶液。
[0025]当水相PH值大于等电点时，L-酪氨酸带负电荷，与A0T/DTDPA反胶团内部阴离子所 带的负电荷产生静电斥力，溶入反胶团的L-酪氨酸反向萃取出来，实现L-酪氨酸的反萃取。 较高的离子强度有助于降低L-酪氨酸分子与反胶团内壁的静电作用力，并且可替代L-酪氨 酸与反胶团内部阴离子结合，从而促进反萃取的进行。
[0026]作为优选，KC1或NaCl的缓冲溶液中的缓冲剂选自磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠或乙酸-乙酸钠之一。
[0027]作为优选，所述反萃取水相溶液中还添加有0.5-6%w/v的多孔硅胶。硅胶对L-酪 氨酸具有较好的吸附性，能促进L-酪氨酸进入到水相中，多孔硅胶因其多孔的性质提供了 更大的比表面积，大大提高了其吸附能力。
[0028] 作为优选，所述超临界萃取和超临界反萃取的萃取条件均为：萃取温度为28-37 °C，萃取压力为29-40Mpa，萃取时间为2-3h，分离压力为5-9Mpa，分离温度为20-30°C。
[0029] 作为优选，所述超滤的截留分子量为1000-2000,所述纳滤的截留分子量为200-300 〇
[0030] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0031] 采用发酵法制备L-酪氨酸，采用超临界C02反胶团萃取的方式对L-酪氨酸的发酵 液进行萃取，萃取能力和分离效率高，所得L-酪氨酸的活性和纯度高，水溶性好。
[0032]在萃取时添加了 THF能促进L-酪氨酸进入反胶团内部，加快L-酪氨酸的萃取，提高 L-酪氨酸的萃取率，反萃取时添加多孔硅胶具有促进L-酪氨酸进入到水相中的作用，提高 反萃取效率。
【具体实施方式】
[0033]以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并 不限于这些实施例。
[0034]本发明中L-酪氨酸的制备方法包括如下步骤，
[0035] 实施例1
[0036] 一种L-酪氨酸的制备方法，包括如下步骤：
[0037] 将短杆菌接种到培养基上，发酵培养得到发酵液，将发酵液进行离心、超滤得超滤 液，超滤截留分子量为1000-2000,