进行SDS-聚丙烯酰 胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(见图12泳道1)。
[0193] 将适量经IPTG诱导的细胞破碎液上清加入到50mL平衡缓冲液(0.05111〇1/11^8-HCL，0.2mol/L NaCL，pH8.0)中，上样流过螯合了Ni离子的琼脂糖凝胶柱，再用平衡液平衡 UV值基线后，用咪唑洗脱液(0 · 05mo 1/L Tri s-HCL，0 · 2mo 1/L NaCL，0 · 5M咪唑，pH8 · 0)进行 梯度洗脱，（20mM，50mM，lOOmM，400mM)，仪器自动收集，5mL/管。结果，发现在lOOmM洗脱时出 现酶活峰，收集并透析，经适当浓缩，得到中性内切木聚糖酶XYN-H31的纯酶液;进行SDS-聚 丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(见图12)。泳道3中看出纯化的XYN-H31蛋白的大小约为60KD (理论分子量约55KD)，这可能是由于其两端含有的碱性氨基酸（如His标签等)会一定程度 影响到XYN-H31蛋白在SDS-PAGE过程中的迀移速率，从而造成表观分子量与理论分子量的 差别。
[0194] 9、SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0195] 以Sambrook等的实验方法为基础，分离胶、浓缩胶浓度分别为12%和5%，电极缓 冲液为pH 8.3Tris-Gly缓冲液，考马斯亮蓝染色。
[0196] (a)聚丙烯酰胺凝胶的配制
[0197] 分离胶的配制： ddH；20 4.0mL: 30%储备胶 6.0mL; 1.5mol/L Tris-HCi 3.7mL；
[0198] 10% APS O.lmL； 10% SDS O.lmL； 丁EM ED 10μL；
[0199] 浓缩胶的配制： ddH-20 5.55mL： 30%储备胶 l.OmL;
[0200] lmol/LTris-HCl 1.25mL； 10%AP 0.1 mL； 10%SDS O.ISmL：
[0201] TEMED 20 μι；
[0202] (b)将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合 需15~30min;
[0203] 样品处理:将样品加入等量的2 X Loading buffer，100°C加热3~5min，煮沸完毕 后，立即放入到冰浴或者冷水中，使其冷却。然后12000rpm离心10min，取上清作分析；
[0204] (c)上样：将15yL样品加入到孔道中，并在其中一个孔道中加入5yL的预染蛋白 Marker；
[0205] (d)电泳:在电泳槽中加入电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓 缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止；
[0206] (e)染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4~6h;
[0207] (f)脱色:将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
[0208] SDS-PAGE电泳结果如图12所示，泳道3可见到分子量约为60KD的明显条带，表明 Str印tomyces sp.H31中性内切木聚糖酶XYN-H31基因在大肠杆菌中得到高效表达。
[0209]实施例3中性内切木聚糖酶的酶学性质研究 [0210]( - )实验方法
[0211] 1、最适反应pH及pH稳定性
[0212] 取适量实施例2获得的中性内切木聚糖酶的纯酶液，分别加入不同pH值的1 %木聚 糖溶液，按常规方法测定酶活力。同时，分别将纯酶液置于不同的预定pH条件下37°C保存 60min，再按常规方法于pH 7.0条件下测定其剩余酶活力。
[0213] 2、最适反应温度和温度稳定性
[0214] 取适量实施例2获得的中性内切木聚糖酶的纯酶液，分别置于不同预定温度条件 下反应20min，测定其酶活力。同时，将纯酶液分别置于不同预定温度条件下（20°C~75°C) 保温60min，然后于45°C反应20min测定其剩余酶活力。
[0215] 3、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
[0216]取适量实施例2获得的中性内切木聚糖酶的纯酶液，分别置于终浓度为10mM的各 种金属离子以及 0.2%EDTA、0.5%EDTA，0.01%SDS、0.05%SDS(十二烷基磺酸钠）中，37°C 保存30min后按照常规方法测定其酶活力。
[0217](二)实验结果 [0218] 1、最适反应pH
[0219]取适量纯酶液，分别加入不同pH值的1%木聚糖溶液，按常规方法测定酶活力，结 果如图13所示。由图13可见，XYN-H31酶的最适反应pH为7，为一中性木聚糖酶。XYN-H31的最 适反应pH为7(以最适pH时的酶活力为100%)，该酶在pH5.5~9.0范围内相对酶活均大于 60 %，在酸性pH2~4酶活低于20 %，pH>7酶活开始下降，但下降趋势较平稳，pHIO仍有一半 酶活，说明该酶在中性及碱性条件下能发挥更好的作用。
[0220] 2、最适反应温度
[0221] 取适量纯酶液，加入PH7.0的1 %木聚糖然后分别置于不同预定温度条件下反应 20min，测定其酶活力，结果如图14所示。由图14可见，XYN-H31酶的最适反应温度为45°C。 XYN-H31反应的最适温度为45°C(以最适温度时的酶活力为100%)，40°C和50°C条件下，相 对酶活分别为90 %、70 %。
[0222] 3、pH 稳定性
[0223] 取适量纯酶液分别置于不同的预定pH条件下37°C保存60min，再按常规方法于pH 7.0条件下45°C反应20min测定其剩余酶活力。结果(如图15)表明，该酶在pH5~9范围内，剩 余酶活均有60%以上，pH2~4和pHl 1~12酶活均保持40 %左右，pH5.5和pH8酶活均保持了 80%，说明该酶在较宽pH范围内仍能保持较好的稳定性。
[0224] 4、温度稳定性
[0225] 取适量纯酶液分别置于不同的预定温度条件下（20°C~75°C)保温60min，然后于 45°C反应20min测定其酶活力。结果（如图16)表明，该酶45°C以下具有较好稳定性。该酶在 低于45°C条件下温育60min酶活力基本保持不变，温度高于45°C该酶稳定下迅速下降，50°C 剩余酶活还有70%，高于55°C酶活力急速下降。
[0226] 5、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
[0227] 把纯化得到的XYN-H31酶分别置于终浓度为10mM的各种金属离子，质量百分比 0 · 2%EDTA、0 · 5%EDTA和 0.01 %SDS、0.05%SDS中，37°C 保存 30min 后按照常规方法测定其 酶活力，结果如表2所示。结果表明，Mn2+、Ag+和Cu2+对酶活力基本无影响;Co 2+、Ca2+、Zn2+和Li +对酶活有一定程度的促进作用;Ni2+和Mg2+对酶活有微弱促进作用；而Al3+的Fe 3+则对酶活 有部分抑制作用。表面活性剂(SDS)和金属螯合剂(EDTA)对酶活影响很小。可见该酶具有耐 多种金属离子和表面活性剂的优良特性，符合造纸等工业用酶的基本要求。
[0228] 表2金属离子、表面活性剂和金属螯合剂对中性内切木聚糖酶XYN-H31活力的影 响
[0229]
'[0230]上述实施例为本发明较佳的实施+式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的1 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种中性内切木聚糖酶XYN-H31，其特征在于:其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。2. 编码权利要求1所述的中性内切木聚糖酶XYN-H31的基因，其特征在于:所述的基因 的核苷酸序列如SEQIDNo: 1所示。3. -种含有权利要求2所述的基因的表达载体。4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于:所述的表达载体为适于在大肠杆菌中 表达的载体。5. 根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于:权利要求2所述的基因被插入至pET-28a( + )载体中。6. 根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于:权利要求2所述的基因被插入至pET-28a( + )载体中的EcoRI和Xho頂每切位点之间。7. -种表达中性内切木聚糖酶XYN-H31的菌株，其特征在于:是将权利要求2所述的基 因的核苷酸序列构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21Star(DE3)得到。8. 根据权利要求7所述的表达中性内切木聚糖酶XYN-H31的菌株，其特征在于:所述的 载体为权利要求3~6任一项所述的表达载体。9. 根据权利要求7或8所述的表达中性内切木聚糖酶XYN-H31的菌株，其特征在于包括 如下步骤： 用PCR方法从嗜碱链霉菌（Streptomycessp. )H31的基因组DNA中克隆出权利要求2所 述的中性内切木聚糖酶XYN-H31的酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得 到重组质粒pET-28a-XYN-H31，并转化大肠杆菌E.coliBL21Star(DE3)菌株;经过筛选后得 到表达所述的中性内切木聚糖酶XYN-H31的重组大肠杆菌菌株E.coliBL21Star(DE3)_ XYN-H31。10. 权利要求1所述的中性内切木聚糖酶XYN-H31在造纸工业中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种中性内切木聚糖酶及其编码基因与应用。该XYN-H31基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TGA结束，共包括1380个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ？ID？No：1所示。上述中性内切木聚糖酶XYN-H31基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ？ID？No：2所示。本发明还公开了上述中性内切木聚糖酶XYN-H31在造纸等工业中的应用。
【IPC分类】C12R1/19, C12N1/21, C12N15/70, C12N9/24, C12N15/56
【公开号】CN105483098
【申请号】CN201610053484
【发明人】刘森林, 王建伟, 邢苗, 陈伟钊
【申请人】深圳大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月26日