2116-5P、miR-3939及miR-l910-3p在DR与T2D表达水平进行检测。此技术的基本原理 ：在PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同 步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。用于实验 的miR-3197 PCR扩增正向引物序列如下：5'-GGA GGC GCA GGC TCG GAA -3'、miR-2116-5PPCR扩增正向引物序列：5'_ GGG TTC TTA GCA TAG GAG GTC -3'、miR-3939PCR扩增正 向引物序列：5'-7^〇6〇6〇厶6厶(：〇厶〇厶66八1'-3'、11^1?-1910-3口扩增正向引物序列 ：5'-TGGAGGCAGAAGCAGGATGA-3'。反向引物均为通用引物(核苷酸序列如SEQIDN0.9所 示：GAATCGAGCACCAGTTACGCATG) <^θ1ι?Κ-39 内参基因的核苷酸序列为：5 ' -CCUGAGUCGAUCGAUAUAGGA-3 '。扩增cel-miR-39内参基因的正向引物的核苷酸序列为：5 ' -CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3'，反向向引物均为通用引物(核苷酸序列如SEQIDN0.9所示： GAATCGAGCACCAGTTACGCATG)〇
[0016] 上述扩增的具体步骤为： (1) miRNeasy血清提取试剂盒((^&86]1)提取血清111丨1?熟8，在提取好的血清111丨1?祖中加入 3.5μ1 miRNA-39 作为内控； (2) 采用miScript? II反转录(Qiagen, Germany)试剂盒对miRNA进行反转录； (3) 把步骤(2)中反转录成的cDNA在定量聚合酶链反应(PCR)稀释11倍，加入cel-miR-39为归一化的外参控制，25ul扩增体系：12.5ul SYBR PCR混合液，2.5ul通用引物，2.5ul 特异性引物，2ulcDNA溶液和5.5ul无 RNA酶水。扩增步骤包括初始激活在95°C，15分钟；94 °C 15 s，55 °C 30 s，70 °C 30 s，共进行40次循环。而在7500real_time PCR system (Applied Biosystems)仪器进行操作。（注:Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)各引物浓 度均为 10pmol/ul。
[0017] 6、数据分析 本次研究采用2^^7方法对数据进行整理分析得到的箱图（如图1所示），结果发现:被 检测的循环miR-2116-5p在DR与T2DM中表达差异显著，P〈0.001，有统计学意义。
[0018] 通过SPSS 18.0软件分析得到的R0C曲线（受试者工作特征曲线）图（如图2所示） 中，曲线下面积(AUC)为0.760，大于0.5，这说明循环11^1?-2116-5?的表达水平程度用来辅助 诊断2型糖尿病视网膜病变有很强的诊断价值。通过试剂盒检测循环miR-2116-5p的表达水 平程度来辅助诊断糖尿病视网膜病变有一定意义。注:参考线即机会对角线，参考线下面积 (AUC)为0.5,此线之下则该诊断方法完全没有诊断价值。 鉴定:扩增完成后，利用方法分析基因表达量，若miR-2116-5p基因片段高水平表 达，且表达倍数高于1.6则认为处于糖尿病视网膜病变发病早期。
[0019] 通过试剂盒对循环miRNAs表达水平的测量分析，我们发现:总群体中miR-2116-5p 在2型糖尿病视网膜病变患者与2型糖尿病对照组之间有差别，即在2型糖尿病视网膜病变 患者的表达水平要明显高于对照组。
[0020] 本发明可用于检测与2型糖尿病视网膜病变相关的循环miR-2116_5p表达水平程 度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。
[0021] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护 范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-2116-5p分子标记物，其特征在于:所述 的分子标记物miR-2116-5p基因片段的核苷酸序列为5'GGUUCUUAGCAUAGGAG⑶CU-3'。2. -种用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-2116-5p分子标记物的扩增引物，其特征 在于:权利要求1所述的miR-2116-5p分子标志物的正向扩增引物的核苷酸序列为5'-GGG TTCTTAGCATAGGAGGTC-3'，其反向扩增引物为通用引物。3. -种用于检测2型糖尿病视网膜病变的试剂盒，其特征在于包括权利要求2所述的扩 增miR-2116-5p基因片段的正向扩增引物：5'_GGGTTCTTAGCATAGGAGGTC-3'以及 cel-miR-39内参基因的正向扩增引物的核苷酸序列为:5' -CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3'。4. 一种利用权利要求1所述的miR-2116_5p分子标记物检测2型糖尿病视网膜病变的检 测方法，其特征在于步骤如下： a、 总RNA的提取； b、 采用miScript?II反转录试剂盒对miRNA进行反转录； c、PCR扩增：利用7500real_timePCRsystem仪器进行，加入cel-miR-39作为内参基 因，25ul扩增体系：12.5ulSYBRPCR混合液，2.5ul通用引物，2.5ulmiR-2116-5p特异性引 物，2ulcDNA溶液和5.5ul无RNA酶水;扩增反应条件:初始激活在95°C，15分钟;94°C15s， 55°C30s，70°C30s，共40次循环;反应完成后进行熔解曲线分析;其中引物溶液包括 扩增miR-2116-5p基因片段的正向扩增引物：5'_GGGTTCTTAGCATAGGAGGTC-3'以及 cel-miR-39内参基因的正向扩增引物的核苷酸序列为:5 '-CGTGAGTCGATCCATATTGTA-3 '，反 向引物为通用引物;各引物浓度均为l〇pmol/ul; d、 鉴定:扩增完成后，利用方法分析基因表达量，若miR-2116-5p基因片段高水平 表达，且表达倍数高于1.6则认为处于糖尿病视网膜病变发病早期。
【专利摘要】本发明公开了用于检测2型糖尿病视网膜病变的miR-2116-5p分子标记物及其扩增引物和应用，特点是分子标记物为miR-2116-5p分子标志物，其核苷酸序列为5’GGUUCUUAGCAUAGGAGGUCU-3’，其正向扩增引物的核苷酸序列为5’-？GGG？TTC？TTA？GCA？TAG？GAG？GTC？-3’，可应用于检测2型糖尿病视网膜病变的试剂盒中，优点是检测效率高，针对性强，可用群2型糖尿病视网膜病变的辅助诊断、检测或筛查药物中。
【IPC分类】C12N15/113, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105483231
【申请号】CN201510980980
【发明人】刘艳芬, 韩丽媛, 段东辉, 陆南佳, 汪凯悦, 顾凯波, 张璐, 段世伟
【申请人】宁波大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月23日