mmol)，室温搅 拌1小时。反应结束，减压浓缩得到粗品，经Combi-flash柱层析纯化得到黄色固体化合物 23-d(50mg)，直接用于下一步反应。纯度：42%。MSm/z(ESI):359.0[M+H] +。
[0330] 步骤 4 :向化合物 23_d (37mg，0· lmmol),化合物 3_a (33mg，0· lmmol)的 6ml 二氧六 环溶液中加入三（二亚苄基丙酮）二钯（1〇1^，0.01臟〇1)，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基 氧杂蒽（12mg，0. 02mmol)，碳酸铯（70mg，0. 21mmol)，160°C微波搅拌100分钟。反应结束， 冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩得到粗品，经制备液相分离纯化得化合物J-23 (16mg)，纯 度：18% (UV254)。MS m/z(ESI):527.3[M+H] +。
[0331] 测试例1 :对野生型EGFR和突变型EGFR激酶的活性抑制测试
[0332] 以下z' -lyte测试方法中所用试剂均购自Invitrogen。
[0333] 利用 z' -lyte 方法测定对 T790M/L858R 双突变型 EGFR 激酶（Invitrogen， PV4879)、野生型 EGFR 激酶（Invitrogen，PV3872)的抑制活性。
[0334] 10μ L T790M/L858R激酶反应体系中各组分的工作浓度为：25μΜ ΑΤΡ，0. lng/μ L T790M/L858R激酶，2μΜ Tyr04底物（Invitrogen，PV3193)。加入本发明上述实施例制备 的化合物（即待测物）后DMS0的浓度为2vol %。
[0335] 10 μ L野生型EGFR (EGFR WT)激酶反应体系中各组分的工作浓度为：10 μ Μ ATP， 0.8ng/yL野生型 EGFR激酶，2μΜ Tyr04 底物（Invitrogen，PV3193)。加入待测物后 DMSO 的浓度为2vol%。
[0336] 室温溶解10mM的药物储存液，经8vol % DMS0溶液梯度稀释至终浓度 4-0. 002 μ M。每孔中加入2. 5 μ L的待测物溶液以及5 μ L经反应缓冲液稀释的T790M/L858R 激酶（或野生型EGFR激酶）与Tyr04底物的混合物，再加入2. 5 μ L的ΑΤΡ启动反应。其 中C1孔用反应缓冲液代替ATP，C2孔不加入任何药物，C3孔按说明书描述加入磷酸化的底 物。在25度摇床避光反应60分钟后。加入5μL Development Reagent B(Invitrogen， 用TR-FRET稀释缓冲液进行稀释），于室温摇床反应60分钟。在VictorX5荧光酶标仪 (PerkinElmer)上读板，测定激发波长为405nm、发射波长为450nm和520nm的光吸收（例 如，C3 52Qnni表示C3孔在520nm的读值）。
[0337] 抑制率计算方法（参照Invitrogen，PV3193的说明书）如下：
[0338] 1、ER = Coumarin Emission(450nm)/Fluorescein Emission(520nm)
[0339] 2、磷酸化率=(l-((ERXC3520nni-C3450nniV((Cl 450nni-C3450J+ERX(C3520nni-Cl520n n)))) X100%
[0340] 3、抑制率（IR) = (1-(测试化合物的磷酸化率V(C2的磷酸化率））X 100%
[0341] 用XLFIT5. 0软件（英国IDBS公司）拟合计算半数抑制浓度IC5。。
[0342] 表1酶抑制活性与选择抑制活性
[0343]
[0344]
[0345] 由表1可知，与阳性对照物BIBW2992(阿法替尼）和AZD-9291 (制备方法参见 TO2013014448A1，结构如下）相比，本发明的实施例化合物对EGFR突变型酶（T790M/L858R) 表现出较强的抑制活性，而对EGFR野生型酶抑制活性较弱，因此本发明的化合物对EGFR突 变型酶具有较好的选择抑制活性。
[0347] 测试例 2 :EGFR T790M 抑制剂对 A431 (EGFR 野生型）及 H1975 (EGFR T790M 突变） 细胞EGFR磷酸化水平的抑制（ELISA法测定）
[0348] 以下方法中的试剂、溶液的配置方法以及细胞处理和裂解液制备步骤、ELISA检测 步骤均按照R&D DYC3570, R&D DYC1095E以及R&D DYC1095BE的说明书进行操作。
[0349] -、试剂和溶液
[0350] 细胞裂解缓冲液：1% (W/V)NP-40,20mM Tris(pH8. 0)，137mM NaCl，10% (V/V)甘 油 glycerol, ImM NaV03,2mM EDTA。
[0351] 细胞裂解液：细胞裂解缓冲液+10 μ g/mL抑肽酶（Aprotinin) (Sigma)，lOug/mL亮 抑蛋白肽酶（Leupeptin) (Sigma),现配现用。
[0352] lxPBS 缓冲液：NaCl:0. 137M，KC1:0. 0027M，Na2P04-12H20:0. 01M，ΚΗ2Ρ04:0· 0015M， ρΗ7· 4。
[0353] 洗涤缓冲液：含有0· 05% (V/V) Tween-20的PBS缓冲液。
[0354] 检测抗体稀释液：20mM Tris，137mM NaCl，0.05% (V/V)Tween-20,0. 1% (W/V) BSA，ρΗ7· 2-7. 4。
[0355] 封闭液：含有1 % (W/V) BSA的PBS缓冲液。
[0356] ELISA 试剂盒：R&D DYC3570, R&D DYC1095E 和 R&D DYC1095BE。
[0357] 二、H1975 细胞
[0358] 2. 1 :H1975细胞处理和裂解液制备
[0359] (1)将H1975细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）以1 X 104/ 孔的密度种到96孔板中，每孔90微升含10% (V/V)FBS的1640培养基，37°C、5% (V/V)C02 培养过夜。
[0360] (2)将待测化合物按照MTT实验中药物稀释方法稀释，将10 μ L稀释后的化合物 或稀释后的DMSO加入到细胞培板的对应孔中，DMSO终浓度为0. 5% (V/V)，37°C、5% (V/V) C02培养1小时。以纯DMS0处理的细胞培养体系作为细胞对照。
[0361] (3)吸掉培养基后加入100 μ L细胞裂解液，封板模封置于_80°C冰箱中过夜。以 细胞裂解缓冲液作为空白对照。
[0362] 2. 2 :ELISA 检测步骤
[0363] 按照R&D DYC1095E或R&D DYC1095BE给定说明书进行操作。
[0364] (1)R&D捕获抗体（(DYC1095BE或DYC1095E))用PBS1:180稀释，稀释好的抗体 100 μ L/ 孔加入 ELISA 反应板（Corning costar42592)，25°C摇床包被过夜；
[0365] (2) 360 μ L洗涤缓冲液洗3次；
[0366] (3)加入300 μ L封闭液，25°C摇床孵育2小时；
[0367] (4) 360 μ L洗涤缓冲液洗3次；
[0368] (5)加入40 μ L细胞裂解缓冲液和60 μ L细胞裂解液，25°C摇床孵育2小时；
[0369] (6) 360 μ L洗涤缓冲液洗3次；
[0370] (7)检测抗体用检测抗体稀释液以试剂盒说明规定比例稀释，每孔加入100μ L， 25°C摇床避光孵育1小时；
[0371] (8) 360 μ L洗涤缓冲液洗3次；
[0372] (9)将ΤΜΒ底物（R&D DY999)中的Α试剂和Β试剂以1:1进行混合，每孔100 μ L， 25 °C摇床避光孵育20分钟；
[0373] (10) 2N H2S04 每孔加入 50 μ L ;
[0374] (11)用酶标仪读板（Thermo Multiskan Κ3)分别测定细胞对照、空白对照以及药 物处理情况下的0D450值和0D570值，并用相同孔的0D450值减去相应0D570值分别得到 〇D细胞、0D空白和0D纖处理。
[0375] 2. 3数据分析
[0376] 抑制率（％ ) = 100% X (0D细胞-0D药物处理）/(0D细胞-0D空白）
[0377] 2. 4将计算得到的抑制率用XLFIT5. 0软件计算出IC5。值，参见表2。
[0378] 三、A431 细胞
[0379] 3. 1A431细胞的处理和测试步骤
[0380] (1)将A431细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）以1 X 104/孔 的密度种到96孔板中，每孔90微升含有10% FBS的DMEM培养基37°C、5% C02培养过夜。
[0381] (2)将A431细胞培养基更换为90微升无血清DMEM培养基，继续培养过夜。
[0382] (3)将待测化合物按照MTT实验中药物稀释方法稀释，将10 μ L稀释后的化合物或 稀释后的DMS0加入到细胞培板的对应孔中，DMS0终浓度为0. 5%，37°C、5% C02培养1小 时。然后在除细胞对照孔外的每孔中加入10微升2 μ g/L的EGF，在细胞孔加入10微升无 血清DMEM培养45分钟；以不加入EGF与药物处理的细胞作为细胞对照，以不加入药物的只 加入EGF处理的细胞作为EGF对照。
[0383] (4)吸掉培养基后加入100 μ L细胞裂解液，封板模封置于-80°C冰箱中过夜。
[0384] 3.2ELISA 检测步骤
[0385] 参照R&D DYC3570E说明书进行操作。
[0386] (1)R&D捕获抗体（DYC3570E)用PBS1:180稀释，稀释好的抗体100μL7孔加入 ELISA 反应板（Corning costar42592)，25°C摇床包被过夜；
[0387] (2) 360 μ L洗涤缓冲液洗3次；
[0388] (3)加入200 μ L封闭液，25°C摇床孵育2小时；
[0389] (4) 360 μ L洗涤缓冲液洗3次；
[0390] (5)加入40 μ L细胞裂解缓冲液和60 μ L细胞裂解液，25°C摇床孵育2小时；
[0391] (6) 360 μ L洗涤缓冲液洗3次；
[0392] (7)检测抗体用检测抗体稀释液以试剂盒说明规定比例稀释，每孔加入100μ L， 25°C摇床避光孵育1小时；
[0393] (8) 360 μ L洗涤缓冲液洗3次；
[0394] (9)将ΤΜΒ底物（R&D DY999)中的Α试剂和Β试剂以1:1进行混合，每孔100 μ L， 25 °C摇床避光孵育20分钟；
[0395] (10) 2N H2S04 每孔加入 50 μ L ;
[0396] (11)用酶标仪读板（Thermo Multiskan Κ3)分别测定细胞对照、空白对照以及药 物处理情况下的0D450值和0D570值，并用相同孔的0D450值减去相应0D570值分别得到 0DEGF、0D药物、0D细胞。
[0397] 3. 3数据分析
[0398] 抑制率（％ ) = 100% X (0DEGF-0D药物V(0DEGF-0D细胞）
[0399] 3. 4将计算得到的抑制率用XLFIT5. 0软件计算出IC5。值，参见表2。
[0400] 表2细胞活性ELISA法测定结果
[0401]
[0402] 由表2可知，与阳性对照物BIBW2992相比，本发明实施例的化合物对EGFR突变型 细胞具有较好的选择抑制活性。
[0403] 测试例3 :MTT (3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐）方法检测细胞 抑制活性
[0404] MTT测试方法步骤采用本领域技术人员熟知的方法进行，方法中所用试剂均可市 购得到。
[0405] 首先，移除培养基并加入lmLO. 25%的胰酶/EDTA(Gibco,25200-056)。洗一次后， 再加入1. 5mL胰酶/EDTA消化贴壁细胞，至细胞分离，然后加入3. 5mL培养基终止消化。将 消化完的细胞悬浮液移至15mL离心管，1300rpm离心3分钟后弃上清，并用新鲜的培养基重 悬细胞。然后细胞计数，并稀释细胞至以下浓度：H1975细胞每毫升2. 78万，A431细胞和 NIH3T3细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）每毫升3. 33万。将细胞种 入96孔板（BD3072)，每孔90 μ L，培养过夜。
[0406] Α431 细胞培养基为：10% FBS(Gibco, 10099-141) DMEM(Hyclone SH30243. 01Β);
[0407] NIH3T3 细胞培养基为：10 % FBS(Gibco,10099-141)DMEM(Hyclone SH30243. 01B)；
[0408] H1975 细胞培养基为：10 % FBS(Gibco,10099-141)RPMI-1640(Hyclone SH30809. 01B)；
[0409] 取20 μ LlOmM待测化合物，按照如下浓度梯度（2000,666. 67, 222. 22, 74. 07， 24. 69,8. 23, 2. 74,0.91 μ M)稀释200X药品，再加入无血清培养基（终浓度为：100,33. 33， 11. 11，3. 704,1. 235,0. 412,0. 137,0.046 μ M)，并每孔加入10ul药品到细胞培养板内其中 DMS0终浓度为0. 5%。
[0410] 加药后将细胞放入培养箱，培养72小时后，每孔加入10 μ L的5mg/ml的 MTT(Sigma，M5655)溶液，然后将96孔板放入37°C 5% C02培养箱孵育4小时。
[0411] 再在2000rpm，5min的条件下离心平板，移除上清后，每孔加入150μ L DMS0,并在 摇床中震荡平板至所有结晶紫溶解。最后使用酶标仪测定492nm光吸收，使用XLFIT5. 0软 件（英国IDBS公司）计算IC50。
[0412] 表3化合物对细胞生长的抑制活性和选择性
[0413]
[0414] 由表3可知，与阳性对照物BIBW2992相比，本发明实施例化合物对EGFR突变型细 胞（H1975细胞）表现出较强的抑制活性，而对EGFR野生型细胞（A431细胞）表现出较弱 抑制活性，因此本发明的化合物对EGFR突变型细胞具有较好的选择抑制活性。
[0415] 表4化合物对NIH3T3细胞的毒性测试结果
[0417] 由表4可知，与阳性对照物BIBW2992相比，本发明实施例化合物对NIH3T3细胞具 有较高的IC 5。值，因此显示出较小的毒性。
[0418] 从体外激酶活性抑制、细胞内EGFR磷酸化水平抑制、细胞生长抑制实验显示，在 纳摩尔浓度下，本发明实施例化合物对突变型EGFR酶活性、EGFR磷酸化水平、细胞增殖表 现出较强的抑制活性，而对野生型EGFR酶活性、EGFR磷酸化水平、细胞增殖表现出较弱抑 制活性，因此本发明化合物对EGFR突变株细胞具有较好的选择抑制活性。
[0419] 而且，细胞毒性实验中对NIH-3T3细胞有极弱的抑制作用，故表现出较低的细胞 毒性。
[0420] 因此，此类化合物对T790M突变的EGFR有较好的选择抑制活性且细胞毒性低，是 第二代EGFR-TKI的理想替代物。同时本发明的化合物表现出良好的生物利用度。
[0421] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种式（I)所示的化合物，或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其立体异构 体、或其前药：式中， Z1J2各自独立地为N或CR。；其中，R。选自下组：氢、卤素、C1 i。烷基、卤代的C1 i。烷基； Rp R2各自独立地为氧、卤素、C1 i。烷基、卤代的C1 i。烷基、C1 i。烷氧基、C3 8环烷氧基； R;?为氢*、卤素、C2 i。烯基、C1 i。烷基、卤代的C1 i。烷基、C1 i。烷氧基、C3 8环烷氧基、取代 或未取代的C3 i。环烷基、取代或未取代的C3 i。杂环基、取代或未取代的C6 i。芳环，取代或未 取代的C4 i。环烯基； 化选自下组：R5为氢、羟基、CN、NO2、卤素、C1 i。烷基、卤代的C1 i。烷基、C1 i。烷氧基、C3 i。环烷基、C3 s 环烷氧基、-CON(C1 1(]烷基）2、-NC (0) C1 1(]烷基、-C (0) OC1 1(]烷基、-OC (0) C1 1(]烷基、-COC1 10 烷基、-CO-苯基、-SO2C1 1Q 烷基、-SO2-苯基、-S (0) C1 1Q 烷基、-S (0)-苯基、-N (C1 1Q 烷基）2 ; 其中，所述的苯基为未取代的或被1-3个选自下组的取代基所取代：卤素、C1 i。烷基； R6、R7各自独立地为氢、C1 i。烷基、取代或未取代的C6 i。芳基； 其中，所述的"取代"是指环原子上的1至6个氢原子被选自下组的取代基所取代：羟 基、CN、N02、卤素、C1 1Q 烷基、卤代的 C1 1Q 烷基、-CON(C1 1Q 烷基 L-C(O)OC1 1Q 烷基、-OC(O) C1 1(]烷基、-COC1 1Q 烷基、-CO-苯基、-SO2C1 i。烷基、-SO2-苯基、-S (0) C1 1Q 烷基、-S (〇)-苯 基、-N(C1 i。烷基）2 ;其中，所述的苯基为未取代的或被1-3个选自下组的取代基所取代：卤 素、C1 10烷基。2. 如权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其立体异构 体、或其前药，其特征在于，R4选自下组：3. 如权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其立体异构 体、或其前药，其特征在于，R3为甲基、乙基、丙基、异丙基、一氟乙基、二氟甲基、三氟甲基、 环丙基、环丁基、环戊基、环己基、取代或未取代的C 3 i。杂环基、取代或未取代的苯基或取代 或未取代的C48环烯基。4. 如权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其立体异构 体、或其前药，其特征在于，所述取代或未取代的C 3 i。杂环基选自下组：其中，Z11 为 CR15 或 N ;Z21 为 CR26 或 N ;Z31 为 CR37 或 N ;Z41 为 CR44 或 N ;ηι 为 1、2 或 3 ;n2 为1或2 ; Rl2、Rl3、Rl4、尺15、R22、R23、R24、尺25、R26、R3I、R32、R33、R34、尺35、R36、R37、R42、R43、R44、尺51、R52、 R53、R54、R61各自独立地为氢、羟基、CN、NO2、卤素、卤代的C 1 i。烷基、C1 i。烷基、-CON(C1 i。烷 基）2、-N(C1 i。烷基）2、-C (0) OC1 i。烷基、-OC (0) C1 i。烷基、-COC1 i。烷基、-CO-苯基、-SO2C1 1Q 烷基、-SO2-苯基、-S (0) C1 1Q烷基、-S (0)-苯基；所述的烷基、苯基为未取代的或被1-3个选 自下组的取代基所取代：氟、氯、甲基； Rn、R21、R41各自独立地为氢、卤代的C1 i。烷基、C1 i。烷基、-COC1 i。烷基、-CO-苯 基、-SO2C1 i。烷基、-SO2-苯基；其中，所述的苯基为未取代的或被1-3个选自下组的取代基 所取代：氟、氯、甲基。5.如权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其立体异构 体、或其前药，其特征在于，所述式（I)化合物为式（II)、式（III)、式（IV)、式（V)、式（VI)、 式（VII)、式（VIII)、或式（IX)所示的化合物 ：式中，Rn、R12、R13、R14Z11如权利要求4所定义；R。、Ri、R 2、R4如权利要求1所定义；式中，R21、R22、R 23、R24、R25、Z21如权利要求4所定义；R。、&、R 2、R4如权利要求1所定义；式中，R31、R32、R33、R34、R 35、R36、Z31如权利要求4所定义；R。、Rp R2、R4如权利要求1所定 义；式中，R41、R42、R43、Z41如权利要求4所定义；R。、Ri、R 2、R4如权利要求1所定义；式中，R51、R52、R 53、R54如权利要求4所定义；R。、R2、R4如权利要求1所定义；式中，R61、ηι、n 2如权利要求4所定义；R。、Rp R2、R4如权利要求1所定义；式中，R41、R42、R43、Z41如权利要求4所定义；R。、R 2、R4如权利要求1所定义；式中，R51、R52、R53、R54如权利要求4所定义；R。、Ri、R 2、R4如权利要求1所定义。6.如权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其立体异构 体、或其前药，其特征在于，所述式（I)化合物选自下组：7. -种药物组合物，所述组合物包括权利要求1至6中任一项所述的化合物、或其药学 上可接受的盐、或其溶剂化物、或其立体异构体、或其前药；以及药学可接受的载体。8. 如权利要求1至6中任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、 或其立体异构体、或其前药在（i)制备调控EGFR酪氨酸激酶活性的药物或者（ii)制备预 防和/或治疗EGFR相关疾病的药物中的应用。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的EGFR相关疾病选自：癌症、糖尿病、 免疫系统疾病、神经退行性疾病、心血管疾病或使用EGFR调节剂治疗期间具有获得性耐药 性的疾病。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述获得性耐药性的疾病是由EGFR外显子 20编码的T790突变所引起的疾病、或者包含EGFR外显子20编码的T790突变所引起的疾 病。11. 一种药用组合物，所述药用组合物包括：权利要求1-6中任一项所述的化合物、或 其药学上可接受的盐、或其立体异构体、或其溶剂化物、或其前药；以及其它药物，所述其它 药物为选自下组药物中的一种或多种：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、拉帕替尼、XL647、 NVP-AEE-788、ARRY-334543、EKB-569、BIBW2992、HKI272、BMS-690514、CI-1033、凡德他尼、 PR)0299804、WZ4002、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕尼突单抗、马妥珠单抗、尼妥珠单抗、扎鲁 木单抗、帕妥珠单抗、MDX-214、CDX-110、頂C-11F8、Zemab、Her2 疫苗 PX 1041、HSP90 抑制 剂、CNF2024、坦螺旋霉素、阿螺旋霉素、IPI-504、SNX-5422、NVP-AUY922。
【专利摘要】本发明涉及氮杂双环衍生物、其制法与医药上的用途。具体地，本发明公开了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化合物或前药，及其制备方法，及其在EGFR抑制剂方面的应用，式中各基团的定义详见说明书。
【IPC分类】A61P37/02, A61K31/53, C07D519/00, A61P35/00, A61P3/10, A61P9/00, C07D487/04, A61P25/28
【公开号】CN105524068
【申请号】CN201410520700
【发明人】金云舟, 卜平, 何琦, 兰炯, 周福生, 张亮, 何向宇
【申请人】上海海雁医药科技有限公司, 扬子江药业集团有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年9月30日
【公告号】WO2016050165A1