ACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中 5 ' 端TCTAGA表 示Xbal酶切位点） SD-pul-3-R: GCCGACGTCAGGACTAGTCCTTATTTACTGCTCACCGGCAGG;(其中 5 ' 端GACGTC表示 Aat Π 酶切位点，其中ACTAGT序列表示Spel酶切位点） 3T-F: GGACTAGTCCATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACC，（其中 5 ' 端ACTAGT序列表示SpeI 酶切位点） 3T-R: GCCGACGTCAAGCTTACAGAGAAATACACGAGGGC(其中 5 ' 端GACGTC表示Aat Π 酶切位 点）。
[0023] PCR扩增获得Xbal-pul-Aatn基因时，50 yL反应体系设计如下： 步骤(一）中所提取的克雷伯氏菌基因组DNA，1 yL; 引物pul-F，2 yL; 引物pul-R，2 yL; 2XTag Mix,25 pL； dd H2〇,20yL; PCR反应条件:94°C预变性3min; 94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸3 min 40s，30个 循环;72°C延伸lOmin; Xbal-SD-pul-Aat Π 、XbaI-SD-pul_3- Aat Π -Spel和XbaI-pul-3-Aat Π 的PCR扩增体 系参考上述Xbal-pul-Aat Π 基因的扩增。
[0024] PCR扩增SpeI-3t-Aatn时，以人工所合成的3t颈环结构序列为模板，参考上述 PCR扩增体系进行PCR扩增。
[0025] 对上述PCR扩增产物分别进行电泳跑胶，在紫外灯下切下目的条带，并用凝胶回收 试剂盒回收目的产物。
[0026] Xbal-pul-Aat Π 、XbaI_SD-pul_Aat Π 、XbaI-SD-pul-3_Aat Π -Spel、XbaI_pul_3-Aat Π 和Spe I -3 t-Aat Π 片段的电泳结果如图2~6所示，从图中可以看出，回收的目的基因条 带明亮，可以用于后续的连接实验。
[0027](三）目的片段与T载体的连接 将步骤(二）中所回收的目的片段分别与pMD 19-T(simp 1 e)质粒载体进行连接，1 OyL连 接体系设计如下： 步骤(二）中分别回收的目的片段，4 yL; pMD19_T vector(simple),1 pL； Solution 1,5 pL； 16 °C，酶连过夜，连接产物4 °C保存备用。
[0028](四）重组质粒的转化 将步骤(三）中连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性菌株，扩增并进行 提取，具体过程如下。
[0029] 重组质粒的转化： 将步骤(三）中10 yL的连接产物加入至100 yL的大肠杆菌DH5a感受态细胞(感受态细 胞预先制备并保存于_80°C备用）中，冰浴30 min，然后在42°C水浴锅中热激90 s，立即放置 于冰上2 min; 取出转化管于超净工作台中加入890 yL液体LB培养基，37 °C、220 rpm、摇床振荡 培养1 h; 取100 mL LB固体培养基，微波炉中充分溶解后，待冷却到55°C时迅速加入100 yL 100 g/L的氨苄青霉素，摇匀后倒入平板中，待冷却后使用（即制备含氨苄青霉素抗性的100 mg/L的固体LB培养基）； 将悬浮的大肠杆菌感受态细胞(即上述振荡培养后的悬液)均匀的涂布在平板中，静置 30 min后于37 °C恒温箱中倒置培养过夜。
[0030] 重组质粒的提取： 取上述培养过夜的平板，挑取阳性单菌落于3 mL含3 yL氨苄抗性的LB液体培养基 中，37°C、220 rpm、振荡培养过夜； 对振荡培养过夜后的菌体，按照质粒小提试剂盒说明书进行质粒的提取。
[0031] 对所提取的质粒进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，结果如图7~10所示，将正确 的重组质粒4 °C保存备用。
[0032] 对电泳正确的重组质粒进一步进行测序(上海生工），并与目的片段的序列进行比 对，结果表明其相似性达99.91%，可以用于后续的实验。
[0033] 本实施例通过对具体菌株的普鲁兰酶的基因序列，分别设计引物克隆目的基因， 将所扩增的基因与pMD 19-T (s imp 1 e)质粒载体连接，最终对所提取的拟转化子测序验证，成 功构建了一些列质粒：卩]/0)19-1'-父匕&1-卩111-厶&1:11、卩]\?19-父匕&1-3〇-卩111-厶&1:11、卩]\?19-XbaI-SD-pul-3-Aatn_SpeI、pMD19- XbaI-pul-3-Aatn、pMD19_ SpeI-3t_Aatn。
[0034] 实施例2 以实施例1所提取的质粒和PHT43质粒为基础，发明人采用酶切、酶连的方法构建了新 的可在大肠杆菌中表达抗氨苄青霉素基因的穿梭质粒表达载体，详细构建过程介绍如下。
[0035] 第一，对实施例1中所提取的质粒采用Xbal、Aat Π 酶进行双酶切，所述质粒包括4 中：pMD19_T_ XbaI-pul_Aatn、pMD19- XbaI-SD-pul_Aatn、pMD19- XbaI-SD-pul-3-Aat n_SpeI、pMD19- XbaI-pul-3-Aatn; 50 yL双酶切体系设计如下： 实施例1中所提取的连接有目的基因的PMD19-T质粒载体，9 uL; Xbal(酶活，20000U/mL)，l μΜ Aatn(酶活，20000U/mL)，l μΜ 10 X Cut Smart Buffer?5 yL； dd H2〇,34 yL; 37°C 酶切 2h。
[0036] 酶切产物电泳跑胶，在紫外灯下切下回收目的条带，凝胶回收试剂盒回收目的片 段，回收产物4°C保存备用。
[0037] 第二，对质粒载体pHT43采用Xbal、Aat Π 酶进行双酶切， 50 yL双酶切体系设计如下： pHT43质粒，7 yL; Xbal(酶活，20000U/mL)，l μΜ Aatn(酶活，20000U/mL)，l μΜ 10 X Cut Smart Buffer?5 yL； dd H2〇,36 yL; 37°C 酶切 2h。
[0038]酶切产物电泳跑胶(结果如图11所示），在紫外灯下切下回收目的条带，凝胶回收 试剂盒回收目的片段，回收产物4°C保存备用。
[0039]第三，将上述所回收的酶切产物（即第一步骤中4种质粒的双酶切产物和pHT43质 粒的双酶切产物)采用T4 DNA连接酶进行连接； 20 yL连接体系设计如下： 第一步中所回收的目的基因的双酶切产物，11 μι; 第二步中质粒载体PHT43的双酶切产物，6 uL; T4 DNA Ligase，l yL; T4 DNA ligase Buffer，1 yL; dd H2〇，l yL; 16 °C酶连过夜，连接产物4 °C保存备用。
[0040]第四，将第三步骤中的连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，并进行阳性 重组质粒的筛选和提取，具体操作可参考实施例1中"(四）重组质粒的转化"的操作步骤，不 再重述； 最终构建、筛选获得4种重组质粒pHT43-pul (电泳图如图12所示）、pHT43-SD-pul (电泳 图如图 13所示）、pHT43-pul-3、pHT43-SD-pul-3。
[0041 ] 第五，将第四步骤中所筛选提取的重组质粒pHT43-pul-3和pHT43-SD-pul-3分别 用Spe I和Aat Π 进行双酶切，回收目的片段； 同时将实施例1中所构建的质粒PMD19- SpeI-3t-Aat Π 用Spel和Aat Π 进行双酶切，并 回收目的片段； 将上述双酶切产物分别用Τ4 DNA ligase进行连接，16°C酶连过夜； 将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性菌株，并最终筛选、提取、获得重 组质粒pHT43-pu 1 -31 (电泳图如图14所示)和pHT43-SD-pu 1 -31 (电泳图如图15所示）； 相关体系设计和步骤操作可参考实施例1及上述相关操作，不再重复。
[0042] 最终，本实施例共构建了 4种重组表达穿梭质粒载体:pHT43-pul、pHT43-SD-pul、 pHT43-pul-3t、pHT43-SD-pul-3t。重组质粒中所引入的芽孢杆菌的SD序列，能够与芽孢杆 菌的16S核糖体RNA进行结合，有利于后期蛋白质的翻译；同时，将颈环结构序列(3t)连接到 目的基因的3'末端，可通过增强目的基因转录后mRNA的稳定性来提高目的基因的表达;而 穿梭质粒载体上的氨苄青霉素和氯霉素抗性为筛选提供了便利。
[0043] 实施例3 本实施例主要介绍将实施例2中所构建的重组表达穿梭质粒载体转化、表达，并进行普 鲁兰酶表达量和酶活测定的相关实验过程，详述如下。
[0044] 第一，将实施例2中所构建的4种重组表达穿梭质粒载体分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，转化过程参考实施例1中"(四）重组质粒的转化"相关操作，不再重述。
[0045] 第二，对第一步中的阳性克隆菌株培养，并进行蛋白的诱导表达，具体过程如下： 吸取2mL的转化子菌液接种至lj200mL的液体LB中，37°C、220rpm振荡培养2~3h(0D 6Q()大约 0.6)，然后加入IPTG使终浓度为0.6