、MgS04 · 7H20 0· 5g、CaC120. 2g、KH2P041. 0g、FeS04 · 7H20 0· 02g，pH 值为 7· 0。
[0032] 取4mL已经培养好的菌液，置于2mLtube管中，5000g，10min充分离心。弃去上清， 用180 μ L消化液（Digestion Solution)将菌体重悬，再加入20 μ L蛋白酶K，充分混匀后， 56°C温育30min。加入20 μ L RnaseA，充分混匀后，室温放置10min。加入200 μ L裂解液 (Lysis Solution),快速混匀，过程不要超过15s。加入400 μ L 50% (v/v)乙醇溶液，充分 混匀。将上述溶液转移至吸附柱中，静置lmin，离心6000g，lmin，弃废液，将吸附柱转移至 一个新的2mL tube管中。加入500 μ L wash buffer I，8000g，lmin离心，弃废液。加入 500 μ L wash buffer II，8000g，lmin 离心，弃废液。重复一次。将空吸附柱 12000g，3min 离心，将柱内残留液体充分甩干。在吸附柱基质膜中间位置加入200yL洗脱液（Elution Buffer)静置lmin, 8000g，lmin离心，即得基因组。
[0033] 实施例2褐藻胶裂解酶Algb编码基因的克隆与鉴定
[0034] 根据与Vibrio alginolyticus40B基因组中可能的褐藻胶裂解酶基因设计如下扩 增引物：上游引物（5'-CGCGGATCCATGCGCTCAGAAGTTCGTGA-3，）和下游引物（5'-CCGCTCGAG TTGATGAAGAGTGCTCAAAG-3'）。以提取的菌株基因组为模板，进行PCR扩增得到褐藻胶裂解酶 Algb基因全长序列。PCR条件为：94°C预变性3min，随后以94°C 30s、55°C 30s、72°C 2min 进行30个循环，最后在72°C延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示在1. Okb和2. Okb之间有一 条特异性条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，采用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。
[0035] 将纯化的DNA片段连接到克隆载体pMD19-T上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞 中，在LB固体培养基（含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG)中培养后，挑取白色菌落使用扩增 引物进行PCR验证。PCR条件为94°C预变性3min，随后以94°C 30s、55°C 30s、72°C 2min进 行30个循环，最后在72°C延伸lOmin。将出现特异性条带所对应的重组菌株大量培养，使用 质粒提取试剂盒进行质粒抽提，进行测序分析。结果表明褐藻胶裂解酶基因的全核苷酸序 列全长1437bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；编码478个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，蛋白理论分子量为54. 12kDa。用PHYRE2同源建模服务器对褐藻胶裂解酶Algb 的蛋白质三维结构进行同源建模。最终得到的Algb的蛋白质三维结构模型如图1所示。
[0036] 序列表
[0037] SEQ ID NO. 1
[0038] Algb编码基因开放阅读框（0RF)全长1437bp，编码褐藻胶裂解酶成熟酶序列，不 含有信号肽序列。
[0039] ATGCGCTCAGAAGTTCGTGAGCGAGAAAACTTCAACATTTCAGAACAAGGCGTCTCTAGAACTTTGTAT GCAGATGTTCG
[0040] ATTACCAGAGATTAACCTTGCAATGGCTAGCTCCCCTGCAAACCATGATGAAGTCACTTTCCTGCAAAT TCATAACAAAG
[0041] GCACAGATACTTCTGGTACAGGTGCTATCCCACACCCTTTGTTACGAATCGTTTGGGAACAAGAACGAA ACAGTATCACT
[0042] GGTCATTACTGGGCGGTAGTAAAGAACAATGCCATAGATTGCAGTCTACCTTCTAGCGCATCAGATTGT TATGCAACATC
[0043] ATACGATCGTTATGATTTAGGAAAAGCCGATCTCAACGCATTCACGCGATTCGAAGTAAAAATCGGAGA AAACACATTAA
[0044] CCATTAAAGTGAACGATGAGCAAAAGGTAAATGTAGATGTATCCTACTGGCAGCACCTCCTGAGCTACT TTAAAGCCGGA
[0045] GTTTATAACCAGTTTGAAAACGGTGAAGCAAAGGTACAATTTAATCAGTTAGGACTAACCAAAACTGAC CATACTGATTC
[0046] AATAGCCTGGAATATTGACGATTGGAAATTAACCATTCCTGCAAGCAAAAATGATTGGTATGGTTTTGG CGGTGACAGCG
[0047] CGGCTGAATTAGAGCCTGAGCGTTGTAATTCAAGTAAAGATCTTCTGTCTAACGAAGAGAGCGTTTACC AACGCGAGATT
[0048] GATTTATCATACTTCAATGTTATTGACGGTAGCATGCATTTCCGCGCCGATATGGGTTACGGCACGTCA ACGGCCAACTC
[0049] CAGTTACATCCGTTCAGAATTGCGAGAGCTCTACATCAGTACTAACTCCCCGGATTGCAGCACCAGCGA TGAAGAGACAA
[0050] GTTGGTATATTGAAGATAGTCGTACCGGTGCAACTTCGCATACGCTAAACGCAACACTAAGAATTAACG AATACCCTAAA
[0051] ATCGACGGTCAATTACCAAAAGTCGTGGTAGGCCAGATACATGGTTGGAAAATCAGCCAAGCACTCGTG AAGCTACTTTG
[0052] GGAAGGTGACAATAAGCCAGTCAGAGTTATTCTGAACGATAACTACAAACTTGATAACAACAAAGACTG TACTGATTGCA
[0053] ACGCATTCAGCGTTAAGCTTGGTACCTACGCGGTAAACGAAGACTGGCAATATACGATCCGTGCCGATA AGGAAGGACTG
[0054] TTTTTAGCCTCCTACGATGCAGATGGCAGTAATATGGTCTCGCACACACTGAAGTGGGGAGAAGCATAC TCAGACACCGC
[0055] TAACAACAAGTCCTATACTCTGACTGAAAGATGGGCGTCGCCTGATATTGCGTTTTACTTCAAAGCCGG AATTTACCCTC
[0056] AGTTTAAACCTGATAATGCATATCGAGGAGAAATCTTTGATGTGAGCTTTAGTGCTTTGAGCACTCTTC ATCAATAG
[0057] SEQ ID NO. 2
[0058] 褐藻胶裂解酶Algb结构中包含两个褐藻胶裂解酶家族2 (Alginate Lyase2fami ly)结构域。
[0059] MRSEVRERENFNISEQGVSRTLYADVRLPEINLAMASSPANHDEVTFLQIHNKGTDTSGTGAIPHPLLR IVWEQERNSIT
[0060] GHYWAVVKNNAIDCSLPSSASDCYATSYDRYDLGKADLNAFTRFEVKIGENTLTIKVNDEQKVNVDVSY WQHLLSYFKAG
[0061] VYNQFENGEAKVQFNQLGLTKTDHTDSIAWNIDDWKLTIPASKNDWYGFG⑶SAAELEPERCNSSKDLL SNEESVYQREI
[0062] DLSYFNVIDGSMHFRADMGYGTSTANSSYIRSELRELYISTNSPDCSTSDEETSWYIEDSRTGATSHTL NATLRINEYPK
[0063] IDGQLPKVWGQIHGWKISQALVKLLWE ⑶ NKPVRVILNDNYKLDNNKDCTDCNAFSVKLGTYAVNEDW QYTIRADKEGL
[0064] FLASYDADGSNMVSHTLKWGEAYSDTANNKSYTLTERWASPDIAFYFKAGIYPQFKPDNAYRGEIFDVS FSALSTLHQ
[0065] 实施例3褐藻胶裂解酶Algb重组表达载体构建
[0066] 根据褐藻胶裂解酶基因全序列设计上游引物（5' -CGCGGATCCATGCGCTCAGAAGTTCG TGA-3'）和下游引物（5' -CCGCTCGAGTTGATGAAGAGTGCTCAAAG-3'），进行 PCR 扩增得到褐藻 胶裂解酶Algb基因全长序列。PCR条件为：94°C预变性3min，随后以94°C 30s、55°C 30s、 72°C 2min进行30个循环，最后在72°C延伸lOmin。PCR产物用Bam HI和Xho I进行酶切 后回收；将大肠杆菌表达载体p