与实验值基本一致；
[0023]
[0024] 实施例2:化合物(I)药理作用试验 [00巧]一、材料和仪器
[0026] SD雄性大鼠（4周龄)购于河北医科大学动物实验中屯、，清洁级，体重150g。化合物 (I)自制，册LC归一化纯度大于98%。1〇,25(0恥〇3购于英国普利茅斯生物研究实验室。口-MEM培养基购于美国GIBCOB化。Soluble RANKL购于英国化protec Science。抗酒石酸酸性 憐酸酶(TRAP)试剂盒购于美国Sigma公司。葡聚糖凝胶购于上海如吉科技发展有限公司。标 准胎牛血清购于山东银香伟业生物有限公司。注射用青霉素钢购于华北制药有限公司。注 射用硫酸链霉素购于深圳华药南方制药有限公司。丙酬、甲醒溶液购于石家庄市有机化工 厂。异氣烧购于鲁南贝特制药有限公司。二甲基亚讽购于天津市光复精细化工研究所。
[0027] BB5060/BB16二氧化碳培养箱(上海化raeus公司），VD-650型桌上式细胞培养超净 操作台（苏州净化设备有限公司），BFX5-320型低速离屯、机（中国上海沪南科学仪器联营 厂），XD-1019810倒置显微镜(江南公司），CX-21光学显微镜（日本OLYMPUS )，微量加样器(法 国GILSON) ,2510型变频振荡仪(上海新波生物技术有限公司），GF-300型电子天(化pan A&D Company，limited)，725型超低溫冰箱化orma Scientif ic. Inc)。未提到的材料和仪器均为 常规仪器。未提到的溶液配制均采用本领域常规溶液配制方法配制即可。
[0028] 药液配制及葡聚糖凝胶柱的制备：
[0029] 1、a-MEM培养液的制备：
[0030] (1 )a-MEM粉一袋+超纯水SOOmL，完全溶解；
[0031 ] (2)加碳酸氨钢3.0?待完全溶解后加盐酸测PH达7.2;
[0032] (3)再次加超纯净水至1000 mL
[0033] (4)加抗生素(青霉素及链霉素）；
[0034] (5)滤过灭菌(0.22微米微孔滤膜过滤）
[00巧](6)500mL灭菌瓶分装，4。(：储藏备用。
[0036] 2Ja，25(0H)2D3 储存液的分装
[0037] (1)取la, 25(0H)2化原液50微升（50微升一支），加入无水乙醇1150微升，使总量至 1200微升（即24倍稀释）
[0038] (2) WlOO微升/只分装于12支灭菌试管内，-30°C冰箱内储存备用；
[0039] (3)应用前再次稀释1000倍，使最终浓度为IX 1(T8M。
[0040] 3、Soluble RANKL储存液分装
[0041] (1)取RANKL冻干粉一支(10微克）；
[0042] (2)0.11 tris-肥 1 buffer 50微升溶解RANKL
[0043] (3) W5微升/只分装于10支灭菌冷冻管内，-30°C冰箱内储存备用；
[0044] (4)使用前取出一支，先用含10%FBSa-MEM培养液495微升溶解（即稀释100倍）；添 加前再次稀释100倍，使终浓度为20ng/mL。
[0045] 4、0.1 M tris-肥 1 buffer的制备
[0046] (l)tris-HCl 12.llg(0.IM)；
[0047] (2)超纯水SOOmL(添加溶解后，调节抑至8.2);
[004引 （3)加超纯水至1000 mL备用。
[0049] 5、化合物(I)储存液的制备
[0050] (1)储存液的浓度：Img/mL及lOOug/mL。
[0051] (2)储存液的配制：称取化合物（I)Img放于灭菌冷冻管内，加入二甲基亚讽ImL完 全溶解，配成Img/mL的储存液。从Img/mL的储存液中取出100微升放于另一支灭菌冷冻管 内，加入二甲基亚讽900微升即配成100微克/毫升的储存液，储存于4°C恒溫冰箱，使用时间 不超过两周。Img/mL的储存液冷冻保存。
[0化2] 6、TRAP固定液的制备
[0053]在染色之前，按产品说明书配制。首先取无菌20ml试管一支，按W下顺序依次加入 试剂:丙酬6.5mL、构祿酸2.5mL、甲醒0. SmL，充分混匀，计9. SmL，现配现用。
[0化4] 7、TRAP染色液的制备
[0055] 同样是在染色之前配制，按产品说明制备，现配现用。
[0056] 8、葡聚糖凝胶柱的制备
[0057] (1)消毒后50ml注射器一个，除去内忍；
[0058] (2)注射筒与注射头交接处置消毒后的脱脂棉球一个；
[0059] (3)固定架固定针筒，针头处接关闭状的S通；
[0060] (4)将灭菌的葡聚糖凝胶混匀，抽取30mL注入针筒内，打开S通，缓慢过滤沉淀，待 凝胶沉淀液面至15mL时为止;关闭=通，放入4°C恒溫冰箱过夜；
[0061 ] (5)实验前1小时用含有15 %胎牛血清的a-iffiM培养液50mL缓慢注入凝胶柱内，打 开=通，自然过滤洗涂凝胶柱后待用。
[0062] 二、试验方法
[0063] 1、全骨髓细胞培养
[0064] 1.1全骨髓细胞提取
[0065] 实验开始前30分钟将标准胎牛血清放入37 °C水浴箱内解冻;取50mL无菌离屯、管一 个，装入40mL不含胎牛血清的a-MEM培养液，W备冲洗全骨髓细胞用。
[0066] (1)选4周龄SD雄性大鼠1只，75%乙醇消毒后，采用异氣烧吸入麻醉；（2)待麻醉起 效后，无菌条件下取大鼠两侧腔骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔；（3)用IOmL注射器抽取 不含血清的曰-MEM培养液，换用25号针头后自骨髓腔内冲出骨髓细胞至50mL无菌离屯、管内； (4)将所提取的细胞悬液充分吹打，待没有团块后，将盛有细胞的离屯、管与平衡管一起放入 离屯、机内离屯、，调整转速(2000转/分），离屯、5分钟；离屯、过程中配制含有15%胎牛血清的a-MEM培养液50mL(7.5血胎牛血清加入42. SmLa-MEM培养液中）备用；（5)离屯、结束后弃去上清 液，加入含15 %胎牛血清的a-MEM培养液20mL，充分吹打混匀，形成细胞悬液，此液简称为细 胞原液。
[0067] 1.2细胞数的计算(原液浓度及稀释倍数）
[0068] (1)取W上提取的细胞悬液25化放入试管内，然后加入5%醋酸47扣L，即形成20倍 稀释的细胞悬液;将试管放在振荡器上，振荡20秒钟，目的是去除红细胞；（2)计算细胞数： 取振荡后细胞悬液滴入细胞计数盘，勿超过边缘，盖玻片覆盖，倒置显微镜下计算细胞数， 计数盘4个大格内所有细胞均计入。本实验计算细胞数为537个，根据公式(细胞数/4) X20 X IO4Cel Is/mL推算细胞原液的浓度，本实验计算如下（537/4) X 20 X IO4 = 26.85 X IO6CellsAiL即本实验细胞原液浓度为26.85 XlO6CellsAiL,而我们需要的目的浓度是2 X 106cells/mL，所W细胞原液需要稀释。（3)稀释倍数计算如下:稀释倍数二原液浓度/目的 浓度;本实验稀释倍数=26.85 X l〇6cells/mL/2 X l〇6cells/mL= 13.425，即原液需要稀释 13.425倍才能达到需要的目的浓度。本实验需要2X IO6CellsAiL的细胞悬液40mL，简称为 目的量。（4)达到目的浓度所需原液的量，计算如下:达到目的浓度所需原液的量=目的量/ 稀释倍数。本实验计算如下：达到目的浓度所需原液的量= 40mL/13.425 ^2.98mL。即取 26.85 X IO6CelIs/mL的细胞原液2.98mL放入灭菌的50mL离屯、管内，然后加入37.02血(40-2.98)含15%胎牛血清的a-MEM培养液即可配成2 X IO6CellsAiL的细胞悬液40mL，然后加入 Ia，25(OH)2〇3储存液40化，操作过程应避光，即Ia，25(0H)2D3终浓度为1 X IQ-8M;再加入4化 soluble RANKL储存液，即soluble RANKL终浓度为20ng/mL加液过程在超净工作台上操 作，至此，所需2 X IO6Cel I s/mL的细胞悬液目的量配置完成。
[0069] 1.3培养细胞、加药
[0070] (1)细胞接种：取4行6列24孔培养板一块，每孔加入2 X IO6CellsAiL的细胞悬液 0. SmL(IXlO6Cells)。（2)加入化合物（I):取lOOiig/mL化合物（I)分装液一支于培养板的第 2列分别加入2.扣L，每加一孔均需换一个吸头;第3列每孔加入扣L第4列每孔加入10化。加 完第4孔后，将此液放入4°C恒溫冰箱保存，取Img/mL化合物(I)储存液一支。第5列每孔加入 Img/mL化合物（I)储存液2. 第6列每孔加入化L。加完后剩余药液放入4°C恒溫冰箱保 存。第一列不加药物，作为对照组。至此在24孔培养板中化合物（I)每行都有6个浓度，分别 为0、0.5、1、2、5、10蛇/血，每个浓度每列4孔(11 = 4)，第一列为对照组。（3)培养细胞:加完药 后，将培养板放入C〇2培养箱内，在37°C、5 %C〇2及饱和湿度条件下，培养7天。培养至第4天时 换培养液一次，按上述方法配制含有15%胎牛血清的a-iffiM培养液40m(16mL胎牛血清加入 34mLa-M