等(通过用依照本发明的核酸分子转化），种植并栽培。 实施例
[0128] 包括W下实施例W例示本发明的实施方案。本领域技术人员应当领会，实施例中 公开的技术代表发明人发现的在实施本发明中运行良好的技术。然而，根据本公开内容，本 领域技术人员应当领会可W在不偏离本发明范围的前提下对公开的具体实施方案做出许 多变化，并且仍获得相似或类似的结果。更具体地，会显而易见的是，可W用化学和生理学 相关的某些药剂替换本文中描述的药剂，同时会实现相同或类似的结果。本领域技术人员 显而易见的所有此类相似替代和修改视为在本发明的范围内，如所附权利要求书限定的。
[0129] 实施例1:载体构建
[0130] 合成两种不同化P，其由Ikbp 5'同源性区（pDAB100610/pDAB100640中的"工程化 降落场区r(SEQ ID ^:11)和口048100611/口048100641中的"工程化合成同源性区3"(569 ID N0:12))和Ikbp 3'同源性区（pDABlOOeiO中的"工程化降落场区2"(SEQ ID N0:13)和 口0八8100611/口048100641中的"工程化合成同源性区4"(569 10^:14))组成。运些同源性 区W两种不同EXZACT锋指核酸酶(eZFN)结合位点分开。
[01別]使用G ATEWAY彩LR克隆酶反应（Invitrogen，Carlsbad，CA)将分别用于 pDAB100610和pDAB100611的两种化P(称作ELPl(沈QIDN0:15)和ELP2(SEQIDN0:16))转 移到pDAB100704，即一种源自pSBl 1的目的超二元载体（destination s叩erbinary vector) (W094/00977和W095/06722)中。PDAB100704含有ZmUbil启动子（源自玉蜀泰（Zea mays)泛素1启动子的启动子、5'非翻译区（UTR)和内含子（畑ristensen等，（1992)Plant Molecular Biology , 18(4); 675-89))、AAD-1选择标志基因（即一种来自 Sphingobium herbicidovorans(ATCC饭700291)的芳氧基链烧酸醋（airlo巧alkanoate)加双氧酶基因 的合成的经植物优化的型式，所述芳氧基链烧酸醋加双氧酶基因编码具有赋予对芳氧基苯 氧基丙酸醋除草剂的抗性的al曲a酬戊二酸依赖性加双氧酶活性的酶(wo 2005/107437、W0 2008/141154A2和US 2009/0093366,通过述及将每篇并入本文）、和ZmLip 3'UTR(包含玉蜀 泰LIP基因的转录终止子和多腺巧酸化位点的3'非翻译区化TR) ;GenBank登录号L35913)。
[0132] 使用GATEWAY饭LR克隆酶反应（Invi trogen，Car 1 sbad，CA)将分别用于 口0八8100640和9048100641的两种化？（分别称作化？1(569 10^:15)和化？2(569 10顯： 16))转移到PDAB101849,即一种二元载体中。PDAB101849含有OsActl启动子(源自稻肌动蛋 白启动子的启动子和内含子（美国专利No. 5641876 ))、pat选择标志基因（草胺麟 (phosphinothricin)乙酷基转移酶基因；Wohlleben等，（1988)Gene 70: 25-37)、和ZmLip 3'UTR(包含玉蜀泰LIP基因的转录终止子和多腺巧酸化位点的3'非翻译区（UTR);GenBank 登录号L35913)。
[0133] 将所得的克隆pDAB100610(图 1)、pDAB100611 (图2)、pDAB100640(图3)和 pDAB100641(图4)进行序列证实。将PDAB100610和PDAB100611载体转移到含有pSBl二元载 体的根癌上壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404中，并经由同源重组将T链 区整合入pSBl中。将PDAB100640和PDAB100641载体转移到根癌±壤杆菌菌株LBA4404中。通 过限制酶消化确认每种质粒的结构。
[0134] 通过在化P1和化P2的5'和3'同源性区的截短型式(称为型式2(v2))间插入YFP表 达盒和PAT或AAD-1表达盒装配含有感兴趣的核酸分子(供体DNA)的载体。PAT表达盒含有用 于表达pat基因（草胺麟乙酷基转移酶基因；Wohlleben等，（1988)Gene 70:25-37)的OsActl 启动子(稻肌动蛋白1启动子;1〇6^〇7等，（1990化1曰11*06112:163-171)及其侧翼的2111^口 3'非翻译区。AAD-1表达盒含有驱动aad-1基因的Zm邮i 1启动子和ZmPer 53'UTR(美国专利 No. US 6384207)。YFP表达盒由用于驱动化iYFP基因（黄色巧光蛋白（美国专利申请US2007/ 0298412))表达的ZmUbil启动子及其侧翼的Zm化巧3'UTR(美国专利No.US 6384207)组成。
[0135] 将PAT和YFP表达盒在化P1中的"工程化降落场区Γ和"工程化降落场区2"的截短 型式间克隆（pDAB 105955，图5)。或者，将PAT和YFP表达盒在化P2中的"工程化同源区3"和 "工程化同源区4"的截短型式间克隆（PDAB105956,图6)。同样地，将AAD-1和YFP表达盒在 ELP1中在"工程化降落场区Γ的截短型式和"工程化降落场区2"的截短型式间克隆 (PDAB105979,图7)。或者，将AAD-巧日YFP表达盒在化P2中在"工程化同源区3"的截短型式和 "工程化同源区4"的截短型式间克隆(PDAB105980,图8)。将供体DNA构建体克隆入二元载体 中W进行生物射弹、晶须(WHISK邸5)或±壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化。另外，可 W将DNA构建体克隆入高拷贝数质粒(例如携带Co化1复制起点的PBR322衍生物）中W生成 用于直接DNA投递转化的质粒DNA。
[0136] 实施例2:晶须介导的DNA投递
[0137] 生成玉米的胚胎发生化-Π 细胞培养物，如记载于美国专利No. 7，179，902的，并用 作例示祀向性整合的活植物细胞的来源。
[0138] 使用含有AAD-1植物选择标志盒和分别来自PDAB100610和PDAB100611的化P1和 化P2的片段和含有PAT植物选择标志盒和分别来自PDAB100640和PDAB100641的化P1和化P2 的片段来生成转基因事件。分离并表征转基因事件。然后，使用同源性指导的同源重组祀向 运些事件，其中感兴趣的核酸分子可W在工程化降落场内整合。
[0139] 将加上28mL条件化培养基的12mL压紧细胞体积(packed cell volume,PCV)的来 自先前冷冻保存的细胞系传代培养入500mL锥形瓶中的80mL GN6液体培养基(N6培养基 (Chu等，α975)SciSin.l8:659-668)、2.0mg/L2,4-D、30g/L薦糖，pH5.8)中，并在摇动器 上于28°CW12虹pm放置。使用相同细胞系将此步骤重复两次，使得将总共36mL PCV在Ξ个 烧瓶间分配。在24小时后，将GN6液体培养基除去，并用72mL GN6 S/M渗透培养基(N6培养 基、2. Omg/L 2，4-D、30g/L薦糖、45.5g/L山梨糖醇、45.5g/L甘露醇、lOOmg/L肌肉肌醇，pH 6.0)替换。将烧瓶在黑暗中于28 °C W中等揽动（125巧m)的情况中溫育30-35分钟。在溫育期 期间，通过将8. ImL GN6 S/M液体培养基添加至405mg无菌碳化娃晶须来制备50mg/mL碳化 娃晶须（Advanced Composite Materials,UX,Greer,SC)悬浮液。
[0140] 在GN6 S/M渗透培养基中溫育后，将每个烧瓶的内容物合并入250mL离屯、瓶中。在 烧瓶中的所有细胞沉积至底部后，将超过约14mL的内容物体积的GN6 S/M液体抽取，并在无 菌1-L烧瓶中收集，供未来使用。将晶须的预先湿润的悬浮液在满旋上W最大速度混合60 秒，然后添加至离屯、管。
[0141] 将17化g来自PDAB100610或PDAB100611质粒DNA的纯化片段添加至每瓶。一旦添加 DNA，立即将瓶在改良的Red Devil 5400商业涂料混合机（Red Devil Equipment Co., Plymouth，MN)中放置，并揽动10秒。在揽动后，将细胞、培养基、晶须和DNA的混合物与125mL 新鲜的GN6液体培养基一起添加至1-L烧瓶内容物W减少渗压剂(osmoticant)。容许细胞在 设置于12虹pm的摇动器上恢复2小时。使用与房屋真空线连接的玻璃细胞收集器单元将6毫 升分散的悬浮液过滤到Whatman#4滤纸(5.5cm)上，使得每瓶获得60升。将滤纸放到GN6固体 培养基(与GN6液体培养基相同，除了具有2.5g/L Gelrite胶凝剂)的60x 20mm板上，并于28 °C在黑暗条件下培养1周。
[0142] 实施例3:推定的转基因事件的鉴定和分离
[0143] DNA投递后一周，将滤纸转移到含有合适的选择剂的GN6(1H)选择培养基(N6培养 基、2.0mg/L2,4-D、30g/L薦糖、100mg/L肌肉肌醇、2.5g/LGelrite，pH5.8)的60x20mm板。 将运些选择板于28°C在黑暗中溫育1周。在黑暗中选择1周后，通过将1/2的细胞从每块板刮 到含有于37-38°C保持的3. OmL GN6琼脂糖培养基(N6培养基、2. Omg/L 2，4-D、30g/L薦糖、 lOOmg/L肌肉肌醇、7g/L SEAPLAQUE⑩琼脂糖，pH 5.8，于m°C高压灭菌10分钟）的管 中将组织包埋到新鲜培养基上。
[0144] 用刮刀打碎琼脂糖/组织混合物，随后，将3血琼脂糖/组织培养物均匀地倒入含有 GN6(1H)培养基的lOOx 15mm培养皿的表面上。对每块板的两半都重复此过程。一旦将所有 组织包埋，将板单独用NESCOFILM⑩或MRAFILM⑥Μ密封，并于28°C在黑暗条件下 培养多至10周。将在运些选择条件下生长的推定的转化隔离群自包埋板取出，并转移到60x 20mm板中的新鲜选择培养基。若持续生长在约2周后是明显的，则将事件视为对应用的除草 剂(选择剂)有抗性，并且随后收获细胞的等分试样W进行基因型分析。
[0145] 实施例4:事件的分子表征
[0146] 基因组DNA提取。
[0147] 将基因组DNA(神NA)自分离的玉米细胞分离，并作为模板用于PCR基因型分型实 验。自约100-30化1压紧细胞体积(PCV)的依照DNEASY⑧96植物试剂盒(QIAGEN Inc.， 化1 enc i a，CA)中详述的制造商的方案分离的化-Π 愈伤组织提取曲ΝΑ。将基因组DNA在10化 1试剂盒供应的稀释缓冲液中稀释，产生20-200ngAiL的终浓度，随后经由基于PCR的基因型 分型方法分析。
[014引拷贝数的分子分析。
[0149] 使用LIGHTCYCLER480瑕系统（Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 通过实时PCR实施通过与TAQMAN?测定法类似的水解探针测定法的转基因拷贝数测 定。使用LIGHTCYCLE艮饭探针巧计软件2.0对AAD-1和PAT基因和内部参照基因设计测 定法。对干扩增，将LIGHTCYCLE民殺,480探针Master混合物（Roche A卵lied Science， Indianapolis，IN) W lx终浓度在含有0.4μΜ每种引物和0.2μΜ每种探针的10化体积多重反 应中制备。在巧光采集的情况中实施两步扩增反应，其中于58°C延伸38秒。将所有样品一式 Ξ份运行，并使用平均循环阔值(ct)数值来分析每份样品。使用LightCycter⑥软件第1.5 版使用相对定量模块实施对实时PCR数据的分析，并且其基于Δ Δ ct方法。对于运点，来自 单拷贝校准物和已知的2个拷贝检验(check)的基因组DNA的样品包含在每次运行（与用于 上述Invade巧测定法的那些运行相同）中。然后，通过此数据，对每份样品评估表观AAD-1 或PAT拷贝数。
[0150] 用于PCR基因型分型的引物设计。
[0151 ] 将寡核巧酸引物在标准脱氧条件下合成（例如，Integrated DNA Technologies, 111(3.((：〇^1乂111日，^))，并用水稀释至10041的浓度。将寡核巧酸引物设计为与0魁插入物 的末端区退火。在存在自非转基因生物体分离的DNA的情况中使用质粒DNA的稀释液测试引 物。使用引物自推定事件的基因组DNA PCR扩增pDAB100610、pDAB100611、pDAB100640和 PDAB100641的插入物。将所得的片段克隆入质粒载体中，并测序W确认工程化降落场在转 化期间完全整合入植物基因组中。
[0152] Southern 印迹分析。
[0153] 实施Southern分析W确认转基因拷贝数。对于此分析，将基因组DNA用合适的限制 酶消化并探查。
[0154] 将通过基因座特异性PCR鉴定为含有推定的化P的玉米组织进行Sothern印迹分 析。对于Southern分析，将组织样品在2ml邱pendorf管中收集，并冻干2天。用Kleco组织粉 碎机和鹤珠化leco，Visalia，CA)实施组织浸溃。在组织浸溃后，使用DNeasy植物迷你试剂 盒(Qiagen, Germantown, MD)依照制造商提示的方案分离基因组DNA。
[01 巧]通过Quant-IT Pico Green DNA测定试剂盒（Molecular Probes, Invihogen, 化r 1 sbad, CA)量化基因组DNA。将量化的DNA调节至化g W进行Southern印迹分析，并使用合 适的限制酶于37°C消化过夜。使用如ick-Precip(Edge BioSystem,Gaithersburg,MD)依照 制造商提示的方案纯化经消化的DNA。将沉淀的DNA在10X染料中重悬，并在0.8%SeaKem LE 琼脂糖凝胶化〇nza，Rockland，ME)上W40伏特进行电泳达17小时。将DM过夜转移到尼龙带 电荷膜（Millipore,Be壯ord,MA)，并使用UV Strata连接仪（linker) 1800(Stratagene,La Jolla,CA)与膜交联。将印迹与20mL PerfectHyb Plus(Sigma,St.Louis,M0)预杂交，并用 合适的放射性标记的探针探查过夜。将印迹清洗，并在憐光体图像屏（phosphor image screen)上放置24小时，然后使用STORMTM 860扫描仪(Molecular Dynamics)分析。
[0156]实施例5:选择具有插入DM的转基因事件
[0157]如上文所描述，通过水解探针测定法和PCR对事件筛选含有AAD-1或PAT基因盒的 完整植物转录单元（PTU)和完整化P。用AAD-1和PAT基因和化P探针使用标准方法通过 Southern分析进一步确认拷贝数。维持来自含有来自PDAB100610和PDAB100611的单拷贝、 完整插入物的选定转基因事件的愈伤组织，随后测试AAD-1基因的表达。使用AAD-lqRT-PCR 法和化ISA(下文)的筛选鉴定出表达AAD-1的事件。
[015引对AAD-1表达事件的qRT-PCR分析。
[0159] 使用定量实时PCR(qRT-PCR)量化AAD-1基因表达的mRNA表达。开发通过相对