s;共24个循环，然后进入步骤4);
[0021] 4)72°C 延伸 lOmin。
[0022] 所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5%。
[0023] 所述插入/缺失多态性为:插入/插入基因型表现为25加 P-条带纹;插入/缺失基 因型表现为24化P和25化P两条带纹;缺失/缺失基因型表现为24化P-条带纹。
[0024] -种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增夏南牛 SPAG17基因中8-bp插入/缺失多态位点的引物对P1。
[0025] 上述黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法在夏南牛分子标记辅助选择育种中的 应用。
[0026] 所述插入/缺失多态位点的插入/缺失（ID)基因型可作为夏南牛体斜长和体高指 数的DNA标记。
[0027]本发明的有益效果体现在：
[002引本发明根据SPAG17基因的序列设计引物，分别W3种黄牛品种的基因组DNA为模 板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后获得黄牛的SPAG17基因的插 入/缺失多态性(AC_000160:gl46755-146756insTCCTGACT的插入/缺失多态性）。
[0029] 本发明对3个黄牛品种的插入/缺失多态性位点基因型进行了检测和基因频率分 析，对上述插入/缺失多态性位点与黄牛部分生长性状(如体高、体斜长)进行关联分析，结 果表明该位点能够作为提高夏南牛体高(P = 〇.038)和体斜长(P = 0.041)的分子标记。
[0030] 结合W上实验结果，本发明提供了针对该插入/缺失多态性位点的检测方法，通过 设计的引物经PCR扩增后再经琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确的检测其 插入/缺失的多态性，从而为黄牛良种选育提供依据，有利于快速建立生长发育性状优良的 黄牛遗传资源群体，加快良种选育速度。
【附图说明】
[0031] 图 1 为黄牛 SPAG17 基因扩增在 AC_000160: gl46755-146756insTCCTGACT 位点的 8- bp插入/缺失（inde 1)多态位点的PCR产物电泳结果，包含DD W及II基因型的结果，Μ为 Marker 1〇
【具体实施方式】
[0032] 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限 定。
[00削本发明利用PCR扩增方法对黄牛SPAG17基因在AC_000160 : gl46755- 146756insTCCTGACT位点突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与生长性状进 行关联分析，验证其是否可W作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选 育速度。
[0034](一)实验药品与试剂
[00对 1.生化试剂与生物学试剂:①化qDNA聚合酶(购自化rmantas即MBI公司）；②;蛋白 酶K(购自华美生物工程公司)③;Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司）。
[0036] 2 .普通试剂:普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：Tris、抓TA、 NaCl、化細、雌1、船2册〇4、皿2?〇4、化13饱和酪、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钢、十二烷基横 酸钢(SDS)、漠化乙锭化B)、漠酪蓝、二甲基苯氯FF、乙酸、薦糖、棚酸、琼脂糖等。
[0037] 3.溶液与缓冲液:所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为 1化f/in(1.034X 105Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指 南》。
[0038] 1)提取组织样DNA所用溶液：除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制W下试 剂：①2mol/L化C1:11.688g溶于水，定容至lOOmL，高压灭菌。②组织DNA提取液（lOOmL): Imol/L Tris-Cl(pH 8.0)1 mL，0.5mol/L EDTA(抑 8.0)20mL，2mol/L 化C1 5mL，定容至 lOOmLo
[0039] 2)琼脂糖电泳分析所用溶液:①1 XT邸缓冲液:取lOXTBE lOOmL定容至lOOOmL。 ②上样缓冲液:0.25%漠酪蓝，0.25%二甲苯青FF，40.0% (w/v)薦糖水溶液。
[0040](二）黄牛 SPAG17 基因在 AC_000160:gl46755-146756insTCCTGACT 位 PCR引物的设 计
[0041 ] 在NCBI上检索牛SPAG17基因的序列，并利用Primer Premier 5.0设计能够扩增包 含牛SPAG17基因第22内含子区域8-bp indel位点的PCR引物对P1，其引物序列如下：
[0042] 上游引物:5' -ACATGGGAGAAATACCCG-3' ；
[0043] 下游引物：5 ' -GTCTGAAGATGGCAAACG-3 ' ；
[0044] 上述引物对P1对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛SPAG17基因在AC_000160: gl46755-146756insTCCTGACT位点的indel的不同的基因型片段。理论上，当146755与 146756nt之间的TCCTGACT缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是247bp大小的一条 带纹；146755与146756nt之间的TCCTGACT插入时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是 255bp大小的一条带纹。146755与146756nt之间的TCCTGACT插入/缺失时，PCR产物经琼脂糖 凝胶电泳检测之后是247bp+25化P两条带纹。为此，根据理论分析结果，插入/插入（II)基因 型表现为25加 P-条带纹;插入/缺失（ID)基因型表现为247bp+25化P两条带纹;缺失/缺失 (DD)基因型表现为24化P-条带纹。
[0045] (;似引物对P1进行PCR扩增待测黄牛的SPAG17基因片段
[0046] 1、黄牛样本的采集
[0047] 实验所用的动物为3个品种黄牛共计629个样本，其中：
[0048] 1)秦川牛(QC)样品252份采自陕西省扶风县秦川牛保种场。采用随机采样方式采 取个体耳组织样品，运些样品为70%乙醇保存，冰盒低溫带回实验室后置于-80°C冻存。
[0049] 2)晋南牛(JN)样品共186份，采自陕西省运城县保种场。采用随机采样方式采取牛 场个体的耳组织样品，运些样品为70%乙醇保存，冰盒低溫带回实验室后置于-80°C冻存。
[0050] 3)夏南牛(XN)样品共191份，采自河南省泌阳畜牧局夏南牛保种场。采用随机采样 方式采取牛场个体的耳组织样品，运些样品为70%乙醇保存，冰盒低溫带回实验室后置于- 80°C冻存。
[0051] 表1黄牛样本的采集
[0化2]
[0化3] 2、组织样品DNA的提取与分离
[0054] 1)取约1 Omg耳组织样，放于1.5mL的离屯、管中，用小剪刀尽量剪碎。
[0化日]2)加入60化L组织提取液，10%SDS至终浓度为1 %，蛋白酶K至终浓度为10化g/mL， 55.0°C消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中。
[0056] 3)将溶液冷却至室溫，加入等体积的Tris饱和酪，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离屯、 管，至少持续 lOminW上，1200〇1'/111；[]1离屯、15111；[]1。
[0057] 4)取上清液，加入等体积的酪:氯仿（1:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离屯、管，至 少持续 lOminW上，120001·/min 离屯、15min。
[0058] 5)取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离屯、 管，至少持续 lOminW上，1200〇1'/111；[]1离屯、15111；[]1。
[0059] 6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钢，盖紧管 盖，缓慢地来回颠倒离屯、管，直至液体清亮，出现白色絮状DNA。
[0060] 7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离屯、管中，加入500μΙ 70 %乙醇，盖紧管盖，缓慢地 来回颠倒离屯、管，然后120(K)r/min离屯、3~5min，小屯、倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。
[0061] 8)再一次向离屯、管中加入50化1 70%乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离屯、管，然 后120(K)r/min离屯、3~5min，小屯、倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。
[0062] 9)待干燥后，加入eOiiL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4°C保存过夜，待检测。
[0063] 3、琼脂糖凝胶电泳检测DNA
[0064] 1)将凝胶电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。
[0065] 2)称取0.2?的琼脂糖，转入Ξ角瓶中，加入1XTBE 30mL使其悬浮，微波炉中火加 热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.化g/mL的EB。然后快速将琼脂糖 溶液导入，轻微摇动，防止出现气泡。
[0066] 3)混匀后（约60°C)，立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，立即用移液器移 出。
[0067] 4)完全冷却凝固（约25~40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳 槽中。
[006引5)向电泳槽中加入1 XT邸缓冲液，使液面高出胶面2~5mm。
[0069] 6)取DNA样品2~化L，加化L上样缓冲液后混匀，统一上样(注意枪头的顺序应前后 对应），并将DNA Marker加在一边。
[0070] 7)80V电压电泳化。
[0071] 8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新 提取相应样品的DNA。
[0072] 4、DNA 的纯化
[0073] 1) 500化的DNA溶液中加入10 % SDS使其终浓度为0.1 %，加入蛋白酶