K至终浓度达 至 lJ100yg/mL。
[0074] 2)55°C 保溫 lOh 左右。
[0075] 3)等体积苯酪:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次。
[0076] 4)1200化/min离屯、5min分相，吸取上层水相至另一离屯、管中。
[0077] 5)加入1/10体积3mol/L醋酸钢和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。
[007引 6)倒掉液体，70 %乙醇洗涂后凉干，加入eOliL灭菌超纯水溶解，4 °C待检测。
[00巧]5、分光光度法检测DNA
[0080] 用紫外光光度计测定DNA样品在260皿、280皿处的0D值。计算DNA含量和0〇26日/0化80 的比值。如OD260/OD280比值小于1.6,说明样品中含有较多的蛋白质或酪，则应进行纯化;若 比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
[0081 ] DM浓度(ng/yL) =50 X0D26日值X稀释倍数
[0082] DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至SOngAiL，存于-20°C备用，其余的存放于-80 Γ。
[0083] 6、PCR 扩增
[0084] PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1 次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入至Ijl个1.5mL离屯、管中，充分 混匀后瞬时离屯、，再分装到每个〇.2mL Eppendo计PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离屯、 后进行PCR扩增;PCR反应体系包括2XTaq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和优 化的反应缓冲液，浓度为2 X ) 12.扣レ上游引物1. 下游引物1.化L(上下游引物浓度为 1化mol/化）；基因组DNA(浓度为SOngAiL黄牛基因组DNA) 1.0化;去离子水9.扣レ共25化体 积的PCR扩增体系。
[0085] 7、PCR反应的程序
[0086] PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性3〇3,68°(：复性3〇3,72°(：延伸2〇3， 18个循环，每个循环中复性溫度降低rC;94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸20s，24个循 环之后，72°C延伸10min，10°C保存扩增产物。
[0087] (四）扩增PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析
[0088] 1)制作3.5%的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳化，电泳结束后邸染色；
[0089] 2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BI0-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统 成像；
[0090] 3)根据琼脂糖凝胶电泳成像分析indel多态性
[0091] 用BI0-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断插入/缺失（indel)的多态 性：
[0092] 黄牛基因组的 SPAG17 基因在 AC_000160:gl46755-146756insTCCTGACT 位点的插 入/缺失（indel)的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为:插入/缺失（ID)基因型表现为247bp和 255bp两条条带，插入/插入(II)基因型表现为25化P-条条带，缺失/缺失(DD)基因型表现 为24化P-条条带，参见图1。
[0093] (五)黄牛SPAG17基因 inde 1位点的频率统计分析
[0094] 1)基因和基因型频率
[00M]基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。Ρττ =Νττ/Ν，其中Ρττ代表某一位点的ΤΤ基因型频率;Νττ表示群体中具有ΤΤ基因型的个体数;Ν为 检测群体的总数量。
[0096] 基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式 可 W 写成：ΡΤ = ( 2NTT+NTal+NTa2+NTa3+NTa4+......+Nxan)/2N
[0097] 式中，Ρτ表示等位基因 Τ频率，Νττ表示群体中具有ΤΤ基因型的个体数量，化ai表示群 体中具有化i基因型个体数量，曰1~an为等位基因 T的η个互不相同的复等位基因。
[009引在不同黄牛品种SPAG17基因8-bp插入/缺失（indel)位点中的等位基因型频率及 等位基因频率如表2所示。夏南牛、秦川牛、晋南牛的等位基因"Γ的频率分别为0.116、 0.022和0.048，相应的等位基因"护的频率为0.884、0.978和0.952，等位基因"Γ和"护的频 率均大于1%，故为稳定存在插入/缺失（indel)类型。
[0099] 表 2 黄牛 SPAG17 基因在 AC_000160:gl46755-146756insTCCTGACT 位点上的 indel 基 因频率分布表
[0100]
[0101] (六)黄牛SPAG17基因 indel位点基因效应的关联分析
[0102] 基因型数据:PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型。
[0103] 生产数据:秦川牛、晋南牛和夏南牛体长、体高、体重等体尺性状数据。
[0104] 关联分析模型:利用SPSS(18.0)软件来分析品种，不同因素与生长形状相关性。首 先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用 方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据 影响体重、体尺生长发育的指标的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作W及基 因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型 如下所示:Y=y+G巧，其中，Y:个体表型记录;U:总体均值;G:标记基因型效应;E:随机误差。
[0105] 结果表明：黄牛SPAG17基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对黄牛某些生 产性状(如体高，体斜长)的影响均有显著差异。
[0106] 由表3可W看出，在对191只夏南牛群体的研究中，SPAG17基因的8-bp插入/缺失 (indel)多态性对夏南牛的体高(P = 0.038)和体斜长(P = 0.041)均有显著影响(P<0.05)。
[0107] 因此，SPAG17基因8-bp插入/缺失（indel)是夏南牛生长发育的插入/缺失（indel) 遗传标记。
[010引表3 SPAG17基因 indel多态性对夏南牛生长性状的影响
[0109]
[0110] 注:生产性状不同的上标(a, b)表示有显著性不同。
【主权项】
1. 一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于:包括以下步骤：以待测夏 南牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增夏南牛SPAG17基因片段，该片段 包含夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点;再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝 胶电泳;根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定夏南牛SPAG17基因8-bp插入/缺失多态性位点的插 入/缺失多态性;所述的引物对P1为： 上游引物:5 ' -ACATGGGAGAAATACCCG-3 ' ； 下游引物:5 ' -GTCTGAAGATGGCAAACG-3 '。2. 根据权利要求1所述一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于:所述 PCR的扩增反应程序为： 1) 94°C预变性5min，然后进入步骤2); 2) 94°C变性30s，复性30s，72°C延伸20s;共18个循环；第一个循环中复性温度为68°C， 剩余每个循环中复性温度较上一个循环降低1°C，然后进入步骤3); 3) 94°C变性3〇8,60°(：复性3〇8,72°(：延伸2〇8;共24个循环，然后进入步骤4); 4) 72°(：延伸1〇11^11。3. 根据权利要求1所述一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于:所述 琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5%。4. 根据权利要求1所述一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法，其特征在于:所述 插入/缺失多态性为：插入/插入基因型表现为255bp-条带纹；插入/缺失基因型表现为 247bp和255bp两条带纹;缺失/缺失基因型表现为247bp-条带纹。5. -种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增夏南牛 SPAG17基因中8-bp插入/缺失多态位点的引物对P1，所述的引物对P1为： 上游引物:5 ' -ACATGGGAGAAATACCCG-3 ' ； 下游引物:5 ' -GTCTGAAGATGGCAAACG-3 '。6. -种如权利要求1所述黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法在夏南牛分子标记辅 助选择育种中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述插入/缺失多态位点的插入/缺失基因 型可作为夏南牛体斜长和体高指数的DNA标记。
【专利摘要】本发明公开了一种黄牛SPAG17基因插入/缺失的检测方法及其应用。以包含SPAG17基因的待测全基因组DNA为模板，以参照牛全基因组设计的引物对P1为引物，通过PCR技术扩增SPAG17基因，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定SPAG17基因在AC_000160:g146755-146756insTCCTGACT位点存在不同的基因型。结果发现，SPAG17基因8-bp插入/缺失的不同类型与夏南牛体高和体斜长等生长发育性状之间存在显著相关，提示SPAG17基因8-bp插入/缺失的不同类型可作为提高夏南牛生长发育性状的DNA标记。故本发明将有利于快速建立生长发育性状优良的黄牛遗传资源群体。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105671175
【申请号】CN201610149819
【发明人】蓝贤勇, 金云云, 陈宏 , 雷初朝, 祁兴磊, 林凤鹏, 祁兴山, 屈卫东
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月16日