用于酶固定化的壳聚糖微球、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及壳聚糖微球制备及应用研究领域，尤其设及一种用于酶固定化的壳聚 糖微球、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素是分布最广泛的、含量最丰富的、可再生的天然有机物质，可W源源不断地 为人类提供能源。但在自然界中，绝大部分纤维素会被各类微生物分解转化，仅有约11 %的 纤维素原料用于农作物产品、饲料、制药、纺织、造纸和建筑等方面，不仅造成资源的巨大浪 费，而且污染环境，危害是相当大的。
[0003] 酶对环境条件要求极为敏感，对酸、碱、热、金属离子、部分有机溶剂等都不稳定。 一般情况下酶是W溶于水的状态作用于底物的，存在反应结束后难W回收利用、生产成本 较高、终产物分离提纯较难等问题。比如，生物质经纤维素酶处理转化为燃料乙醇的过程 中，纤维素酶的价格就占到生产总成本的20%左右，限制了酶在生产中的广泛应用。因此， 游离酶并非工业催化中一种理想的催化剂，还需要对酶进行修饰和处理，W改善其性能。
[0004] 固定化酶（Immobi 1 ized enzyme)是通过物理或化学的方法，将酶结合于水不溶性 大分子载体上，或将酶包埋在其中，使得酶在一定空间内呈闭锁状态，酶分子的流动性降 低，但酶可W充分发挥应有的催化作用，反应结束后酶可与底物、产物分开，并能重复使用。 目前，酶固定化的方法按传统可分为4大类，即吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。
[0005] 作为固定化酶的重要组成部分，载体材料的结构和性能直接影响固定化酶的活 性，所W对载体材料的物理和化学性能有一定的要求，如多孔或疏松的结构、有较大的比表 面积;适当的亲水性、抗化学或微生物侵蚀及良好的稳定性;此外还可通过物理或化学方法 进行改性，使得表面连接必要的反应基团；工业应用时，载体材料应具有一定的机械强度， 可W承受一定强度的揽拌和压缩，同时还应具有无毒、来源广泛、价格低廉等特点。因此，设 计、开发和制备性能较为优越的载体材料已成为近年来固定化酶研究的重点之一。
[0006] 甲壳素是一种仅次于纤维素的来源及其丰富的天然有机化合物，广泛存在于甲壳 纲动物(邮、蟹等）的甲壳、昆虫的甲壳、真菌(酵母、霉菌）的细胞壁W及某些植物的细胞壁 中。壳聚糖(化itosan，简称CTS)是甲壳素的N-脱乙酷基产物，是一种二元线性共聚物，化学 名称是e-2-氨基-2-脱氧-(1，4)-D葡聚糖，相对分子质量在几十万到上百万左右。壳聚糖不 溶于水、碱、稀的硫酸和憐酸，但可溶于部分稀的无机酸（如盐酸）和大多数有机酸（如醋 酸）。壳聚糖有多糖结构和氨基功能基团，具有诸多优点，如吸湿性、通透性、抗菌性、良好的 生物相容性、无毒无害、对环境无污染等，可W作为固定化酶载体。因此，采用壳聚糖改善传 统的固定化方法、开发新型的固定化技术和注重天然高分子载体材料的改性成为了酶固定 化研究的主要趋势。
[0007] 然而，对于壳聚糖作为载体固定化酶的应用，存在着必须离屯、操作，样品不得不稀 释及载体回收损失大等问题。因此，寻求更好的固定化酶载体成为了人们研究的热点。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于酶固定化的壳聚糖微球、其制备方 法及应用，能够提供一种固定化酶的良好载体，并能够制备具有良好的稳定性和重复利用 性的固定化纤维素酶。
[0009] 为了达到上述技术目的，本发明提供一种用于酶固定化的壳聚糖微球的制备方 法，包括：
[0010] (1)在〇.5g壳聚糖粉末中加入质量分数为5%的乙酸溶液，待壳聚糖粉末充分溶解 后，加入液体石蜡，揽拌10分钟；
[0011] (2)将步骤(1)的所得物升溫至50°C，滴加乳化剂SpanSO，乳化10分钟；
[0012] (3化步骤(2)的所得物中加入0.5~2.OmL的甲醒溶液，揽拌反应1.5小时；
[001引（4)将步骤(3)的所得物升溫至70°C，滴加质量分数为10%的化OH溶液，在溶液pH 值保持为碱性条件下，缓慢滴加1.0~2.5mL的环氧氯丙烷，反应5小时；
[0014] (5)将步骤(4)的所得物过滤，用蒸馈水洗涂，再依次用石油酸、无水乙醇洗涂、水 洗涂，直至洗涂液的pH值达到中性；
[0015] (6)将步骤(5)的所得物用Imol/L的盐酸加热处理9小时，接着依次进行碱洗、酸洗 和水洗，直至洗涂液的pH值达到中性，再干燥至恒重，得到用于酶固定化的壳聚糖微球 (NCTS)O
[0016] 较佳地，步骤(3)中甲醒的用量为1. OmLc
[0017] 较佳地，步骤(4)中环氧氯丙烷的用量为2.OmL。
[0018] 较佳地，各步骤中揽拌反应的揽拌速率为25化/min。
[0019] 本发明还提供一种用于酶固定化的壳聚糖微球，由上述方法制备。
[0020] 本发明还提供一种纤维素酶固定化的方法，包括：
[0021] (1)将IOmg权利要求5所述的壳聚糖微球用抑值为4.0~7.0的IOmL的憐酸缓冲液 溶胀24小时后分离；
[0022] (2)在步骤(1)的所得物中加入IOmL的5%戊二醒溶液，于25°C下振荡活化5小时并 过滤，用蒸馈水洗去多余的戊二醒；
[0023] (3)在步骤(2)的所得物中加入2.0~2.Smg酶液，于25~30°C下恒溫振荡固定2~6 小时后，过滤，滤渣用憐酸缓冲液进行反复冲洗后得固定化酶。
[0024] 较佳地，步骤(3)中固定时间为4小时。
[002引较佳地，步骤(1)中憐酸缓冲液的抑值为7.0。
[00%]较佳地，步骤(3)中固定溫度为30°C。
[0027]本发明还提供一种由上述纤维素酶固定化方法得到的固定化酶。
[00%]本发明相对于现有技术，有W下优点：
[0029] (1)本发明提供的壳聚糖微球安全无毒，具有良好的机械性能，耐热性好，分子中 存在大量氨基，易改性，是极具利用价值的固定化酶的良好载体；
[0030] (2)本发明提供的酶固定化方法延续了传统共价结合法固定化酶的优点，且酶活 力回收率较高，具有较高的应用价值；
[0031] (3)本发明制备出的固定化纤维素酶具有良好的稳定性和重复利用性，由于壳聚 糖微球载体呈微球状态，使得产物与酶易于分离回收。
【附图说明】
[0032] 图1为纤维素酶标准曲线；
[0033] 图2为吸光值与葡萄糖浓度的关系(标准曲线）；
[0034] 图3为时间对纤维素酶固定化的影响；
[0035] 图4为pH值对纤维素酶固定化的影响；
[0036] 图5为给酶量对纤维素酶固定化的影响；
[0037] 图6为溫度对纤维素酶固定化的影响；
[0038] 图7为pH对游离酶和固定化酶相对活力的影响；
[0039] 图8为溫度对游离酶和固定化酶相对活力的影响；
[0040] 图9为50°C下游离酶和固定化酶的热稳定性；
[0041] 图10为70°C下游离酶和固定化酶的热稳定性；
[0042] 图11为固定化酶和游离酶的Lincwaver-Burk曲线；
[0043] 图12为游离酶和固定化酶的胆藏稳定性；
[0044] 图13为固定化纤维素酶的重复使用性能。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0046] 实施例1
[0047] (1)称取0.5g壳聚糖粉末于100血S颈瓶中，加入30ml质量分数为5%的乙酸溶液， 室溫下揽拌，待壳聚糖充分溶解后，加入30ml液体石蜡，揽拌10分钟；
[004引（2)将步骤（1)的所得物升溫至50°C，滴加2-3滴乳化剂SpanSO,乳化10分钟，使其 形成细小的壳聚糖液滴；
[0049] (3)