，于540nm处测定吸光度，并计算纤维素酶的活力。
[0091] 固定化酶活力测定：取等当量的固定化酶加入5mL HAc -化Ac缓冲液，再加入1 OmL 浓度为1 %簇甲基纤维素钢(CMC-Na)溶液，在50°C振荡器中W12化/min反应30分钟，立即取 2mL反应液于比色管中，加入2mL DNS试剂，混匀后于沸水中加热10分钟后用流水冷却，定容 至25mL，摇匀后静置15分钟，于540nm处测定吸光度，并计算纤维素酶的活力。同样设置平行 和对照。
[0092]
[0093]
[0094] 其中：A平均:样品液的平均吸光值;A础.?:对照液的吸光值;G: A A值在葡萄糖标准曲 线上对应的葡萄糖量;n:酶粉(液)的稀释倍数;t:反应时间min;M:样品重量(mg)。
[0095] 固定化酶的活力回收率是指固定化酶总活力与固定化时加入游离酶总活力的比 值，W百分掛夫元。
[0096]
[0097] 固定化酶或游离酶的相对酶活（％):指在同組实验中W活力最高的为100,与其余 的固定化酶或游离酶的活力之比，通常W百分数表示。
[0098] 其中，上述提及的葡萄糖标准曲线的制作如下：
[0099] 取11支比色管，洗净烘干并编号，按表巧日入1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液和蒸馈水， 配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。
[0100] 表2不同浓度的葡萄糖溶液
[0101]
[0102] 将溶液摇匀后，向各比色管中加入2.OmL DNS，摇匀后在沸水浴中加热lOmin，然后 流水冷却，用蒸馈水定容至25mL，充分摇匀后静置15min，Wo号试管为参比，于540皿处测吸 光度。W葡萄糖浓度为横坐标，吸光值A540为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。如图2所示，得到 的线性方程为y = 1.1895X-0.0007(r2 = 0.9996)。
[0103] 实验 2-1
[0104] 平行取各类微球载体10.Omg多份，在其它固定化条件相同的情况下，改变固定化 时间分别为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时，然后在其它固定化条件相同的情况下，按照 实施例2的方法制备固定化酶。
[0105] 图3为时间对纤维素酶固定化的影响。
[0106] 如图3所示，固定化时间对酶活力有很大影响。NCTS载体和NCTS-EDA载体固定化酶 的相对活力均随时间的延长而增大，NCTS和NCTS-EDA载体固定化酶的相对活力在4小时达 到最大，此后随着时间的继续增加，相对酶活呈现下降的趋势。若时间太短，酶分子与载体 不能进行充分的接触固定，导致固定于载体上的酶分子较少，固定化酶活力低；若时间过 长，载体上经过戊二醒活化产生的与酶结合的位点趋于饱和，酶分子在载体上积聚过多，导 致空间位阻的增大，影响酶和底物的有效接触，W及底物的扩散作用，影响酶分子活力的发 挥。另外，固定化是在振荡条件下进行，过长的时间也可能使载体表面结合不牢的酶蛋白脱 落下来，运也会导致酶活性的下降。因此，NCTS载体对纤维素酶的固定化时间为4小时。
[0107] 实验 2-2
[010引用不同抑的缓冲液(抑=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)配置一系列浓度为0.1111邑/血的纤 维素酶溶液，并分别测定不同抑值下的游离酶活力，再平行取壳聚糖微球载体10.Omg多份， 在其它固定化条件不变的情况下，分别加入20mL上述不同抑值的纤维素酶溶液，然后在其 它固定化条件相同的情况下按照实施例2的方法制备固定化酶。
[0109] 图4为pH值对纤维素酶固定化的影响。
[0110] 如图4所示，当pH在6.0-7.0范围时，NCTS载体和NCTS-EDA载体固定化酶均表现出 较高的活性，超出此范围，酶活力均出现不同程度的下降。由于pH值对纤维素酶的活性中屯、 和结构稳定性W及酶与载体的结合具有影响，固定化酶的形成最好在中性(抑= 7.0)或偏 中性条件下进行，过酸或者过碱的抑环境都会降低酶的活力。
[0111] 实验 2-3
[0112] 平行取壳聚糖微球载体10.Omg多份，在其它固定化条件相同的情况下，分别加入 不同量的纤维素酶，使给酶量为1.0/10.0 mg载体、1.5/10.0 mg载体、2.0/10.0 mg载体、2.5/ 10.0 mg载体和3. Omg/10.0 mg载体，然后在其它固定化条件相同的情况下按照实施例2的方 法制备固定化酶。
[0113] 图5为给酶量对纤维素酶固定化的影响。
[0114] 如图5所示，壳聚糖微球载体质量一定，固定化酶的活力随着给酶量的增加而变 大，当给酶量增加到一定值时，酶活力反而有所降低。由图5可知给酶量在2.0-2.5mg/ 10.0 mg (NCTS载体)范围内，固定化酶均具有较高的酶活力。
[0115] 实验 2-4
[0116] 平行取壳聚糖微球载体10.Omg多份，在其它固定化条件相同的情况下，改变固定 化溫度分别为15°(：、20°(：、25°(：、30°(：和35°(：，然后在其它固定化条件相同的情况下按照实 施例2的方法制备固定化酶，观察溫度对酶固定化的影响。
[0117] 图6为溫度对纤维素酶固定化的影响。
[0118] 如图6所示，相对酶活随固定化溫度的升高呈现出先增加而后减小的趋势。当固定 化溫度在25-35°C范围时，固定化纤维素酶的相对活力均达到了78% W上。
[0119] 综上，壳聚糖微球载体NCTS固定化酶的最佳条件：固定化时间4小时，固定化PH = 7，给酶量为2. OmgAO. Omg载体，固定化溫度为30°C。在此最佳固定化条件下，酶的固载量为 97.6mg/g(载体），酶活力回收率达到了 76.8 %。
[0120] 实验 3-1
[0121] 对应取适量的游离酶和固定化酶，分别加入不同抑(2.8-7.8)的HAc-化Ac缓冲液 和对应pH值的CMC-化溶液，按照游离酶活力测定方法和固定化酶活力测定方法测定酶活 力，最高的酶活力设为100 %。
[0122] 图7为抑对游离酶(Free enzyme)和固定化酶相对活力的影响。
[0123] 如图7所示，随着抑值的增大，游离酶和固定化酶活性均呈现先增大而后减小的变 化趋势，最适抑值均是4.8，但是固定化纤维素酶在大部分的抑值下都比游离的纤维素酶活 性高，运表明固定化纤维素酶较游离纤维素酶表现出更好的pH适应性。
[0124] 实验 3-2
[0125] 对应取适量的游离酶和固定化酶，加入HAc-化Ac缓冲液和CMC-化溶液，分别于30 °c、4〇°c、5(rc、6(rc、7(rc、8(rc条件下反应，按照游离酶活力测定方法和固定化酶活力测 定方法测定酶活力，最高的酶活力设为100 %。
[0126] 图8为溫度对游离酶和固定化酶相对活力的影响。
[0127] 如图8所示，游离酶的最适溫度为50°C，且曲线走向趋势较为睹峭，说明游离酶的 催化反应受溫度影响较大，而经固定化后，虽然固定化酶的最适溫度没有提高，但是在50 °C-7(TC范围内都保持了较高的酶活，最适溫度范围变宽。运说明固定化酶的热稳定性要高 于游离酶。
[012引实验3-3
[0129] 对应取适量的游离酶和固定化酶，置于50和70°C水浴中，每隔30min、60min、 90min、120min取出测定酶活力，未经保溫处理的酶活设定为100%。
[0130] 图9为50°C下游离酶和固定化酶的热稳定性。图10为70°C下游离酶和固定化酶的 热稳定性。
[0131] 如图9所示，在50°C时，随着保溫时间的延长，游离酶和固定化酶的酶活力出现不 同程度的降低，且游离酶活力下降的更快。保溫120min后，游离酶和固定化酶残留活力为 64%、76% (NCTS)、78% (NCTS-EDA)。由图10可W得出，在70°C时，游离酶和固定化酶的酶活 力也