用于快速检测南非型口蹄疫病毒的特异性引物组及包含有该引物组的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一组用于快速检测南非型口蹄疫病毒的特异性引物组，所述特异性引物组由1条下游引物和7条上游引物组成；所述下游引物为序列表中序列1所示单链DNA分子，所述上游引物为序列表中序列2?8所示单链DNA分子；还提供了包含有该引物组的试剂盒。本发明的有益效果为：本发明通过使用特异性复合引物及在一系列质控和阴性、阳性对照的辅助下，从分子水平对SAT FMDV的病毒核酸进行检测，该方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，是可以同时检测三个SAT FMDV的检测技术，实现对SAT FMDV诊断和监控的战略储备，对于防止该些病毒传入我国具有重要的战略意义，同时具有良好的应用前景。
【专利说明】
用于快速检测南非型口蹄疫病毒的特异性引物组及包含有该 引物组的试剂盒
技术领域
[0001 ]本发明设及口蹄疫病毒检测技术领域，具体设及用于快速检测南非型口蹄疫病毒 SAT FMDV的特异性引物组及包含有该引物组的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD)是一种由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)引起的危害牛、猪、羊等偶蹄动物的严重的急性热性高度接触性传染 病。W发热，唇部、口腔黏膜、乳房及蹄部出现烂斑或水瘤性病理变化为典型的临床特征。感 染口蹄疫不仅会导致动物生产能力大幅度下降，而且严重影响了发病地区畜产品的上市和 出口。由于其传播速度快，不易控制和消灭，严重危害世界动物贸易，被世界卫生组织列为 必须上报传染病之一。
[0003] 口蹄疫病毒属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae)中的口蹄疫病毒属 (Aphthovirus)。包括A、0、C、Asia 1(亚洲 1型）、SAT 1(南非 1型）、SAT 2(南非2型）及SAT 3 (南非3型）7个血清型，各血清型之间无交叉保护力。FMDV的病毒粒子直径20-25皿，为正二 十面体结构，近似圆形；基因组为全长8,500nt的正链RNA，包括一个开放阅读框（open reading frame，0RF)，5 非编码区（5' -Untraslated Region，5' -UTR)和3 非编码区（3 ' -Un化aslated Region，3'-UTR);0RF编码病毒多聚蛋白，依赖于自身编码的蛋白酶化、2A、 3C)及少数的宿主因子，在经过3级裂解后，形成4种病毒结构蛋白（VP4、VP2、VP3和VP1)和9 种非结构蛋白化曰6、化、24、28、2(：、34、38、3(：和30);四种结构蛋白各60分子构成病毒颗粒， VPl靠近由五个原粒组成病毒表面的小桐，VP2和VP3位于远端，VP4则完全位于衣壳里面。
[0004] 根据运7个血清型之间的同源性，将FMDV分为2个群，群1 (欧亚型）包含A、0、C和 Asial型；群2(南非型）包含SATl、SAT2和SAT3型。由南非型口蹄疫病毒（（Southern Ahican Territories Foot and Mouth Disease Virus,SAT FMDV)引起的南非型口蹄疫最初主要 局限于撒哈拉沙漠 W南的非洲地区，有明显的地理局限性，但由于贸易和人员交流的快速 发展，SAT2已从撒哈拉沙漠 W南经北非传至己基斯坦等国家。中国西南与己基斯坦相接，不 能排除SAT FMDV传入我国的可能性。
[0005] 口蹄疫对偶蹄类经济动物的威胁众所周知，它的发病造成的经济损失至今仍为各 类传染病之首。为了确定FMDV是否在某一地区存在，通过病原学检测W确诊FMDV的存在具 有重要意义。一般检测方法包括病毒分离、病毒中和实验W及扩增病毒核酸的分子生物学 等诊断技术。尽管病毒分离被认为是检测FMDV的金标准，但其由于耗时长，费用高，存在二 次散毒的隐患，一般基层很难开展此项工作，同样病毒中和实验也存在类似的弊端。扩增病 毒核酸的分子生物学方法当今已经成为诊断病原的主要方法。南非型口蹄疫未曾在我国暴 发过，诊断技术和力量薄弱，所W，有必要建立起快速、简便、易操作、低成本、尤其适合未来 在基层兽医实验室应用的病毒核酸检测方法。经典的反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Qiain Reaction,RT-PCR)恰好符合上述要求。由于SAT FMDV， 尤其是SAT2,拓扑型众多，用于型别诊断的VPl蛋白编码区基因 ID变异度又非常大，即使建 立经典的RT-PCR方法也存在很大难度，要么与群1欧亚型FMDV存在交叉反应性，特异性较 低，要么就是存在漏诊，敏感性又偏低。如Reid曾设计SAT-1D209F/FMDV-2B208R引物对来检 测SAT FMDV(Reid S.M.,Ferris N.P.,Hutchings G.H.,et al.PrimaiT dia即osis of foot-and-mouth disease by reverse transcription polymerase chain reaction.Journal of Virological Methods,2000,89:167-176.)，结果只能针对SATl型 和SAT2扩增出720bp的目的产物，SAT3扩增产物利用凝胶电泳法根本检测不到，只能通过 PCR-ELISA的方法才能检测到；Callens等人也曾共用下游引物(Pl)和复合上游引物来检 测SATl(P126、P151-153)、SAT2(P168-170)和SAT3(P130、P158-161KCallens M.,Clercq K.D.Differentiation of the seven serotypes of foot-and-mouth disease virus by reverse transcriptase polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods，1997，67: 35-44.)，但3个血清型之间极容易出现交叉反应。尽管国外学者做了相 应研究，但是由于存在上述缺陷，所W，目前国、内外还没有相应的SAT FMDV诊断试剂盒问 世。故此，建立起SAT FMDV的RT-PCR检测方法并研制出相应的诊断试剂盒对防控SAT FMD传 入我国具有重要的战略意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了用于快速检测SAT FMDV的 特异性引物组及包含有该引物组的试剂盒。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一组用于快速检测SAT FMDV的特 异性引物组，所述特异性引物组由1条下游引物和7条上游引物组成;所述下游引物为序列 表中序列1所示单链DNA分子，所述上游引物为序列表中序列2-8所示单链DNA分子，该复合 型引物组被命名为SAT-D8。
[000引8条特异引物由1条下游引物和7条上游引物组成：
[0009] P296-R:5-ACYTTTACCAGGGYTTGGC-3；
[0010] P280-F:5-GGCGTTGAGAAACAACTGTG-3；
[0011] P281-F：5-GGCGTTGAGAAACAGCTGTG-3；
[0012] P282-F:5-GGTGTCGAAAAACAGTTGTG-3；
[0013] P283-F:5-GGTGTCGAAAAACAGCTGTG-3；
[0014] P310-F:5-GGCGTCGAAAGACAGACCCT-3；
[0015] P329-F:5-GCACCAGCCAAACAACTGTG-3；
[0016] P331-F:5-AGTGCTGACAAGCAGATGTG-3。
[0017]本发明的第二个目的是提供了上述特异性引物组在制备用于快速检测SAT FMDV 的试剂盒中的应用。
[0018] 本发明的第S个目的是提供了用于快速检测SAT FMDV的试剂盒，包括有上述的特 异性引物组。
[0019] 本发明旨在W合成的基因序列为模板，建立起SAT FMDV常规RT-PCR诊断方法，引 物设计为建立RT-PCR方法的关键，由于VPl蛋白编码区基因 ID是进行FMDV分型的依据，又因 为SAT FMDV的ID基因变异度大(70 %-85 % )，所W，复合引物为本实验的最优选择。通过分 析与比较，选取了 ID基因3'端作为上游引物设计的祀区域，下游引物在保守性较好的2B区。 通过实验检测，最终筛选出一套由7条上游引物和1条下游引物组成的复合引物，命名为 SAT-D 8引物。
[0020] 由于我国历史上没有SAT FMD，为了保障生物安全性并满足实验需要，在比较分析 SAT FMDV核酸序列同源性基础上，挑选出8个SATl型、10个SAT2型和3个SAT3型的代表毒株， 合成该些毒株的1D2A2B基因，并与PU巧7克隆载体连接，构建出相应的重组质粒。W该些重 组质粒为模板，W SAT-D8为引物，首先在DNA水平上建立了FMDV SAT-D8RT-PCR检测方法。W 上述21个质粒为模板，都能特异性地扩增出257bp的目的条带。进一步通过体外转录法制备 出21个毒株的1D2A2B基因 RNA转录本，W此为模板，也都能够扩增出特异的目的条带。该方 法与A、0、C和AsiaI型FMDVW及牛流行性腹泻病毒(BVDV)、羊口疮病毒(ORFV)、山羊痘病毒 GTPV、绵羊痘病毒SPPV、猪水泡病毒(SVDV)、蓝舌病病毒(BTV)、美洲型高致病性猪繁殖与呼 吸综合征病毒(NA-册-PRRSV)、美洲型非高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(NA-Non-册-PRRSV)、古典猪攝病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒(PCV) 等不发生交叉反应。W质粒为模板，FMDV SAT-D8RT-PCR方法的灵敏度可达到IO2拷贝数/微 升，WRNA转录本为模板，灵敏度化O 3-IO4拷贝数/微升。
[0021] W来自口蹄疫ore参考实验室(英国Pirbri曲t实验室)的SAT1/2/3灭活抗原和125 份源自我国牛猪羊的屯、、肝、脾、肺、肾、舌面组织及血清作为待检样品，提取其RNA后，进行 SAT-D8RT-PCR实验。结果表明，WSAT1/2/3RNA为模板，扩增出预计的SAT FMDV阳性条带。阳 性条带的进一步序列分析表明为相应的SAT1/2/3型。其它125份田间样品检测结果全为南 非型病毒阴性。在建立了FMDV SAT-D8常规RT-PCR检测方法基础上，组装了相应的试剂盒。
[0022] 本发明的有益效果为:本发明提供的用于快速检测SAT FMDV的特异性引物组及包 含有该引物组的试剂盒，通过使用特异性复合引物及在一系列质控和阴性、阳性对照的辅 助下，从分子水平对包括SAT FMDV的病毒核酸进行检测，该方法具有简便、经济、快速、灵敏 和特异的特点，实现了可W同时检测SAT1/2/3S个血清型的常规RT-PCR检测技术，能够完 成对SAT FMDV的诊断和监控的战略储备，对于防止其传入我国具有重要的战略意义，同时 具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0023] 图1为采用FMDV SAT-D8RT-PCR方法检测合成的SAT FMDV代表毒株核酸含有 1D2A2B基因片段的重组质粒为扩增模板)的琼脂糖凝胶电泳图谱。结果显示在257bp处出现 了与预计分子量大小相当的特异性条带，阴性对照（WcMHsO为模板)无条带出现。
[0024] 其中，M: DL2000分子量标准（2000，1000，750，500，250，IOObp); P: PUC57质粒；1: SATKAY593839)；2:SAT1(AY593840)；3:SAT1(AY593841)；4:SAT1(AY593846)；5:SAT (AY593838)；6:SAT1(HM067706)；7：SAT1(JF749860)；8:SAT1(AY593842)；9：SAT2 (开749864);10:SAT2(AW40910);11:SAT2(AY593848);12:SAT2(W749861);13:SAT2 (JF749862);14:SAT2(A593847);15:SAT2(HM067705);16:SAT2(AJ251473);17:SAT2 (JHM067704);18:SAT2(KC440884);19:SAT3(AY593850);20:SAT3(AY593852);21:SAT3 (AY593853);W:阴性对照。
[0025] 图2为含T7启动子的FMDV SATl/2/3的1D2A2B基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳 图谱。针对与目的基因两端相衔接的载体序列设计引物，在下游引物末端加上T7启动子，W 获得含T7启动子的目的基因序列。
[00%]其中，M:DL2000相对分子量标准；1: SATl (AY593839); 2: SATl (AY593840); 3: SATl (AY593841)；4:SAT1(AY593846)；5:SAT1(AY593838)；6:SAT1(HM067706)；7：SAT1 (JF749860)；8:SAT1(AY593842)；9：SAT2(JF749864)；10：SAT2(AF540910)；11:SAT2 (AY593848);12:SAT2(W749861);13:SAT2(W749862);14:SAT2(A593847);15:SAT2 (HM067705);16:SAT2(AJ251473);17:SAT2(JHM067704);18:SAT2(KC440884);19:SAT3 (AY593850) ;20:SAT3(AY593852) ;21 :SAT3(AY593853) ;W:阴性对照（Wd地2〇为模板）。
[0027] 图3为FMDV SAT2(JF749864)转录产物纯化后的电泳图谱。
[002引 其中，Ml :DNA DL2000;M2:RNA 1000 maker; 1:WSAT2(JF749864)T7胶回收产物为 模板的转录产物;2: WSAT2(J巧49864)T7PCR产物直接为模板的转录产物;3:未加转录酶的 SAT2Q巧49864)转录产物;4:RNase处理的SAT2Q巧49864)转录产物。
[0029] 图4为FMDV SAT1/2/3转录产物纯化后的电泳图谱。
[0030] 其中，1 :SAT1(AY593846)转录产物；2:SAT2(JF749862)转录产物；3:SAT3 (AY593852)转录产物。
[0031] 图5为W质粒为模板，进行FMDV SAT-D8RT-PCR方法的分析敏感性检测结果。W倍 比系列稀释含SAT FMDV的1D2A2B基因片段的重组质粒为模板，进行FMDV SAT-D8RT-PCR检 测，琼脂糖凝胶电泳结果显示此方法的灵敏度为4 X 102copiesAiL。
[0032] 其中，（A)SATl型代表毒株（AY593846)灵敏度检测结果；（B)SAT2型代表毒株 (JF749862)灵敏度检测结果；（OSAT3型代表毒株(AY593852)灵敏度检测结果；1-9泳道W 质粒SAT1/2/3为模板，拷贝数依次为4 X 108-4 X lcAiopies/化;10泳道是阴性对照。W质粒 为模板的灵敏度为4 X 102copiesAiL。
[0033] 图6为W合成的SAT FMDV的1D2A2B基因的RNA转录本为模板，进行FMDV SAT-D8RT-PCR方法的分析敏感性检测。
[0034] 其中，（A)SATl型代表毒株（AY593846)灵敏度检测结果；（B)SAT2型代表毒株 (JF749862)灵敏度检测结果；（OSAT3型代表毒株(AY593852)灵敏度检测结果；1-9泳道W 质粒SAT1/2/3为模板，拷贝数依次为4X 109-4 X IOicopiesAiL 10泳道是阴性对照。WRNA转 录本为模板的灵敏度为4 X 103copiesAiL。
[0035] 图7为进行FMDV SAT-D8RT-PCR分析特异性检测所采用的非SAT FMDV病毒自身鉴 定的RT-PCR或者PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱。
[0036] 其中，M: DL2000分子量标准；1: FMDV/A/AF72/MF4; 2 : FMDV/A/HB/WH/09/MF4; 3 : FMDV/A/FJ/YX/2014/MF5；4：FMDV/0/GD/BYQ/2010/S/33/MF6；5：FMDV/0/NX/99/MF4；6： FMDV/0/HN/XH/BF13-15/MF2；7：FMDV/0/GS/LT/101209/MF2；8：FMDV/Asial/JS/WX/05/MF4； 9：FMDV/Asial/58/MF3；10：FMDV/Asial/XJ-KLMY/MF4；II：ORFV；12：BVDV；13：BTV；14：GTPV； 15:5??￥;16:5￥0￥;17:?3￥(4￥25株）；18:?〇^2(91叫7日11的株）；19:?〇^2(81油11日11株）；20:口口￥ (AV30株）；21:PPV(AV31株）；22:CSFV;23:NA-HP-PRRSV(地-08株）；24:NA-Non-册-PRRSV 化e 1 i 株）；2 5: NA-HP-PRRSW GW株）。
[0037] 图8为FMDV SAT-D8RT-PCR方法的分析特异性检测结果。用于分析特异性检测的病 毒包括 FMDV (A、0、C、AsiaI)和 BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、 PCV)。W其它非SAT FMDV病毒核酸为扩增模板，进行FMDV SAT-D8RT-PCR检测的琼脂糖凝胶 电泳图谱。结果显示此方法特异，与其它病毒无交叉反应。
[003引 其中，M: DL2000; 1、12、28、35、36、37: SAT-FMDV; 2: FMDV/A/AF72/MF4; 3:FMDV/A/ 皿/WH/09/MF4;4:FMDV/A/FJ/YX/2014/MF5;5:FMDV/0/GD/BYQ/2010/S/33/MF6;6:FMDV/0/ NX/99/MF4;7:FMDV/0/HN/XH/邸13-15/MF2;8:FMDV/0/GS/LT/101209/MF2;9:FMDV/As i a1/ JS/WX/05/MF4;10:FMDV/Asial/58/MF3;11:FMDV/Asial/XJ-KLMY/MF4;13:ORFV;14:BVDV; 15：BTV；16：GTPV；17：SPPV；18：SVDV；19：PRV(AV25)；20：PCV2(QingyangS)；21：PCV2 (S i chuan);22:PPV(AV30);23:PPV(AV31);24:CSFV;25:PRRSV(卵08);26:PRRSV(He1i);27: PRRSV(GW)；29：FMDV/C(DQ409188)；30：FMDV/C(AY593809)；31：FMDV/C(AY593810)；32： FMDV/C(AJ007347)；33：pUC57；34：DEPC-treated water.
[0039] 图9为W来自英国Pirbri曲t实验室的FMDV SATl/2/3灭活抗原的RNA为模板，进行 FMDV SAT-D8RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。从口蹄疫01E参考实验室（英国 Pirbright实验室）引进的SATUSAT2和SAT3灭活抗原中提取RNA，W此为模板，采用SAT-D8 引物对其进行常规RT-PCR检测。结果显示，采用FMDV SAT-D8RT-PCR能够检测出S种南非型 口蹄疫病毒，扩增出相应大小的目的片段。
[0040] M:化2000相对分子量标准；1、2: SATl重组质粒；3、4: SATl灭活抗原；5、6 :阴性对 照；7: SAT2灭活抗原;8: SAT3灭活抗原;9: SAT2重组质粒；10: SAT3重组质粒
[0041 ] 图10采用FMDV SAT-D8RT-PCR方法检测来自我国的125份猪、牛或者羊的田间组织 样品的琼脂糖凝胶电泳图谱。结果显示，125份田间组织样品均为南非型口蹄疫病毒阴性。
[0042] 其中，M:DL2000相对分子质量;a，b，c泳道是SAT1/2/3S个重组质粒(作为阳性对 照）；3:其余125个泳道分别是125份牛、羊、猪的屯、、肝、脾、肺、肾、舌面组织或血清检测结 果。
【具体实施方式】
[0043] 实施例1:
[0044] 南非型口蹄疫常规RT-PCR检测方法即FMDV SAT-D8RT-PCR的建立：
[0045] USAT FMDV检测祀片段1D2A2B基因的合成：
[0046] 从GenBank化tabase中下载SAT1/2/3-FMDV的全基因序列，利用生物信息学软件 DNAStar7.0中的Clustal W Method方法比对分析SAT-FMDV的全基因序列的相似性，最终选 取相似性较低(<85%)的序列代表SATU8条）、SAT2(10条）、SAT3(3条）。表1显示为SAT FMDV 代表毒株序列登录号。
[0047] 表 1 r00481
[0049] 2、FMDV SAT-D8RT-PCR反应：
[0化0] 本试剂盒参照Genbank登录的SAT FMDV的1D2A2B基因的序列，设计并合成8条引 物。引物组序列如下：
[0051] 引物组由1条下游引物和7条上游引物组成：
[0052] P296-R:5-ACYTTTACCAGGGYTTGGC-3；
[0053] P280-F:5-GGCGTTGAGAAACAACTGTG-3；
[0054] P281-F:5-GGCGTTGAGAAACAGCTGTG-3；
[0055] P282-F:5-GGTGTCGAAAAACAGTTGTG-3；
[0056] P283-F:5-GGTGTCGAAAAACAGCTGTG-3；
[0057] P310-F:5-GGCGTCGAAAGACAGACCCT-3；
[005引 P329-F:5-GCACCAGCCAAACAACTGTG-3；
[0059] P331-F:5-AGTGCTGACAAGCAGATGTG-3。
[0060] W合成的SAT FMDV 1D2A2B基因为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系如下所示：
[0061] PrimeSTAR GLX(PrimeSTAR)酶（1.2抓/化）：0.化1^;
[0062] 5x PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus) :4化；
[0063] dNTP Mixture(各
[0064] F-primer:各5pmol;
[00化]R-primer: IOpmol;
[0066] DNA template :1化；
[0067] DEPC water:加至20化。
[006引 PCR扩增条件如下：951：5111111，941：303,601：303,681：303，共36个循环，681： 10min0
[0069] PCR的反应产物检测和结果判定:反应后的产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，lOV/cm， 30分钟后漠化乙锭染色，260nm波长的紫外灯下观察在25化P处是否有目的条带出现。
[0070] 利用SAT-D8引物组对21条SAT-FMDV-1D2A2B条序列进行PCR扩增，扩增产物片段大 小与预期大小相符(257bp)，阴性对照（WpUC57载体和d地2〇为模板)无条带出现。如图1所 示。结果表明所筛选的SAT-D8引物组可W成功地鉴别出合成的SAT-FMDV代表毒株基因。
[0071] 实施例2 FMDV SAT-D8RT-PCR方法的分析敏感性和分析特异性实验：
[0072] UFMDV SAT RT-PCR的分析敏感性实验：
[0073] 1.1WSAT-FMDV-1D2A2B片段重组质粒DNA为模板，检测FMDV SAT-D8RT-PCR方法灵 敏度：
[0074] W已知测定浓度的SAT1/2/3-FMDV-1D2A2B-PUC57重组质粒为模板，计算拷贝数， W4X IO8CopiesAiL为起始模板，并对其进行10倍倍比稀释，按照上述PCR检测流程测定病 毒最低检出限。结果表明测定病毒最低检出限结果为4X IO2CopiesAiL,如附图2所示。
[00巧]SAT-FMDV-1D2A2B-PUC57属于双链DNA，拷贝数计算公式如下：
[0076] (6.02 X 1023拷贝数/摩尔）X(浓度g/ml)パMWg/mol)X10-3 = 拷贝数Ail或者 (6.02X 1〇23拷贝数/摩尔）X (浓度雌/山佔0-6八丽g/mol) X 1〇-3 =拷贝数/山；
[0077] 平均分子量(MW g/mol): dsDNA=(碱基数）X (660道尔顿/碱基）；ssDNA=(碱基 数）X (330道尔顿/碱基）
[007引 1.2WSAT-FMDV-1D2A2B片段的体外RNA转录本为模板，检测FMDV SAT-D8RT-PCR方 法灵敏度：
[0079] 1.2.1SAT-FMDV-1D2A2B 的 DNA 片段的 RNA 转录本制备：
[0080] 重组质粒无启动子，无法直接进行体外转录。所W首先针对连接目的片段1D2A2B 两端的PTC57载体序列设计引物，然后在引物末端加上T7启动子，W重组质粒为模板进行 PCR扩增获得含T7启动子的1D2A2B目的序列DNA，PCR扩增产物胶回收后可W直接作为模板 进行体外转录。通过PCR扩增出的含T7启动子的目的序列片段大小与预期相符，结果如图3 所示，分别从SATl、SAT2、SAT3中随机各挑选2个样品的产物送往金唯智公司测序，测序结果 与目的片段比对正确，可W作为体外转录模板。W其中一个阳性重组质粒SAT2-FMDV-lD2A2B-pUC57(J巧49864)为例按照 mMESSAGEmMACHINE處 1(11。/^:411344,25次/盒）试 剂盒说明书进行体外转录，然后按照RNeasy Mi址lute Cleanup Kit(Cat.No.74204,50次/ 盒)试剂盒的操作流程对转录产物进行纯化，结果表明未加转录酶的样品及用RNase处理的 样品均无目的条带出现，而正常反应样品在1300nt左右处有目的条带出现，如图4所示，与 预期相符，表明成功制备转录本RNA。由于RNA不稳定，不适合长期存放，所WSAT1/2/3各挑 选一个阳性重组质粒进行体外转录制备转录本RNA，结果如图5所示，后续用于SAT-D8引物 灵敏度检测的模板。
[0081 ] 1.2.2WSAT-FMDV-1D2A2B片段的体外RNA转录本为模板，检测FMDV SAT-D8RT-PCR 方法灵敏度：
[0082] 利用上述通过体外转录制备的SAT1//2/3-FMDV-1D2A2B-PUC57目的序列转录本 RNA为模板，W4 X IO9CopiesAiL为起始模板，并对其进行10倍倍比稀释，按照下述检测流程 利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2(Lot:RR055A)试剂盒测定 病毒最低检出限。结果表明WRNA为模板，SAT-D8引物检测SAT FMDV的最低检出限大约在4 X l〇3copies/]iL，如附图6所示。
[0083] W合成的SAT FMDV核酸1D2A2B转录本RNA为模板，进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应体 系如下所示：
[0084] RT-PCR 反应体系：
[0087] RT-PCR扩增条件如下：5〇1：3〇111111，951：5111111，941：3〇3,6〇1：3〇3,721：3〇3，共37个循环，72°C10min。
[0085：
[00龄
[0088] 转录本为单链RNA，拷贝数计算公式如下：
[00例 （6.02 X 1023拷贝数/摩尔）X(浓度g/ml)パMWg/mol)X10-3 = 拷贝数Ail或者 (6.02X 1023拷贝数/摩尔）X (浓度雌/山佔0-6八丽g/mol) X 10-3 =拷贝数/山。
[0090] 平均分子量(MW g/mol):ssRNA=(碱基数）X(340道尔顿/碱基）。
[0091] 2、FMDV SAT RT-PCR的分析特异性实验：
[0092 ]分析特异性实验中所使用毒株 FMDV (A、0、As ia I)和BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、 BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV的提取及自身鉴定实验。
[0093] 使用QIAGEN公司提供的病毒RNA/DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取病毒的 RNA/DNA。然后利用各病毒自身特异型引物和扩增条件进行PCR或RT-PCR鉴定，产物电泳结 果表明每种病毒在目的条带出都有扩增产物带出现，检测结果全部为阳性，如图7所示。扩 增产物进一步进行测序鉴定，测序结果在NCBI上Blast结果证明确实是运些病毒，可W用于 后续分析特异性验证实验。
[0094] 分别用经过证实的A、AsiaI和0型口蹄疫病毒W及BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、 BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV的 RNA或DNA作为SAT FMDV RT-PCR反应模板，然后按照实施 例2中的SAT FMDV的RT-PCR体系和条件进行反应，反应产物用琼脂凝胶电泳检测，3个SAT FMDV阳性对照在257bp附近都有目的条带出现，而上述交叉检测毒株无条带出现，结果如附 图8所示，说明SAT-D8引物与其它病毒无交叉反应。
[00M]上述结果表明本实验所建立的SAT FMDV的多重PCR方法与上述12种病毒无交叉反 应。
[0096] 3、采用FMDV SAT-D8RT-PCR检测临床样品：
[0097] 3.1临床样品的准备：
[0098] W来自口蹄疫(HE参考实验室(英国Pirbri曲t实验室)的灭活抗原SAT1/2/3和125 份源自我国牛猪羊的屯、、肝、脾、肺、肾、舌面组织及血清作为田间待检样品，提取其RNA后， 然后按照实施例2的体系和扩增条件进行SAT-D8RT-PCR实验。
[0099] 3.2RT-PCR 检测结果：
[0100] W上述SAT1/2/3灭活抗原（来自英国Pirbri曲t实验室）和125份田间样品的核酸 RNA为模板，用所建立的FMDV SAT-D8RT-PCR检测方法进行检测，结果表明，WSAT1/2/3灭活 抗原RNA为模板，扩增出预计的SAT FMDV阳性条带。阳性条带的进一步序列分析表明，该些 灭活抗原为相应的SAT型口蹄疫病毒。其它125份田间样品检测结果全为SAT阴性。结果如表 2、图9、图10所示。
[0101] 表2
[0102]
[0103] 4结化
[0104] 上述实验证明所建立的FMDV SAT-D8RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、快 速、实验设备简单和操作容易等特点，适合于实验室和临床对南非型口蹄疫病毒即SATFMDV 进行快速诊断，可W作为我国防控南非型口蹄疫的一种战略储备资源。
[0105]最后应说明的是：W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一组用于快速检测南非型口蹄疫病毒SAT FMDV的特异性引物组，其特征在于，所述 特异性引物组由1条下游引物和7条上游引物组成;所述下游引物为序列表中序列1所示单 链DNA分子，所述上游引物为序列表中序列2-8所示单链DNA分子。2. 根据权利要求1所述的特异性引物组在制备用于快速检测南非型口蹄疫病毒SAT FMDV的试剂盒中的应用。3. 用于快速检测南非型口蹄疫病毒SAT FMDV的试剂盒，其特征在于，包括有权利要求1 所述的特异性引物组。
【文档编号】C12N15/11GK105861755SQ201610398762
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】张 杰, 张永光, 刘亚丽, 王永录, 方玉珍, 丁耀忠, 潘丽, 常惠芸, 吕建亮, 周鹏
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所