防治黄瓜霜霉病的生防菌株hg03及用其制备的生防菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种防治黄瓜霜霉病的生防菌株HG03及用其制备的生防菌剂，该菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2016年5月23日，保藏编号为CGMCC No.12481。由HG03菌株液体发酵培养制成的生防菌剂对防治黄瓜霜霉病具有较好效果，大棚中使用生防菌剂对黄瓜霜霉病的防治效果达61.82%。CGMCC No. 1248120160523
【专利说明】
防治黄瓜霜霉病的生防菌株HG03及用其制备的生防菌剂
技术领域
[0001]本发明属于农业微生物领域，涉及防治黄瓜霜霉病的生防菌株HG03及用其制备的 生防菌剂。
【背景技术】
[0002] 随着保护地和田间设施大棚的盛行，在给菜农带来巨大的经济收益的同时也给植 保专家带来病害防治的高要求。黄瓜霜霉病流行快，发病重，防治难度大。
[0003] 黄瓜生育期一旦遇到湿度大的气候条件则霜霉病易造成大爆发，给黄瓜产量带来 不可估量的损失。目前，黄瓜霜霉病的防治主要依靠抗性品种。其次是选用化学药剂防治， 但化学农药的反复使用极易导致抗药性产生。随着社会对绿色食品的要求，生物防治的手 段越来越受重视。
[0004] 黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉（Pseuc/OjOercMoSjOora Ct//?e/3sis)引起的，是全世界 范围内黄瓜产区最主要叶部病害之一，全世界大约有70多个国家先后发生这种病害，对黄 瓜生产威胁极大，严重危害黄瓜种植业，已成为全世界黄瓜生产的主要限制因素之一。
[0005] 本病原菌是专性寄生菌，目前基本在室内平板上无法存活;黄瓜霜霉病属于气传 病害，一旦设施大棚温湿度适合，流行速度极快，所以菜农最常选择的方式是不管霜霉病是 否发生，平均7天使用一次化学药剂，甚至在病害流行期间，会缩短至3-4天一个使用间隔周 期，而不考虑农药残留对果实采摘安全期的严格限制，因而生产上急需黄瓜霜霉病的绿色 防治技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是:提供一种防治黄瓜霜霉病的生防菌株HG03及用其制备的生防菌 剂，采用生防菌株HG03制备的生防菌剂防治黄瓜霜霉病，是一种较有应用前景的有效途径。
[0007] 本发明的技术解决方案是:该防治黄瓜霜霉病的生防菌株HG03，属于芽孢杆菌属， 分类命名为sp.，于2016年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，菌种保藏号为CGMCC No. 12481。
[0008] 其中，所述生防菌株HG03制备的生防菌剂，该生防菌剂的制备方法是:将芽孢杆菌 HG03的种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28-30°C、180-200rpm培 养40-48 h;然后5000-6000 rpm离心10-15 min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中 活菌总浓度为1X10 8~1X10 9CFU/mL。
[0009] 其中，所述的保藏号为CGMCC No. 12481的芽孢杆菌HG03种子菌液制备方法是:将 保藏号为CGMCC No.12481的芽孢杆菌HG03菌株接种到LB培养液中28°C培养，180 rpm振 荡培养至600 nm处的0D值为0.8时结束培养。
[0010]其中，所述的保藏号为CGMCC No . 124818的生防菌株HG03制备的生防菌剂防治黄 瓜霜霉病的应用方法是:所述的生防菌剂稀释100~200倍后，在温室种植黄瓜上喷雾处 理，15天为一个间隔周期共处理2次。
[0011]本发明的有益效果是:采用生防菌株HG03用于制备生防菌剂，是专门针对黄瓜霜 霉病开发的生防制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于蔬菜的无 公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅为农民节省开支，而且减少化 学药剂的残留，有利于蔬菜的出口。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1:生防菌株HG03的筛选 枯草芽孢杆菌HG03(CGMCC No. 12481)由江苏省淮安市码头镇黄瓜叶片上分离到;将 黄瓜叶片切成lcm的小片，用质量浓度1%的次氯酸钠浸泡5 min，质量浓度70%酒精浸泡1-2 min，无菌水清洗3次；取最后一次清洗的溶液100μΙ涂于R2A固体培养基上培养，若48 h 后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌;取3 g消毒好的样品置于菌研钵中，加入27 ml无菌 的质量浓度0.85% NaCl，浸软组织，研磨，用无菌的质量浓度0.85% NaCl梯度稀释；取10 一\10 _2、10 _3三个梯度的稀释液各100μΙ涂于R2A上，28°C培养48 h;挑取最大的单菌落 接种到新鲜R2A固体培养基，经反复转接得到纯化菌株;将纯化后的菌株用质量浓度40%甘 油保存于-70 °C超低温冰箱中。
[0013] 鉴定:通过形态特征，生理生化实验和16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定。
[0014] 形态学特征:革兰氏阳性杆菌，产芽孢，菌落表面粗糙不透明，无荚膜，周生鞭毛。
[0015] 16S rRNA基因扩增和序列分析：芽孢杆菌属HG03在R2A培养基中28°C培养至 对数期，以12 000 r/min离心5 min收集菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组 DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16S rRNA扩 增通用引物1]8-27(5'-厶6厶61'1^6厶1'<：(厶〇了66(：1^厶6-3'）、1^1494-1514(5'-(^厶〇66(八6) TACCTTGTTACGAC-3'）从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段，PCR产物送上海生工生物 工程有限公司进行测序;通过BLAST软件对测定16S rRNA基因序列进行同源性比较，结 果如表1，因此，将该菌株鉴定为芽孢杆菌属sp.)。
[0016] 表1 HG03测序比对结果 买施例2 :HG03生防菌刑的制备
将芽孢杆菌属邪03(0610：如.12481)菌株接种到1^培养液中28°(：180印111振荡培养 16 h后，每隔2 h在超净工作台中取样测其在600 nm处的0D值，当0D值为0.8时结束培养，此 菌液作为种子菌液;把种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28°C、180 rpm培养48 h，然后6000 rpm离心10 min，取沉淀即得所述的生防菌剂HG03,所得生防菌剂 中活菌总浓度为1X10 8~1X10 9 CFU/mL。
[0017]实施例3:HG03生防菌剂的制备 将芽孢杆菌属邪03(0610：如.12481)菌株接种到1^培养液中28°(：180印111振荡培养 16 h后，每隔2 h在超净工作台中取样测其在600 nm处的0D值，当0D值为0.8时结束培养，此 菌液作为种子菌液;把种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，29°C、190 rpm培养44h，然后5500 rpm离心12min，取沉淀即得所述的生防菌剂HG03，所得生防菌剂中 活菌总浓度为1X10 8~1X10 9 CFU/mL。
[0018] 实施例4:HG03生防菌剂的制备 将芽孢杆菌属邪03(0610：如.12481)菌株接种到1^培养液中28°(：180印111振荡培养 16 h后，每隔2 h在超净工作台中取样测其在600 nm处的0D值，当0D值为0.8时结束培养，此 菌液作为种子菌液;把种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，30 °C、200 rpm培养40 h，然后5000 rpm离心15min，取沉淀即得所述的生防菌剂HG03,所得生防菌剂 中活菌总浓度为1X10 8~1X10 9 CFU/mL。
[0019] 当然，利用所述的防治黄瓜霜霉病的芽孢杆菌HG03制备生防菌剂并不限于以上方 法，凡是能够大量培养HG03,且保持其生防活性的方法均可用于制备本发明请求保护的生 防菌剂。
[0020] 实施例5:日光大棚试验测定HG03对黄瓜霜霉病的防效 实验地点1:淮安市码头镇黄瓜日光大棚(2015.03-2015.05) 试验共设2个处理组，分别为实施例2制备的HG03生防菌剂处理和清水对照处理;每处 理设3个小区，每个小区60棵苗，各小区随机区组排列，小区之间以保护行隔离;黄瓜种植移 栽后20 d(长出5-6片真叶），进行茎叶喷雾处理;第1次处理15天后进行第2次相同处理。施 药方法为喷雾；喷雾标准是:每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准；喷雾浓度为5 X 107 CFU/mL;出现霜霉病开始调查。
[0021] 根据GB/T17980.26-2000《杀菌剂防治黄瓜霜霉病田间药效试验准则(一）》的黄瓜 霜霉病分级标准:〇级:无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积的5%以下;3级，病斑面积占整个 叶面积的6 %~10 %; 5级，病斑面积占整个叶面积的11 %~2 5 %; 7级，病斑面积占整个叶面积的 26%~50%; 9级，病斑面积占整个叶面积的50%以上。
[0022] 病害严重度(％)= [Σ(病级数X该病级植株数)/(最高病级X总植株数）]X100%; 生防效果(％)=[(对照1病害严重度-处理组病害严重度)/对照1病害严重度]X 100%;在生 防菌剂HG03第1次处理35天后的调查结果显示，生防菌剂HG03对黄瓜霜霉病的生物防治效 果（以下简称防效)达到61.8%(见表2)。
[0023]表2生防菌剂HG03对黄瓜霜霉病的生防效果
实验地点2:淮安市丁集镇黄瓜日光大棚(2015.09-2015.11) 大田试验共设2个处理组，分别为实施例2制备的HG03生防菌剂处理和清水对照处理； 每处理设3个小区，每个小区60棵苗，各小区随机区组排列，小区之间以保护行隔离;黄瓜种 植移栽后20 d(长出5-6片真叶），进行茎叶喷雾处理；第1次处理15天后进行第2次相同处 理;施药方法为喷雾;喷雾标准是:每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准;喷雾浓度为 5X10 7 CFU/mL。出现霜霉病开始调查。
[0024]同上，根据GB/T17980.26-2000《杀菌剂防治黄瓜霜霉病田间药效试验准则（一）》 的黄瓜霜霉病分级标准，对病害进行分级和统计，计算病害严重度和防治效果。
[0025] 在生防菌剂HG03第1次处理35天后的调查结果显示，生防菌剂HG03对黄 瓜霜霉病的生物防治效果（以下简称防效)达到61.8%(表3)。
[0026] 表3生防菌剂HG03对黄瓜霜霉病的生防效果
温室实验表明：该芽孢杆菌HG03(CGMCC No. 12481)能显著降低黄瓜霜霉病的发生，在 温室条件下对黄瓜霜霉病的生防效果达52.11~61.82%。
【主权项】
1. 防治黄瓜霜霉病的生防菌株HG03,其特征是：它属于芽孢杆菌属，分类命名为 ifeciDus sp.，于2016年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保 藏号为 CGMCC No. 12481。2. 生防菌株HG03制备的生防菌剂，其特征是该生防菌剂的制备方法是：将芽孢杆菌 HG03的种子菌液以1:500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，28-30°C、180-200rpm培 养40-48 h;然后5000-6000 rpm离心10-15 min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中 活菌总浓度为1X10 8~1X10 9CFU/mL。3. 根据权利要求2所述的生防菌株HG03制备的生防菌剂，其特征是所述的保藏号为 CGMCC No. 12481的芽孢杆菌HG03种子菌液制备方法是:将保藏号为CGMCC No. 12481的芽 孢杆菌HG03菌株接种到LB培养液中28°C培养，180 rpm振荡培养至600 nm处的OD值 为0.8时结束培养。4. 根据权利要求2所述的生防菌株HG03制备的生防菌剂，其特征是所述的保藏号为 CGMCC No. 124818的生防菌株HG03制备的生防菌剂防治黄瓜霜霉病的应用方法是:所述的 生防菌剂稀释100~200倍后，在温室种植黄瓜上喷雾处理，15天为一个间隔周期共处理2 次。
【文档编号】C12N1/20GK105907689SQ201610507753
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】王云鹏, 王晓莉, 熊清平, 石莹莹
【申请人】淮阴工学院