里氏木霉qm6a及其衍生株中与交配损伤相关的基因/遗传元件及其鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及鉴定里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中与交配损伤相关的基因/遗传元件的方法，所述方法包括：a)提供第一菌株，所述菌株是具有MAT1?2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株；b)使所述菌株与第二菌株进行有性杂交，所述第二菌株是具有补充的基因座(即MAT1?1基因座)的里氏木霉(红褐肉座菌)菌株的能交配菌株；c)使来自b)中的杂交或其回交中的MAT1?1子代与a)中的第一菌株进行反复回交，直到获得与所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是携带MAT1?1基因座并且能够交配以与里氏木霉QM6a或其任何MAT1?2子代杂交的菌株；d)从步骤c)选择能够交配以与具有MAT1?2基因座的里氏木霉(红褐肉座菌)杂交的子代；以及e)通过将步骤d)中所选的子代的基因组和a)中第一菌株的基因组序列进行比较，来鉴定与交配损伤相关的基因/遗传元件，其中在第一菌株中所述基因/遗传元件完全或部分缺失，或者以突变形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中与交配损伤直接或间接相关的基因或遗传元件；本发明还涉及修正里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株的交配损伤的方法，所述菌株具有MAT1?1基因座并且不能与具有MAT1?2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株交配，其中如上鉴定的一个或多个突变的或者完全或部分缺失的基因和/或遗传元件是被相应的功能性基因和/或遗传元件替代或补充。此外，本发明涉及由此获得的木霉属真菌菌株在工业育种和目的产物的生产中的用途。此外，本发明涉及与里氏木霉QM6a和其衍生菌株的交配损伤相关的基因，并且涉及里氏木霉QM6a和其衍生菌株的交配所必需的基因。
【专利说明】
里氏木霉QM6A及其衍生株中与交配损伤相关的基因/遗传元 件及其鉴定方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及与里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6A菌株或衍生菌株的交配损伤 (mating impairment)相关的基因/遗传元件。本发明还涉及用于鉴定与里氏木霉QM6A及其 衍生菌株的交配损伤相关的基因/遗传元件的方法。所述方法使得能够快速并有效鉴定与 交配损伤相关的基因/遗传元件。因此，本发明涉及促使操作里氏木霉的工具朝向改良和便 利的菌株育种的方向发展，从而能够通过经典遗传方法改良工业生产菌株的方法。这不仅 在菌株育种和维持方面增加了其他工具，还允许引入来自里氏木霉的其他菌株(红褐肉座 菌(Hypocrea jecorina))的遗传性状，或者允许去除菌株的不想要的基因突变和/或不想 要的基因（例如赋予抗生素抗性的基因，标记基因，以及次级代谢、色素形成、不想要的酶的 基因等)。
【背景技术】
[0002] 丝状真菌能够生成大量胞外蛋白质。但是，在天然存在的菌株中任何目的蛋白质 的生产水平通常太低而无法用于商业开发，这使实质性的菌株改良方案至关重要(Punt 2002)。在工业丝状真菌中，这常规上是通过经典诱变和/或靶基因操作结合蛋白质工程来 实现。所述方法基本上由以下步骤组成:使真菌接受亚致死剂量的诱变剂(通常使用例如， 通过紫外线或电离辐射照射，添加化学诱变剂例如亚硝基甲基胍、甲基磺酸乙酯或溴化乙 锭），以及随后筛选存活菌株中所需产物的改良的生产。这种方法显然仅与选择方法一样 好。
[0003] 里氏木霉(有性型红褐肉座菌）是酶的工业生产的主要生物。通过使用随机诱变， 学术和工业研究项目在几十年中已经制备了酶产率比"原始"里氏木霉菌株QM6a高出数倍 的里氏木霉菌株，所述"原始"里氏木霉菌株QM6a于1944年从所罗门群岛的美军帐篷帆布中 分离（LeCrom et al.2009)。
[0004] 但是，使用随机突变进行菌种改良的主要限制源于以下事实:通过定义可知，其不 能被引导作用于独特的靶基因。因此，突变可能不仅是有利的并且改良或破坏靶基因，还可 能影响其他基因，导致不想要的附加损伤，导致例如菌株稳定性的限制、生长速率降低或氨 基酸和/或维生素营养缺陷型。尽管重组技术通过引入靶向焦点而克服了所述问题，但是它 们可能不适用于由未知基因或多个基因或大基因组片段引起的复杂遗传性状。
[0005] Seidl等人(2009)首先记载了里氏木霉进行有性繁殖的能力。在分类学上，里氏木 霉（以及其有性型红褐肉座菌）属于子囊菌纲（Ascomycetes)(奠壳菌纲 (Sordariomycetes))，并且在该组中属于作为异宗配合的那些真菌。异宗配合的意思是，成 功进行有性繁殖所必需的两种交配型基因座MAT1-1和MAT1-2存在于不同菌株，并且不可能 进行自体受精。
[0006] 在有性繁殖过程中，里氏木霉生成子囊壳，其由包含产囊体的卷曲结构或各种独 特结构开始。所述产囊体是在交配中接受细胞核并继续生成双核菌丝系统的细胞。在所述 卷曲（coil)内细胞中的一个作为产囊体发挥作用，其余细胞保持不活跃状态或产生会分枝 并增殖以包围整个结构的菌丝。在许多情况下，周围的菌丝也会包封所述卷曲。所述周围的 菌丝最终联合形成子囊壳的外壁或包被（peridium) (http : //website · nbm-mnb · ca/ mycologywebpages/NaturalHistoryOfF ungi/SordariomycetesDiscussion.html)(图3)〇 [0007]里氏木霉子囊壳的形成出现囊子实层(ascohymenial)，意味着子囊果形成是从产 囊体的受精开始。原基随后直接从有生殖力的产囊菌丝分化成真正的子实层。因此，所述囊 子实层发育是从生殖菌丝的受精和分化开始，然后是子囊果发育。因此，在有性繁殖中，子 座(子实体)是由作为雌性发挥功能的伴侣形成。
[0008] 由于现在用于工业中的里氏木霉的所有菌株都可以追溯到菌株QM6a，它们同菌株 QM6a-样全部携带MAT1-2基因座。因此，目前不可能使不同工业菌株相互杂交以通过引入 有利的性状或去除菌株的基因突变或不想要的基因（例如，赋予抗生素抗性的基因，编码其 存在会干扰调控需求的不想要的产物的基因）来进一步改良菌株。
[0009] 克服不能使不同里氏木霉突变菌株杂交的问题的可能性是，将配型基因座与同一 基因组基因座上的相反交配型基因座交换。对里氏木霉QM6a而言，这表示将MAT1-2基因座 与MAT1-1基因座交换。
[0010] Kang等（1994)已经证明，其中MAT基因座发生交换的稻瘟病菌（Magnaporthe grisea)菌株在与相反交配型菌株的杂交中是能育的（即，其中的MAT1-2基因座被MAT1-1基 因座替代的菌株在与原始MAT1-2携带菌株的交配中是能育的）。还记载了粗糙链孢霉 (Neurospora crassa)的交配型基因座的成功交换(Chang, 1994)。
[0011] W0 2011/095374涉及使用交配型转换以改良丝状真菌菌株的性行为。公开了鉴定 黑曲霉(Aspergillus niger)和塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)的交配型以将黑曲霉 转化为异宗配合真菌，即具有相反交配型的丝状真菌个体，产生一对或多对具有两种相反 交配型的菌株。
[0012] Seidl等（2009)将补充的交配型基因座异位引入里氏木霉菌株QM6a，从而生成携 带两个交配基因座(MAT1-1和MAT1-2)的菌株。所述菌株在与携带MAT1-1或MAT1-2基因座的 里氏木霉有性型红褐肉座菌的野生型菌株的杂交中是能育的。但是，该菌株在与菌株QM6a 及其衍生菌株(全部是MAT1-2)的杂交中是不育的。
[0013] 根据这些结果--携带两种交配型的QM6a菌株能够与红褐肉座菌的MAT1-1和 MAT1-2菌株形成子实体，但是不与QM6a形成子实体--可得出结论:里氏木霉QM6a能够作 为雄性伴侣发挥作用但是无法生成子实体，并且因此是雌性不育的。在没有用于保持交配 能力的选择压力的情况下，其在实验室中维持60年以上，这可能导致对于有性重组来说所 必需的基因中的一个或多个中的突变。
[0014]因此，在现有技术中需要允许快速并有效鉴定与里氏木霉QM6a菌株的所述交配损 伤相关的基因的方法。迄今为止，尚既未鉴定也未表征里氏木霉QM6a基因组中与交配损伤 相关的基因。其原因主要是由于以下事实：由于里氏木霉QM6a的自体不育性，尚未建立用于 里氏木霉QM6a的使用有性杂交的经典遗传方法。此外，尚不知晓哪个基因促成或导致QM6a 的自体不育性。迄今为止，完全不知晓QM6a基因组（34. lMbp)9143个注释基因 （annotated gene)中哪个与其自体不育性相关。在Martinez et al. (2008)中公开了里氏木霉QM6a的基 因组。所述里氏木霉的核苷酸序列和注释数据已经以登录号AAIL 00000000保存于 GenBanko
[0015] 本发明人最近将QM6a的MAT1-2基因座用同一基因组位置上的相反交配型基因座 (MAT1-1)局部替代，但是所得到的MAT1-1菌株与里氏木霉QM6a衍生的MAT1-2菌株的杂交不 成功，说明了自体不育性。
[0016] 因此，本发明的目的是鉴定并提供与里氏木霉QM6a菌株及其衍生菌中的交配损伤 相关的基因/遗传元件。
[0017] 本发明的另一个目的是提供快速并有效鉴定与里氏木霉QM6a中的交配损伤相关 的基因的方法。本发明的另一个目的是提供恢复里氏木霉QM6a及其衍生菌株的交配能力的 方法。本发明的另一个目的是提供里氏木霉QM6a及其衍生菌株的能交配形式（mating competent form)。本发明的另一个目的是提供有性重组里氏木霉QM6a及其衍生菌株的遗 传信息的方法。本发明的另一个目的是制备具有有性周期的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌 株。
[0018] 本发明人出乎意料地发现，里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株的交配损伤是由所述 生物的确定的基因/遗传元件以及确定的基因/遗传元件中的突变导致，并且可通过修正或 消除所述突变来进行修正，即如通过用功能性对应物来替代相应的基因/遗传元件，或者通 过插入完全或部分缺失的基因/遗传元件。所述基因/遗传元件的功能性对应物是恢复里氏 木霉QM6a交配能力的基因或遗传元件。通过修正表3中所示突变以达到使所述基因或遗传 元件在交配过程中发挥其功能的程度，而将所述能力赋予所述基因/遗传元件。优选地，改 正所述各个基因/遗传元件的所有突变。
[0019] 还发现，对于里氏木霉QM6a菌株或其任何衍生株而言，可有利地利用回交技术来 鉴定与里氏木霉QM6a菌株或其任何衍生株中的交配损伤相关的基因或遗传元件(雌性不育 性基因）。此外还已发现，某些基因中的突变与里氏木霉QM6a中的交配损伤相关。所述突变 可以是简单的点突变、插入或缺失，其中所述缺失可以是现有基因内部的缺失或者是基因/ 遗传元件本身的完全或部分缺失。
[0020] 以上基因或遗传元件/遗传信息可促成里氏木霉QM6a中的交配损伤，或者可单独 或结合地导致里氏木霉QM6a中的交配损伤。因此，所述基因/遗传元件/遗传信息可与所述 生物的交配损伤直接或间接相关。
[0021] 与里氏木霉QM6a及其衍生株的交配损伤直接相关的基因或遗传元件/遗传信息通 常是这样的基因：即该基因的全部或部分功能缺失导致在与对应的生物杂交时子实体形成 的减少或完全缺失。术语"交配损伤"涉及交配能力所有程度的损伤或减弱。减弱的交配能 力还可在相当长的时间里被观察到，直到可看见带有存活的子囊孢子的成熟子实体。对应 的基因和/或遗传元件对直接影响里氏木霉QM6a及其衍生株的交配能力的任何器官或代谢 机制具有直接影响，例如编码信息素受体的基因或编码成功交配所需器官的基因。遗传元 件包括不被翻译为蛋白质但是与里氏木霉QM6a或其衍生株的交配行为直接或间接相关的 遗传信息。所述遗传信息可以是控制或调控蛋白质表达所必需的。遗传元件可以是启动子、 增强子、激活子、调控因子或表达控制序列。
[0022]与里氏木霉QM6a及其衍生株的交配损伤间接相关的基因/遗传元件是这样的基 因，即其不与所述生物的交配损伤直接相关，但是涉及间接影响里氏木霉QM6a及其衍生株 与相应生物交配的能力的形态结构或代谢机制相关。基因（例如，与菌丝细胞壁结构或菌丝 分枝相关的基因）中的突变可对里氏木霉QM6a及其衍生株的交配能力产生间接影响。所述 基因的功能可通过所述基因编码的蛋白质来执行。所述基因/遗传元件还可以是表达或调 控相应蛋白质所必需的（例如，启动子、增强子、激活子、调控因子、起始因子、表达控制序 列)。
【发明内容】
[0023]因此，本发明涉及鉴定与里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配损伤相关的基 因/遗传元件的方法，所述方法包括以下步骤：
[0024] a)提供第一菌株，所述菌株是含有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌 株；
[0025] b)使所述菌株与第二菌株进行有性杂交，所述第二菌株是具有补充的MAT1-1基因 座的能交配的里氏木霉(红褐肉座菌)菌株；
[0026] c)使来自b)中的杂交或其回交的MAT1-1子代与a)的第一菌株进行反复回交，直到 获得与所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是携带MAT1-1基因座并且 能够交配以与里氏木霉QM6a或其任何MAT1-2子代杂交的菌株；
[0027] d)从步骤c)选择能够交配以与具有MAT1-2基因座的里氏木霉(红褐肉座菌）杂交 的子代；以及
[0028] e)通过将步骤d)中所选的子代的基因组和a)中第一菌株的基因组序列进行比较， 来鉴定与交配损伤相关的基因/遗传元件，其中在第一菌株中所述基因/遗传元件可完全或 部分缺失，或者以突变形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是与里氏木霉QM6a菌株 或其衍生菌株中的交配损伤直接或间接相关的基因或遗传元件。
[0029] 本发明还涉及如以上所述的方法，所述方法还包括以下步骤:将能交配菌株的功 能性基因和/或遗传元件--其对应于上述特征e)鉴定的与交配损伤相关的基因/遗传元 件--插入到具有MAT1-1基因座的里氏木霉QM6a或其衍生菌株中，并使所述菌株与具有 MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a或其衍生菌株杂交，从而由具有MAT1-1基因座并具有插入的 以上鉴定的基因和/或遗传元件的里氏木霉QM6a或其衍生菌株形成子实体，表明所述基因/ 遗传元件与所述交配损伤直接相关。
[0030] 本发明还涉及鉴定与功能性基因和/或遗传元件一一其对应于根据上述特征e)鉴 定的与交配损伤相关的基因/遗传元件一一相关的能交配表型的方法，所述方法包括以下 步骤:a)提供能交配的里氏木霉QM6a MAT1-1菌株;b)使上述功能性基因或遗传元件不具备 功能；以及c)测量所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的交配能力，其中所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的阳性交配能力表明所述基因或遗传元件对能交配表型而言是非必需的，并且 其中所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的阴性交配能力表明所述基因或遗传元件对能交配表 型而目是必需的。
[0031] 本发明还涉及使不能交配的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株恢复自体交配能力 (self-mating competence)的方法，其中与交配损伤相关的一个或多个突变基因或者完全 或部分缺失的基因被对应的功能性基因替代或补充。本发明还涉及通过所述方法获得或可 获得的能够自体交配的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株。
[0032] 此外，本发明涉及适用于目的产物的工业生产的木霉属（肉座菌属)真菌菌株，其 中所述菌株是里氏木霉QM6a或其衍生菌株，其中已按照上文所述修正了所述交配能力，并 且已经用靶基因和/或编码目的产物的基因进行了转化。
[0033]此外，本发明涉及通过上述方法获得的与里氏木霉QM6a菌株中的交配损伤相关的 基因/遗传元件，其具有所附序列表中SEQIDN0:8-155和SEQIDN0:163-174的序列，还涉 及由于遗传密码的简并性、同源性和/或同一性而与所述序列相关的序列，只要其发挥相同 功能。
[0034] 本发明还涉及野生型生物红褐肉座菌的对应基因，所述基因就交配能力而言是功 能性基因，并且适用于恢复里氏木霉QM6a的雌性能育性。
[0035] 具体而言，本发明涉及SEQ ID N0:8-155和SEQ ID N0:163-174的功能性对应物， 即SEQ ID N0:8-155的序列，其中表3中所列的至少一个或优选全部突变已经被修正。此外， 本发明涉及所述被修正的基因的变体和突变体，以及涉及SEQ ID N0:163-174的缺失基因 的变体和突变体，只要其保持了交配能力。变体和突变体可包含沉默或非沉默突变、插入、 缺失或序列添加。所述突变优选地为保守性突变。
[0036] 本发明还涉及红褐肉座菌的所述基因的功能性对应物，条件是所述基因仍然具有 恢复里氏木霉QM6a的雌性能育性的能力。所述功能性对应物可以是其中只有赋予不育性的 突变被修正的基因。
[0037] 本发明具体涉及具有SEQIDN0:40、SEQIDN0:110、SEQIDN0:112和SEQID N0:134的基因的功能性对应物，g卩SEQIDN0:216、SEQIDN0:218、SEQIDN0:220和SEQ ID N0:222或从其衍生的功能上等价的序列。
【具体实施方式】
[0038]所述基因和推定的编码蛋白质本身的序列是已知的，并在Martinez et al . (2008)中公开，但是迄今为止尚未证实它们与交配损伤相关的功能。此外，可以通过序列表 中说明的登录号和对应基因的进一步链接，从NCBI数据库中检索到所述基因的序列。SEQ ID 勵:26、72、82、84、94、96、100、70、106、120、130、140和154最近已经被注释。此外，尚未知 晓所述基因中的突变与交配损伤相关，具体而言是与所述生物中的雌性不育性相关。但是， 从所述数据库中不能看出，所述序列是里氏木霉QM6a或其衍生菌株中的突变序列，因此与 所述生物中交配能力的部分或完全缺失相关，以及如何将所述基因替代为功能性基因。 [0039]但是，尚不知晓所鉴定的基因与里氏木霉QM6a中的交配损伤相关。还已经发现，由 于突变、插入或缺失，所述基因与里氏木霉QM6a的交配损伤相关。用非突变和/或完整形式 的基因替代所述基因将修正里氏木霉QM6a的交配无能(mating inability)，因此允许通过 有性杂交来生产工业上重要的QM6a菌株。因此，本发明人已经发现了修正里氏木霉QM6a MAT1-1不能与里氏木霉QM6a MAT1-2交配的问题的基因。本发明人已经能够在里氏木霉 QM6a中定位基因，所述基因以其被认为是突变形式的现有形式是与所述生物的交配损伤相 关。本发明人还已经发现，里氏木霉QM6a缺失若干基因，所述基因的存在与交配能力相关， 并且所述基因的完全或部分缺失与交配损伤相关。所述交配损伤涉及里氏木霉QM6a与里氏 木霉MAT1-1生物交配能力的任何形式的完全或部分缺失，特别是涉及所述生物的雌性不育 性。因此，所述基因还可以被认为是与里氏木霉QM6a菌株雌性不育性相关的基因。通过比较 所述基因与上述方法中最终能够交配的子代的对应基因，能够找到对应的功能性基因。所 述对比揭示出哪个基因偏差或基因缺失与观察到的所述生物的交配损伤相关。因此，可将 与交配能力(具体而言是雌性交配能力）相关的基因用作模板，用于修改里氏木霉QM6a中分 别与交配损伤和雌性不育性相关的对应基因。
[0040] 术语"交配损伤"涉及里氏木霉QM6a及其衍生株与对应生物交配的任何形式的能 力损伤。所述交配损伤可以是里氏木霉QM6a及其衍生株的完全或部分交配损伤。所述交配 损伤优选地涉及里氏木霉QM6a及其衍生菌株的雌性不育性。交配损伤可涉及如图3所示的 子囊菌有性周期中任何部分或结构(例如受精、精子发生或性别决定)的缺陷。
[0041] 以上鉴定的基因和/或遗传元件与里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株直接或间接相 关。这意味着所述基因和/或遗传元件可以促成或导致各种类型的交配损伤。所述基因突变 形式中的突变、插入或缺失同样如此。所述与功能形式的偏差可导致或促成交配损伤。 [0042]因此，本发明涉及被鉴定为与里氏木霉QM6a菌株的交配损伤相关的SEQ ID NO:8-155和SEQIDN0:163-174的基因/遗传元件。序列表中的序列SEQIDN0:8-155被认为是突 变序列，如表3所示的所述序列的改变、插入和/或缺失与交配能力提高相关。
[0043]本发明还涉及SEQ ID N0:163-174的基因/遗传元件，其仅存在于红褐肉座菌中并 且在里氏木霉QM6a中没有对应物。所述序列及其对里氏木霉QM6a交配损伤的作用之前是未 知的。与所述基因序列相关的根据本发明的进一步功能性含义在表4中给出。
[0044]通过对应的功能性基因可单独或结合地修正或替代上述基因，以恢复里氏木霉 QM6a的完全交配能力。所述对应的完全功能性对应物存在于野生型红褐肉座菌MAT 1-1中， 并且通过里氏木霉QM6a MAT 1-2中所鉴定的基因和/或遗传元件的序列分别与里氏木霉 CBS1/A8_02 MAT 1-1、里氏木霉CBS2/A8-11或野生型红褐肉座菌MAT 1-1中对应基因和/或 遗传元件的序列的对比而获知。通过本身已知方法测序所述基因来提供序列。可单独或结 合地插入根据SEQ ID N0:163-174的里氏木霉QM6a中缺失的基因，以恢复里氏木霉QM6a的 交配能力。所述基因的插入可与上述对突变、插入或缺失的修正相结合。
[0045] 优选地，用对应的非突变/完整基因替代/补充以下基因 ：SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:86、SEQ ID N0:94、SEQ ID N0:96、SEQ ID N0:106、SEQ ID N0:120、SEQ ID N0:128、SEQ ID N0:163、SEQ ID N0:165、SEQ ID N0:169、SEQ ID NO: 171。其他优选的被修正/补充的基因的组是：SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、 SEQ ID N0:132、SEQ ID N0:134、SEQ ID N0:150、SEQ ID N0:152、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:126、SEQ ID N0:130、SEQ ID N0:154、SEQ ID N0:167、SEQ ID N0:168、 SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174。
[0046] 更优选地，用对应的非突变/完整基因替代/补充以下基因 ：SEQ ID NO: 36、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:112、SEQ ID N0:118、SEQ ID N0:120、SEQ ID N0:122、SEQ ID N0:124、SEQ ID N0:134、SEQ ID NO: 138、SEQIDN0:144、SEQIDN0:146、SEQIDN0:148和SEQIDN0:152。
[0047] 最优选地，用对应的非突变/完整基因替代/补充以下基因 ：SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:110、SEQIDN0:112和SEQIDN0:134。
[0048] 进一步优选的与交配能力相关的序列是：SEQ ID N0:224、SEQ ID N0:226、SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:230。
[0049] 本发明特别涉及里氏木霉QM6a或其衍生菌株的交配能力所必需的以下基因 ：SEQ IDN0:216、SEQIDN0:218、SEQIDN0:22(^PSEQIDN0:222。
[0050] 本发明还涉及所述序列的功能上等价序列，例如由于遗传密码的简并性而相关的 序列或与所述序列有一定程度的同源性(例如80%，优选90%，更优选95%或98%)的序列。
[0051] 本发明还涉及由被修正的基因/遗传元件编码的多肽，所述基因/遗传元件被鉴定 为与里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配损伤相关。
[0052] 特别地，本发明涉及由SEQIDN0:220的核苷酸888-2790、SEQIDN0:218的核苷 酸 1263-2726、SEQ ID N0:222的核苷酸990-3107或SEQ ID N0: 216的核苷酸919-6039编码 的多肽。所述多肽与交配能力相关并且对应于SEQ ID勵8:221、219、223和217。本发明还涉 及与交配能力相关，并且与SEQ ID N0:220的编码序列、SEQ ID N0:218的编码序列、SEQ ID N0:222的编码序列或SEQ ID N0:216的编码序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少 95%，甚至更优选至少98%的同一性程度的多肽，只要保持对所述突变的修正并且所述序 列与交配能力相关。
[0053]优选地，通过以下方式确定序列同一性的程度:确定参与比对并且在其他序列中 有"对应的"对应物的较短序列的残基数。对于本发明中，优选地通过使用常规算法以常规 方式确定同一性。根据本发明，用于比对的仅为cDNA或各个成熟蛋白质的氨基酸。同样，本 发明优选地通过已知的计算机程序，将相同的序列对应物确定为同源序列。所述程序的实 例是Clone Manager Suite程序，其包括程序部分Align Plus，并由Scientific& Educational Software(Durham，NC，U. S·A)发布。根据FastScan-MaxScore方法或根据 Needleman-Wunsch方法，在局部比对选项下(保持默认值)对以上确定的两个DNA序列或氨 基酸序列进行比对。根据本发明，特别使用具有功能"Compare Two Sequences/Local Fast Scan-Max Scores/Compare DNA Sequences" 或者对氨基酸而言的 "Compare Two Sequences/Global/Compare Sequences as Amino Acids" 的程序版本"Clone Manager 7Align Plus5"来计算同一"性。从而使用来自以下来源的算法:Hirschberg，D. S. 1975.A linear space algorithm for computing maximal common subsequences.Commun Assoc Comput Mach 18:341-343；Myers,E.ff.and ff.Mi 1ler.1988.Optimal alignments in linear space.CABI0S 4:1,11-17；Chao,K-M,ff.R.Pearson and ff.Miller.1992.Aligning two sequences within a specified diagonal band.CABIOS 8:5,481-487。
[0054] 本发明还涉及上述与交配能力相关的多肽的添加分子和/或缺失分子。因此，可通 过在N末端和/或C末端添加额外的序列而使根据本发明的与交配能力相关的多肽延长，以 此获得的氨基酸序列仍然具有交配能力。
[0055] 根据本发明，还可使与交配能力相关的多肽的序列片段缺失，只要保持修正后的 突变。借助本领域所熟知的方法，通过本身已知的方式来实施突变、延长和缩短。
[0056]所述变体的制备在本领域中通常是已知的。例如，通过DNA中的突变可制备多肽的 氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列改变的方法为本领域中所熟知的（例如，Tomic et al.NAR,18:1656(1990),Giebel and Sprtiz NAR,18:4947(1990))〇 [0057]不会对目的蛋白质的生物活性带来负面影响的适合的氨基酸置换的详细内容可 参见 Dayhoff et al·, Atlas of Protein Sequence and Structure , Natl .Biomed · Res .Found · ,Washington ,D · C. (1978)中的模型。优选保守性置换，例如将一 个氨基酸置换为另一个具有相似特性的氨基酸。可将这些置换分成两个主要组，总共4个亚 组，在每个亚组内的置换被称为保守性置换，所述置换优选地不影响蛋白质的活性或折叠。 [0058]
[0059]本发明还涉及被鉴定为与里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配损伤相关的 基因/遗传元件的经修正的DNA序列。特别地，本发明涉及具有或包含SEQ ID N0:220的核苷 酸888-2790或编码序列、SEQ ID N0:218的核苷酸1263-1476或编码序列、SEQ ID N0:222的 核苷酸990-3107或编码序列或者SEQ ID NO :216的核苷酸919-6039或编码序列的DNA序列。
[0060] 此外，本申请还公开了与所要求保护的核苷酸序列及所要求保护的其部分有至少 70 %同源性、优选至少80 %同源性、甚至更优选90 %同源性、特别是至少95 %同源性的那些 序列，只要所述对应序列与交配能力相关并且对突变的修正被保持。所述同源性优选地为 70-100%，更优选地为80-100%，最优选地为90-100%。所述同源性被定义为同一性的程 度。为此，优选地通过以下方式确定同一性程度:确定参与比对并且在其他序列中有"对应 的"对应物的较短序列的残基数。优选地通过使用常规算法以常规方式确定同源性。在比对 中仅考虑对应的成熟蛋白质的cDNA。同样，优选地通过已知的计算机程序，将相同的序列互 补物确定为同源序列。所述程序的实例是Clone Manager Suite程序，其包括程序部分 AlignPlus，由Scientific&EducationalSoftware(Du;rham，NC，U·S·A)发布。为此，通过 FastScan-MaxScore方法或通过Needleman-Wunsch方法在局部比对选项下(保持默认值)对 以上确定的两个DNA序列进行比对。根据本发明，特别使用具有功能"Compare Two Sequences/Local Fast Scan-Max Scores/Compare DNA Sequences" 的程序版本 "Clone Manager 7Align Plus 5"来确定同源性。因此，使用从以下来源获得的算法:Hirschberg, D.S.(1975)A linear space algorithm for computing longest common subsequences, Commun Assoc Comput Mach 18:341_343;Myers，E.W.and W.Miller.(1988)0ptimal alignments in linear space ,CABI0S 4:1,11-17；Chao,K-M,ff.R.Pearson and ff.Miller.(1992)Aligning two sequences within a specified diagonal band,CABI0S 8:5,481-487。
[0061] 本发明还涉及由于遗传密码简并性而与本发明的序列相关的DNA序列，以及其等 位基因变异。所述遗传密码简并性可由天然简并性导致，或由于特别选定的密码子选择而 导致。可通过使用分子生物学中众所周知的技术来鉴定天然的等位基因变体，所述技术例 如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。
[0062] 本发明还涉及与交配能力相关并且保持对交配损伤突变(包括序列的突变、修饰 或变异）的修正的DNA序列。此外，本发明还涉及在非严格条件(relaxed condition)或严格 条件下与上述序列杂交的序列。以下条件被认为是严格的：在65°C下，硫酸葡聚糖溶液 (GenescreenPlus，DuPont)中杂交18小时，随后在65°C下分别洗滤膜30分钟，首先用6 X 33(：、2\33(：(2次）、2\33(：(2次）、0.1%303、最后用0.2\33(：冲（膜转移和检测方法， Amersham)〇
[0063] 里氏木霉QM6a的衍生菌株是，例如，通过自身已知的技术(例如常规诱变(UV、γ放 射、亚硝基胍处理以及其他)或重组技术）以一步或多个连续步骤从里氏木霉QM6a衍生的菌 株，例如QM9123、QM9136、QM9414、MG4、MG5、RUT-C30、RUT-D4、RUT-M7、RUT-NG14、MCG77、 MCG80、M5、M6、MHC15、MHC22、Kyowa X-31、Kyowa PC-1-4、Kyowa PC-3-7、TU-6和为本领域技 术人员所知的多种其他菌株。可从已知的保藏中心获得所述菌株，例如CBS、ATCC、DSMZ。
[0064] 在本发明的用于鉴定与交配损伤相关的基因的方法中，提供了第一亲本菌株，其 为具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株。使所述菌株与第二菌株杂交，所 述第二菌株是具有补充的MAT1-1基因座的里氏木霉(红褐肉座菌）的能交配菌株。通过从来 自国际菌种保藏中心例如CBS(荷兰真菌菌种保藏中心)或ATCC(美国菌种保藏中心）的红褐 肉座菌(里氏木霉的有性型）野生型分离株中选择那些具有MAT1-1等位基因并且在与里氏 木霉QM6a及其衍生菌株杂交时形成能育的子实体的菌株，或具有MAT1-2等位基因的其他红 褐肉座菌菌株，而获得所述菌株。可通过简单的测试(例如，通过检查所获得的子囊孢子能 否萌发)来检查能育子实体的形成。所述菌株的优选实例是菌株CBS999.97 MAT1-1或任何 其他能交配的MAT1-1里氏木霉(红褐肉座菌）菌株，例如Druzhinina et al.(2010)中所列 出的菌株。
[0065]为了获得能够使用QM6a/MATl-2作为交配伴侣进行成功的有性繁殖的QM6a/MATl-1菌株，用质粒转化菌株QM6a/MATl-l，所述质粒包含被鉴定与里氏木霉QM6a/MATl-2菌株的 交配损伤相关的基因的功能性变体。使阳性转化体与里氏木霉QM6a MAT1-2进行交配测定。 通过能育的子实体的形成确认交配。通过分离子囊孢子并证明其在萌发并长成菌丝体之后 能够与相反交配伴侣进行交配，来测试所述子实体的能育性。
[0066]具体而言，在适合里氏的木霉交配条件下，共培养补充有修复的备选基因的里氏 木霉QM6a/MATl-l的阳性转化体和里氏木霉QM6a/MATl-2菌株(ATCC13631)。实施例3中给出 了示例性方案。通过从子实体分离子囊孢子，使其萌发并证明所获得的菌落能够交配，来测 试能育性。通过可见的形态学改变、细胞与细胞融合和双核体形成来验证阳性交配结果。 [0067]因为天然的红褐肉座菌MAT1-1菌株能够与里氏木霉QM6a及其衍生株杂交并生成 能育的子实体，但是MAT1-2已与MAT1-1交换的里氏木霉菌株却无法实现这一过程，因此本 发明人得出结论，里氏木霉QM6a的基因组必然包含导致该失败的某些基因组特征。因此，理 论上可通过对红褐肉座菌MAT1-1菌株之一的基因组进行测序而鉴定负责任的基因组特征 和对应的基因。但是，这种策略存在严重的障碍:里氏木霉和红褐肉座菌的野生型菌株的基 因组中存在平均为0.5-1.5%的核苷酸差异。考虑到基因组为34. IMbp，这意味着里氏木霉 和/或红褐肉座菌的任何两个野生型菌株将有170500-511500个核苷酸是不同的。尽管其中 大多数不存在于基因中，并且（即便存在于基因中的话)可导致沉默突变，但是表现出非沉 默核苷酸交换的基因的数目可能太多而无法被用来鉴定与雌性不育性相关的基因。
[0068]因此决定通过若干重复杂交--里氏木霉QM6a首先和红褐肉座菌MAT1-1杂交，随 后同来自所获得的子代的菌株杂交一一来降低所述核苷酸差异的背景。根据遗传学法则， 有性杂交的子代应该有50%基因组来自MAT1-1亲代菌株，50%基因组来自MAT1-2亲本菌 株。当这些携带MAT1-1的子代之一再次杂交时，这将使来自MAT1-1菌株的基因组含量进一 步减少50%，即在两轮杂交后为原始的25%。继续的杂交轮将获得来自原始MAT1-1基因组 的含量的 12.5%(第3轮）、6.25%(第4轮）、3.125%(第5轮）、1.56%(第6轮）、0.78%(第7 轮)和0.39% (第8轮）。鉴于里氏木霉/红褐肉座菌具有9143个注释的基因，这将待测试的备 选基因数量减少到357个，其中并非所有基因都在里氏木霉与来自第八次杂交世代的MAT1-1菌株之间存在核苷酸差异。但是，为了继续减少这个，将来自第三次杂交的子代分成两个 菌株，其分别杂交直到第八代。在每个步骤中，验证所生成的MAT1-1子代仍然能够与QM6a生 成能育的子实体的能力。
[0069] 重复进行所述回交，直到获得通过数学计算与亲代菌株(即第一菌株)基本上相同 的菌株:如果希望获得正确基因的可能性更大，可重复所述回交8个循环以上。理论上，共需 要进行19次回交以达到MAT1-1基因组的0.00014% ( = 1/9143 ;9143是里氏木霉基因组中注 释的基因的数量）。通常重复回交5-19个循环，优选6-12个循环，更优选7-10个循环，仍然更 优选8-9个循环，最优选8个循环。因此，就菌株所进行的回交次数来确定与亲代菌株基本上 相同的菌株。这意味着回交菌株与亲代菌株之间的基本同一性和以下有关:与交配损伤相 关的基因和与交配损伤不相关的基因之间的关系，这是根据回交次数通过数学计算获得。
[0070] 通过首先从子代中鉴定包含MAT1-1基因座的菌株，然后通过自身已知方法确认所 述菌株能够与里氏木霉QM6a(MATl-2)生成能育的子实体，来从上述回交中选择子代，所述 子代能够交配以与具有MAT1-2基因座的里氏木霉(红褐肉座菌)杂交，并且所述子代包含交 配损伤/雌性不育性的基因的未突变形式和/或不存在于里氏木霉QM6a中的基因/遗传信 息。
[0071] 尽管通过以上所述回交策略基本上可以获得从MAT1-1背景转移至里氏木霉QM6a 谱系的所需基因（也是雌性不育性基因）的任何组合，回交策略的使用应当与敲除策略结合 以获得仅携带补充和确定的雌性不育性基因的最小集合的能交配的QM6a菌株或其衍生株， 如按照本发明所述方法获得。
[0072]由于遗传重组的随机性，越来越不可能从MAT1-1背景保留确定的一组所需基因并 同时摆脱所有与交配不相关的不合需要的背景基因。因此，在某一后期回交世代之后，在杂 交中摆脱雌性不育性基因的可能性开始大于摆脱非交配相关基因的可能性，并且获得携带 所需雌性不育性基因的最小集合的能交配的子代的机会将是微乎其微的。因此，在回交过 程中的较早时间点停止是有利的，此时在所获得的能交配的子代中仍保留了来自与交配无 关的MAT1-1雌性不育性基因供体的许多基因。
[0073]仅通过回交策略尝试产生能交配的里氏木霉菌株的另一个缺点是，因为需要在其 中所有雌性不育性基因已经与来自MAT1-1供体基因组的许多随机的非交配相关基因一起 被组装在基因组中的阶段停止，对于这些非交配相关基因，每个系都与以相同方法产生的 另一个系不同，从而产生不想要的异质性。使用回交策略产生与交配损伤相关的备选基因 池。通过在能交配的里氏木霉QM6a MAT 1-1菌株中对每种鉴定的基因进行靶向敲除和使用 上述交配测定对所获得的里氏木霉QM6a MAT 1-1菌株的交配能力进行测定，来进一步完善 所述备选基因池。
[0074]因为在里氏木霉QM6a中可能有多于一个与交配相关的基因变得丧失功能，从而用 单个基因进行补充不会导致获得交配功能性，因此制备了能交配的里氏木霉QM6a衍生株中 的全部备选基因的敲除菌株。通过这种方式，将鉴定出任何交配所必需的基因是单独导致 QM6a的交配缺陷还是作为一组失活的交配必需基因的一部分。为了实现这一目的，优选地 制备菌株CBS1/A8_02(MAT1-1)的tku70缺失版本。所述tku70基因是里氏木霉和其他丝状真 菌中非同源末端连接(NHEJ)途径的一部分。所述tku70基因的敲除导致里氏木霉同源重组 效率提高(Guangtao et al.，2008)，因此增加了具有基因敲除（待测试其在交配中的相关 性)的菌株的数量。
[0075]可通过适合于使基因失效的任何技术来实现tku70基因和各个备选基因的敲除， 所述技术例如部分的、基本上或功能性缺失、沉默、失活或下调。优选地，将标记物插入到对 应的构建体中以鉴定对应的基因敲除生物。相应的技术在本领域中是已知的。基因敲除生 物允许研究所述敲除基因的功能，即所述生物的交配行为。
[0076] 通过这种方法，当基因敲除未消除能交配菌株CBSl/A8_02Atku70(MAT 1-1)的交 配能力时，那么所述基因就被鉴定为非交配必需的，并且随后被从里氏木霉雌性不育性的 备选基因列表中移除。
[0077]还可使用所述敲除策略来鉴定与以上鉴定的基因/遗传元件相关的不能交配的表 型。不能交配的基因敲除里氏木霉QM6a菌株为例如这样的野生型红褐肉座菌：其中例如通 过部分的、基本上或功能性缺失、沉默、失活或下调，使以上鉴定的各个基因/遗传元件不具 备功能性。相应的方法本身是已知的。
[0078]通过测序以上所选子代的基因组并将其与所述里氏木霉QM6a亲代菌株（以上所使 用的第一菌株)的基因组序列比较，来鉴定与交配损伤相关的基因。为了实现这一目的，使 用CLC Genomic Workbench(5.1版本，CLC bio,Arhus,Denmark)以及用newbler(de novo) (2.60版本，Roche/454,Brandford CT,USA)和CLC Genomic Workbench的从头拼接，以 BLAST(Altschul et al.，1990)和r2cat(Husemann and Stoye，2010)将所获得的序列比对 定位(map)至里氏木霉QM6a序列支架的支架（scaffold)上。使用定制版本的Mauve (Rissman et al.，2009)来鉴定QM6a参考序列和两个回交系的比对序列之间的单核苷酸多态性(SNP) 以及插入和缺失（Indel)。使用自定义R脚本将SNP和Indel比对定位到QM6a编码序列上。然 后手动测试备选基因的沉默突变，并且去掉导致不干扰推定蛋白质功能的保守性氨基酸交 换(例如，E和D，V和I等）的突变。所述各个突变的性质当然取决于用于回交的肉座菌菌株的 类型。因此，通过使用不同肉座菌菌株可获得所述各个基因中的不同突变。在修正里氏木霉 QM6a及其衍生菌株的交配无能的基因中鉴定的全部突变组的共同突变是在所述基因的各 个QM6a版本中可修正无法交配的突变的突变。
[0079]通过以下方法鉴定在已公开的里氏木霉QM6a基因组序列中不存在的所述回交系 中的大DNA插入序列。通过BLAST程序在回交系的不同基因组序列和QM6a之间进行核苷酸对 比，分析对比结果来鉴定QM6a基因组序列中不存在的区域，通过使用自定义R脚本来鉴定这 些序列。提取在此过程中被鉴定的序列，并使用翻译的核苷酸序列通过BLASTX搜索来搜索 NCBI的蛋白质数据库以找到具有所述序列之间相似的区域。
[0080]对所述各个突变的验证是恢复所述生物的交配能力，如以下方法证明：当具有 MAT1-1基因座的里氏木霉QM6a与相应的用于回交的相同类型的MAT1-2菌株杂交时形成具 有存活的子囊孢子的成熟子实体。
[0081] 为了获得与交配损伤直接相关的基因，将以上鉴定的基因插入具有MAT1-1基因座 的里氏木霉QM6a或其衍生菌株中并使所述菌株与具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a或其 衍生菌株杂交，借此具有MAT1-1基因座、插入所述基因的里氏木霉QM6a或其衍生菌株形成 子实体说明所述基因与所述交配损伤直接相关。以相同方式可验证遗传元件对交配行为的 促进作用。
[0082] 当然，通过上述技术不仅可以鉴定与交配损伤/雌性不育性相关的基因，还可以鉴 定与一种或多种功能上可检测的表型特征相关的任何其他靶基因。此外，在以上系统中可 以使用其他生物(例如，微生物或植物)来代替里氏木霉菌株，只要所述生物能够交配。 [0083]在现有技术的基础上，无法预期通过将在里氏木霉QM6a(MATl_2)中失去功能的与 交配损伤甚至雌性不育性相关的非突变并因此为功能性的基因重新引入到里氏木霉QM6a， 其中MAT1-2基因座已被MAT1-1基因座替代，来恢复其与里氏木霉QM6a(MATl-2)和其他 MAT1-2衍生株交配的能力。将以上鉴定的基因引入工业木霉菌株，以及用MAT1-1基因座替 代MAT1-2基因座，使得所述菌株能够与任何其他里氏木霉(MAT1-2)菌株杂交，因此允许快 速鉴定雄性和雌性不育性基因以及基本上任何目的靶基因的方法。
[0084]可使用关于表3和4中所示的序列差异与其对于改善里氏木霉QM6a交配能力的功 能性含义的相关性的知识来构建特异性探针或包括特异性探针的阵列，用于测试其他生物 中与能育性相关的基因。根据表3和4的信息，可提供载体试剂盒，以允许恢复与交配能力相 关的基因。
[0085] 本发明还涉及适用于目的产物的工业生产的木霉属（肉座菌属）的真菌菌株，其中 所述菌株已经按照上文所述而获得并且已经编码目的产物的基因转化。
[0086] 目的产物可以是具有工业应用的任何产物。实例是适用于研究目的、诊断目的、治 疗目的（例如，激素、免疫球蛋白、疫苗、抗菌蛋白（antibacterial protein)、抗病毒蛋白、 酶等）、营养目的或工艺应用的蛋白质或多肽。所述蛋白质或多肽的优选实例为食品酶 (food enzyme)，例如聚半乳糖醛酸苷酶(polygalacturonidase)、果胶甲酯酶、木糖半乳糖 醛酸苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸苷酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯聚糖酶（arabana s e/ arabinanase)、淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、转谷氨酰 胺酶等;动物饲料酶(feed enzyme)，例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、甘露聚 糖酶和蛋白酶；以及工艺酶(t e c h n i c a 1 e n z y m e)，例如纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、漆酶、氧 化还原酶等。目的产物还可以是生物聚合物。
[0087]通过以上木霉属进行的目的产物的工业生产是本领域技术人员已知的，并且是根 据为木霉属真菌菌株建立的发酵方法来实施。为了表达并分泌目的产物，在用于表达和分 泌目的产物的常规条件下培养木霉属菌株。因此，将所述真菌接种在琼脂平板上，或使其首 先在琼脂平板上生长，并将孢子悬液或菌丝悬液作为接种物用于深层发酵。在包含所需的 碳源和氮源以及微量元素和矿物盐的培养基上进行所述发酵。如果使用诱导型启动子，所 述培养基还应包含诱导剂或其前体。在控制的温度和pH值以及其他发酵条件(例如，氧化还 原电位、部分含氧量等)下进行所述发酵。其他碳源和氮源以及培养基中的其他成分的受控 管理也可实现(分批补料方法）。在发酵结束时，通过已知的物理方法从生物质中分离包含 目的产物的培养液，并在此过程中分离目的产物。
[0088]以上恢复里氏木霉QM6a的交配能力与若干独特的优势相关。所述方法允许将里氏 木霉QM6a转化成更类似于野生型的生物。所述方法允许将里氏木霉QM6a及其衍生株中的两 个或多个有利的遗传性状结合在一起。然后将所述性状转移到里氏木霉QM6a及其衍生菌株 的子代中。因此，可进一步改良现存的工业上目的化合物的高效生产菌株。还可以将使里氏 木霉菌株杂交的能力用于消除标记物基因或其他可通过其表型进行测试的不想要的基因， 例如次级代谢、色素形成、不想要的酶(例如，蛋白酶）、形态学和无性发育的基因以及其他 基因。
【附图说明】
[0089] 图1是用MAT 1 -1基因座直接替代里氏木霉QM6a菌株中的MAT 1 -2基因座的载体示意 图。使用hph基因（潮霉素抗性)作为选择性标记物。将hph盒插入到matl-1-3基因和具有转 录产物ID 59147(DNA裂解酶）的基因之间的基因间区域中。
[0090] 图2是菌株QM6a与菌株CBS/MAT1-1杂交的示意图。使每次杂交的子代(携带MAT1-1 基因座）与亲代菌株QM6a回交。提取菌株CBS1/A8-2和CBS2/A8-11的DNA并进行全基因组测 序。
[0091] 图3是子囊菌中有性和无性发育的示意图(Fazenda et al.，2008)。
[0092] 图4是基本载体构建以转化与交配损伤相关的基因的示意图。5'插入片段对应于 与交配损伤相关的不同基因一一在这里是具有转录产物ID Trire2_59740的基因。缩写： PtrPc--trpC启动子;nptll--赋予遗传霉素硫酸盐(G418)抗性的基因；TtrpC--trpC终 止子。
[0093]图5a、6a、7a和8a是被鉴定为里氏木霉QM6a交配能力所必需的功能性基因的补充 载体。图5b(SEQ ID N0:220/221)、6b(SEQ ID N0:216/217)、7b(SEQ ID N0:218/219)和8b (SEQ ID NO:222/223)涉及各个补充基因 （complementation gene)本身与功能性启动子和 终止子。所述启动子和终止子序列可以与另一个等同功能性的启动子和/或终止子序列交 换。
[0094] 以下实施例说明并解释本发明的主题。
[0095] 实施例
[0096] 实施例1
[0097] 1.材料和方法
[0098] Seidl等（2009)中所述的菌株除了含有MAT1-2基因座还含有MAT1-1基因座。所述 菌株能够与不同的携带MAT1-1和MAT1-2的野生型菌株进行有性繁殖，但是不与亲代菌株里 氏木霉QM6a(MATl-2)进行有性繁殖。为了排除仍然存在的MAT1-2基因座（其位于基因组内 的原始基因座处）导致所述菌株中的有性繁殖障碍，用从野生型菌株红褐肉座菌 (：.卩.1(.1282(6.1.3.85-249)扩增的]\^1'1-1基因座直接并同源替换里氏木霉〇163的]\^1'1-2 基因座。
[0099]为了构建载体，从红褐肉座菌1282扩增包括上游和下游同源区的MAT1-1基因座， 并将其克隆到载体pCR blunt(可从Life Technologies/Invitrogen获得）中。在第二步中， 利用AvrII限制性位点--所述限制性位点位于基因 mat 1-1-3与具有转录产物ID 59147 (核酸内切酶/DNA裂解酶）的基因之间的基因间区域中一一将赋予潮霉素抗性的hph基因 (潮霉素 B磷酸转移酶基因）亚克隆到所述载体中。图1给出了载体构建的总体示意图，表1给 出了所使用的引物的序列。表2列出了 MAT1-2替换载体中基因的准确位置。所述载体的完整 序列可参见序列表中的SEQ ID N0:7。
[0100]表1:构建用于直接MAT基因座替换的载体所使用的引物的序列
[0103] 为了转化里氏木霉QM6a，通过使用引物l_2_replace_cassette_fw和1_2_ replace_cassette_rv的PCR从所述载体扩增替代盒。每次转化反应使用10yg替代盒。所获 得的菌株一一其被命名为QM6a :MATl-2 gMATI-1,能够成功地作为MAT1-2野生型 菌株(例如，CBS999.97)的交配伴侣发挥作用，但是不能与亲代菌株里氏木霉QM6a交配。 [0104] 表2:ΜΑΤ1-2置换载体中不同基因的位置
[0107] 2.突变和缺失基因的鉴定
[0108] 为了鉴定与能够和里氏木霉MAT1-2杂交的红褐肉座菌野生型MAT1-1分离株相比 在里氏木霉中突变的基因，使用基因组测序法。因为首次尝试表明野生型分离株与QM6a(其 序列可公开获得;http: //genome · jgi-psf · org/Trire2/Trire2 · home · html)的差异大于 60000个SNP，通过QM6a与MAT1-1菌株的有性杂交然后MAT1-1子代与QM6a的重复回交循环来 去除大部分所述背景。为了实现这一目的，使菌株QM6a(MATl-2)和菌株CBS999.97(MAT1-1) 以两个独立的系进行杂交，以获得携带MAT1-1基因座的有性能力（sexually competent)的 菌株。使来自携带ΜΑΤΙ -1基因座的单个子囊孢子的培养物与亲代菌株QM6a回交数次以减少 CBS999.97特异性基因的数量，这将允许更容易地鉴定导致雌性不育性(FS)的备选基因。通 过重复此过程数代，产生和QM6a几乎相同（其基因组>99%是相同的），但是携带MAT1-1基因 座并且有性能力的两个菌株。然后对来自所述两个独立系的子代的第八代的基因组进行测 序，并且通过基因组比较来鉴定导致FS或生育力所必需的备选基因（例如，同时存在于两个 系中的CBS999.97特异性基因）。
[0109]为每个系制备两个文库，分别具有320bp和8kbp的插入片段大小。使用Covaris S2 系统（&3￥31^8，1]1。.￥〇13111'11，]\^)来使0嫩片段化并使用(>)]^911；[。1^?0?纯化试剂盒（(^38611 ; Hilden,Germany)来纯化片段。使用NEBNext DNA Sample Prep modules(New England 8101&&8，1?8?1(*，1^)，按照生产商的指示制备双末端文库。简言之，使用1(16110?和了40祖聚 合酶对片段进行末端修复，并用T4多核苷酸激酶进行磷酸化。然后使用Klenow外-DNA聚合 酶将片段3'腺苷酸化，并使用0嫩连接酶来添加111111]1；[1^接头(3(^口丨61')。使用(^38611凝胶 提取试剂盒(Qiagen; Hilden，Germany)对约400bp的连接产物进行凝胶纯化。为了避免在标 准Illumina文库制备方案中的凝胶纯化步骤中引入鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)偏向性，在室温下 而非加热条件下溶解所述凝胶切片。使用PE PCR引物1.0和2.0(Illumina，San Diego，CA) 和Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich,ΜΑ)对经过大小选择、接头修饰的 DNA片段进行PCR扩增，其方案为:聚合酶激活(98°C，30秒），然后进行10个循环的（98°C变性 10秒，65°C退火30秒，72°C延伸50秒），最后72°C延伸5分钟。纯化文库并使用Qubit HS测定 试剂盒（Invi trogen，Car lsbad，CA，USA)定量。
[0110] 在cluster station上使用TruSeq PE Cluster Kit v5进行族扩增，并且使用 TruSeq SBS 36Cycle Kits v5(Illumina，San Diego，CA)和2 X 107bp双末端方案在一个 Illumina HiSeq 2000道上对全部文库进行测序。使用测序控制软件（SCS)实时分析(RTA) v2.6和CASAVAvl.7来处理测序图像文件以产生碱基响应(base call)和phred样碱基质量 评分并且去除失败的读出(read)。
[0111] 用CLC基因组工作台（5.1版本，CLC bio,Arhus,Denmark)对所述两个系的序列进 行质量过滤，并用1^￥1316^2.60版本，1?〇(^6/454,8^11(^(^(1(：1'，1]3厶)和(^(：基因组工作台 进行从头拼接。用BLAST(Altschul et al.，1990)和r2cat(Husemann and Stoye，2010)对 所获得的支架和单拷贝重叠群（singleton contig)比对定位(map)到里氏木霉QM6a序列支 架上。使用定制版本的Mauve(Rissman et al.，2009)鉴定QM6a参考序列与两个回交系的比 对序列之间的单核苷酸多态性（SNP)以及插入和缺失（Indel)。使用自定义R脚本将SNP和 Indel比对序列到QM6a编码序列。因此获得以下赋予里氏木霉QM6a雌性不育性的基因（表 3)。此外，说明了与所观察到的里氏木霉QM6a的交配损伤相关的所述基因中的突变。表4示 出了在里氏木霉QM6a中被发现缺失的基因。表5表示通过敲除策略鉴定的与里氏木霉QM6a 中交配损伤相关的基因。
[0190] 实施例2
[0191] 鉴定与里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配损伤直接或间接相关的突变基 因。
[0192] 1.总述
[0193] 为了鉴定QM6a及其后代中与上述交配损伤直接或间接相关并且非功能性的基因， 以单独或若干基因混合物的形式将所述基因转化到其中MAT1-2基因座已被MAT1-1替代的 里氏木霉QM6a菌株中。将待测试的基因克隆到包含遗传霉素抗性标记的质粒中，并通过原 生质体转化将所述质粒转化到上述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株中。然后通过PCR分析测试有 丝分裂稳定的转化体中各个基因整合到染色体DNA中的情况。然后使阳性转化体与里氏木 霉QM6a MAT1-2进行可能的交配，并通过能育的子实体的形成进行验证(通过分离子囊孢子 并证明其能够与相反交配伴侣(opposite mating partner)进行交配来测试它们的能育 性）。以下实验方案可用于鉴定为与交配损伤相关的任何基因。
[0194] 2.制备与交配损伤相关的基因中功能缺失的菌株
[0195] 首先通过经典遗传学(杂交、回交)与比较基因组测序的组合来鉴定雌性不育性备 选基因。回交之后获得的能交配的菌株（CBS1/A8_02，MAT 1-1)和交配缺陷的初始菌株 (QM6a，MAT 1-2)之间的基因组差异根据定义必然包含交配的功能性补充所必需的全部基 因。此外，所需的FS基因必须被两个回交系(CBS1/A8_02，MAT 1-1和CBS2/A8_11，MAT 1-1) 的终点菌株所共有。此外，在能交配背景下FS基因的失活必须使功能性交配削弱。采取全部 这些步骤以获得一系列基因，当将所述基因单独或共同引入里氏木霉QM6a(MAT 1-1)中时 将重新恢复交配能力。
[0196] 因为在里氏木霉QM6a中可能多于一个与交配相关的单个基因是无功能的，因此用 单个基因进行的补充不会导致获得交配功能性，在能交配的里氏木霉QM6a衍生株中制备全 部备选基因的敲除菌株。通过这种方式，可鉴定交配所需的任何基因是单独导致QM6a的交 配缺陷还是作为一组失活的必需交配基因的一部分。为了实现这一目的，制备菌株CBS1/ A8_02(MAT1-1)的tku70缺失版本。通过使菌株CBS1/A8_02(MAT1-1)与菌株QM9414(里氏木 霉QM6a的不能交配的后代）的tku70缺失版本杂交而实现tku70基因的敲除，所述tku70缺失 版本携带吡啶硫胺氢溴酸盐（ptrA)的抗性作为选择性标记物。筛选所述杂交的后代中 MAT1-1基因座的存在和tku70缺失。以下将所获得的菌株称为CBSl/A8_02Atku70。
[0197] 通过酵母重组克隆装配由1.0-1.5kb的基因特异性侧翼区的片段构成的缺失盒， 所述侧翼区的片段被在里氏木霉gpd启动子和终止子下的赋予潮霉素(hph)抗性的基因所 中断（Colot et al.，2006)。使用寡核苷酸（10yM)5F+5R以及3F+3R，使用Phusion聚合酶 (Thermo Fisher)，从菌株CBS 999.97/MAT1-1的基因组DNA上扩增备选基因的单独的侧翼 区。使用引物hphF和hphR(hphF:GGATCCGAGAGCTACCTTAC(SEQ ID N0: 175)，hphR: CTCGAGGGTACTATGGCTTA(SEQIDN0:176))，通过PCR从质粒pLHhph(Hartletal·，2007)扩 增包括gpd启动子和终止子序列的hph基因（2.7kb)。通过PCR将约19bp序列引入侧翼区以与 酵母穿梭载体PRS426(URA+)或hph标记基因重叠，从而允许进行同源重组。为了扩增所有片 段，使用递减PCR(t 〇uchd〇wn PCR)程序，其退火温度范围为62°C至58°C。表6中给出了所使 用的寡核苷酸序列。
[0198] 通过这种方式，能交配菌株CBSl/A8_02Atku70(MAT 1-1)中在被敲除时并不消除 交配能力的基因被鉴定为不是交配必需的，并且因此被从里氏木霉雌性不育性的备选基因 列表中移除。为了这一目的，鉴定了4个基因，其缺失导致交配无能。所述基因是具有SEQ ID NO: 40、110、112和134的基因的功能性同源物。对于敲除了对应于SEQ ID NO: 40、110、112和 134基因的功能性基因的转化体而言，未发现交配。
[0199] 表6:为构建敲除载体以缺失转录产物ID 67350、76887、105832和59270的基因，用 于扩增5 '和3 '插入片段的引物的序列。
[0202]实施例3:制备已补充与交配损伤相关的基因的菌株
[0203]为了获得能够成功地与作为交配伴侣的QM6a/MATl-2进行有性繁殖的QM6a/MATl-1菌株，用质粒转化菌株QM6a/MATl-l，所述质粒包含被鉴定为与里氏木霉QM6a/MATl-2菌株 中交配损伤相关的基因的功能性变体。
[0204] 通过转化基因替代盒（其由MAT1-1基因座、标记基因和用于在里氏木霉QM6a/ MAT1-2菌株中进行同源整合的3'侧翼区组成)来构建QM6a/MATl-l菌株，所述QM6a/MATl-l 菌株用来与已鉴定的备选基因 Trire2_67350、Trire2_76887、Trire2_105832 和 Trire2_ 59270基因互补。使用引物MATl-l_InFusion fw(GTGCTGGAATTCAGGCCTGGCTTGATGCTGCTAACC TTC(SEQIDN0:193)#PMATl-l_InFusionrv(TCTGCAGAATTCAGGCCTACTCCGCAAGATCAAATCC G(SEQ ID NO: 194))，使用Phusion 聚合酶（Thermo Fisher)，从菌株 CBS999.97(MAT1-1)扩 增包含3'区域的MAT1-1基因座D使用InFusion HD克隆系统（Infusion HD Cloning System CE，Clontech)将扩增子克隆到PCR平端载体(pCR blunt，Invitrogen)中。使用在里氏木霉 gpd启动子和终止子下的赋予潮霉素抗性的基因作为选择性标记物。使用引物hph_AvrII_ fw(GTCCACAGAAGAGCCTAGGACCTCTTCGGCGATACATACTC(SEQ ID NO:195))和hph_AvrII_rv (GGCTTTCACGGACCCTAGGTTGGAATCGACCTTGCATG(SEQ ID NO: 196))，通过PCR从质粒pLHhph (Hartl et al.，2007)来扩增hph盒。然后用AvrII(Thermo Fisher)消化包含MATl-1 基因座 (包括3'侧翼区）的质粒，以通过使用InFusion克隆系统（Infusion HD Cloning System CE，Clontech)将hph盒插入到matl-1-3基因与MATl-1基因座的3'侧翼区之间。为了在里氏 木霉QM6a/MATl_2菌株中进行交配型交换，使用引物l_2_replace_cassette_fw (TGGAACGACTTTGTACGCAC(SEQ ID NO:197))和1-2_rep1ace_cassette_rv (GGCACAAGAGGACAGACGAC(SEQ ID NO: 198))，通过PCR从所述质粒来扩增所述基因替代盒。 然后通过原生质体转化(Gruber等，1990)来转化所述基因替代盒。在每次转化中使用10yg DNA。以下将所获得的菌株称为QM6a/MATl-l。
[0205] 为了补充QM6a菌株的交配缺陷，将新鉴定的备选基因 Trire2_67350、Trire2_ 76887和Trire2_105832的野生型(CBS999.97)等位基因异位地引入QM6a/MATl-l菌株中。 [0206]对于异位基因整合，构建包含所述备选基因的野生型（CBS999.97)等位基因以及 赋予对遗传霉素二硫酸盐G418的抗性的基因（nptll)的质粒。选择从维也纳技术大学化学 工程研究所基因技术和应用生物化学研究方向的载体保藏中心获得的质粒pPki-Gen(未公 布)作为转化载体。所述质粒衍生自质粒pRLMex30(Mach etal.，1994)。用Xbal和Hindlll (Thermo Fisher Scientific/Fermentas，St.Leon-Rot，Germany)消化质粒pRLMex30，去除 hph编码区和cbh2终止子区（2066bp)，从而留下pkil启动子。接下来使用引物GenFW (CCTCTTAACCTCTAGACGGCTTTGATTTCCTTCAGG)(SEQ ID NO: 1 56 )和GenRV (TGATTACGCCAAGCTTGGATTACCTCTAAACAAGTGTACCTGTG)(SEQ ID NO:157)从pII99(Namiki et al.，2001)扩增包含约800bp trpC启动子、nptll编码区和约700bp trpC终止子的2.4kb 片段。通过InFusion重组(Clontech, USA)将所述两个片段连在一起，得到质粒pPki-Gen。 nptll基因赋予对遗传霉素二硫酸盐G418的抗性，其之后被用来选择真菌转化体。
[0207]在接下来的步骤中，用EcoRI和Xbal (Thermo Fisher Scientif ic/Fermentas， St .Leon-Rot，Germany)消化所述质粒pPki-Gen以去除pkil启动子(约740bp)。通过PCR从菌 株CBS999.97/MAT1-1扩增被鉴定为导致交配损伤的基因（即Trire2_67350、Trire2_76887、 Trire2_105832 和 Trire2_59270)，并通过 In-Fusion 重组（Clontech, USA)将所述基因引入 cut载体中。表7中给出了用于扩增各个基因的寡核苷酸。所获得的质粒的完整序列在SEQ ID N0:212-215和图5-8中给出。
[0208] 表7:为构建载体以补充里氏木霉QM6a菌株的交配缺陷，用来从菌株CBS999.97扩 增备选基因的野生型等位基因的引物的序列。
[0211] 然后使用包含各个备选基因的环状质粒，通过原生质体转化(Gruber et al.， 1990)来转化QM6a/MATl-l菌株。因为不知道导致交配缺陷的是单个基因还是各个备选基因 的组合，因此以单独的以及组合的方式转化所述备选基因。每次转化反应使用l〇yg环状质 粒。在总计6ml原生质体悬液中，将每lml原生质体悬液加到4ml覆盖培养基（overlay medium)中，所述培养基包含浓度为lOOμg/ml的遗传霉素硫酸盐G418。然后将各个溶液倾倒 在包含麦芽浸出液琼脂(2%w/v)的琼脂平板上，所述琼脂中已添加了浓度为100μg/ml的遗 传霉素硫酸盐G418以选择真菌转化体。在28 °C下和黑暗中孵育所述平板7天。然后将可能的 转化体转移到包含马铃薯葡萄糖琼脂(Difco，USA)的新平板，所述琼脂具有lOOμg/ml的遗 传霉素硫酸盐G418以选择真菌转化体。
[0212] 然后通过PCR分析来测试有丝分裂稳定的转化体中各个基因整合到染色体DNA中 的情况。根据Liu等(2000)提取染色体DNA。为了测试所述基因的阳性整合，使用基因特异性 弓丨物和在nptll盒中结合的引物。表8给出了其序列。
[0213] 表8:用于补充了各个雌性不育性备选基因的野生型等位基因的菌株QM6a/MATl_l 的基因分型的引物的序列。
[0215]然后使阳性转化体与里氏木霉QM6a MAT1-2进行交配测定。通过能育的子实体的 形成来验证交配。通过分离子囊孢子并证明其在萌发并长成菌丝体之后能够与相反交配伴 侣进行交配，来测试其能育性。
[0210]为了验证交配能力的恢复，在交配测定中测试阳性转化体。在PDA(Dif co?，马铃薯 葡萄糖琼脂）平板上进行交配测定，在所述平板上共同培养里氏木霉野生型菌株QM6a/ MAT1-2(ATCC 13631)和补充有修复的备选基因的里氏木霉QM6a/MATl-l的阳性转化体。在 室温下(20-23Γ)将平板持续暴露于天然昼夜节律的光照周期，以促使子实体形成。通过从 子实体中分离子囊孢子并证明由其生长成的菌落能够与相反交配伴侣进行交配，来测试所 述子实体的能育性。
[0217] 表9示出了各个雌性不育性基因和对应经修正的并从而具备功能性的序列的相 关性
[0218]
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[0238] Seidl et al·，2009: Sexual development in the industrial workhorse Trichoderma reesei.PNAS 106(33)，pp.13909-13914.
【主权项】
1. 一种用于鉴定里氏木霉(Trichoderma reesei )QM6a菌株或其衍生菌株中与交配损 伤相关的基因/遗传元件的方法，所述方法包括以下步骤： a) 提供第一菌株，所述菌株是具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株； b) 使所述菌株与第二菌株进行有性杂交，所述第二菌株是具有补充的MAT1-1基因座的 里氏木霉(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))的能交配的菌株； c) 使来自b)中的杂交或其回交的MAT1-1子代与a)的第一菌株进行反复回交，直到获得 与所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是携带MAT1-1基因座并且能够 交配以与里氏木霉QM6a或任何其MAT1-2子代杂交的菌株； d) 从步骤c)选择能够交配以与具有MAT1-2基因座的里氏木霉(红褐肉座菌）杂交的子 代；以及 e) 通过将步骤d)中所选的子代的基因组和a)中第一菌株的基因组序列进行比较，来鉴 定与交配损伤相关的基因/遗传元件，其中在第一菌株中所述基因/遗传元件可完全或部分 缺失，或者以突变形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是与里氏木霉QM6a菌株或其 衍生菌株中的交配损伤直接或间接相关的基因或遗传元件。2. 根据权利要求1的方法，所述方法还包括将能交配菌株的功能性基因和/或遗传元 件一一其对应于权利要求1鉴定的与交配损伤相关的基因/遗传元件一一插入到具有MAT1-1基因座的里氏木霉QM6a或其衍生菌株中，并使所述菌株与具有MAT1-2基因座的里氏木霉 QM6a或其衍生菌株杂交，籍此由具有MAT1-1基因座并具有插入的所述功能性基因和/或遗 传元件的里氏木霉QM6a或其衍生菌株形成子实体，表明所述基因/遗传元件与所述交配损 伤直接相关。3. -种用于鉴定与功能性基因和/或遗传元件一一其对应于权利要求1的方法鉴定的 与里氏木霉QM6a或其衍生菌株的交配损伤相关的基因/遗传元件一一相关的能交配表型的 方法，所述方法包括以下步骤： a) 提供能交配的里氏木霉QM6a MAT 1-1菌株； b) 使上述功能性基因或遗传元件不具备功能；以及 c) 测量所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的交配能力，其中所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌 株的阳性交配能力表明所述基因或遗传元件对能交配表型而言是非必需的，并且其中所述 里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的阴性交配能力表明所述基因或遗传元件对能交配表型而言是 必需的。4. 权利要求1 _3中任一项的方法，其中所述衍生自里氏木霉QM6a的菌株选自QM9123、 QM913 6、QM9414、MG4、MG5、RUT-C30、RUT-D4、RUT-M7、RUT-NG14、MCG7 7、MCG80、M5、M6、MHC15、 MHC22、Kyowa X_31、Kyowa PC-l_4、Kyowa PC-3-7、TU_6以及其衍生菌株。5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第二菌株是CBS999.97 MAT1-1。6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述回交重复7-19个循环。7. 权利要求6的方法，其中所述回交重复8-9个循环。8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中所述与交配损伤直接或间接相关的基因/遗传元 件选自SEQ ID N0:8-155和SEQ ID N0:163-170。9. 权利要求8的方法，其中所述与交配损伤直接或间接相关的基因/遗传元件是选自以 下的基因/遗传元件：SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:112、SEQ ID N0:118、SEQ ID N0:120、SEQ ID N0:122、 SEQ ID N0:124、SEQ ID N0:134、SEQ ID N0:138、SEQ ID N0:144、SEQ ID N0:146、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152。10. 权利要求8的方法，其中所述与交配损伤直接或间接相关的基因/遗传元件是选自 SEQIDN0:40、SEQIDN0:110、SEQIDN0:112和SEQIDN0:134的基因/遗传元件。11. 一种关于修正里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株的交配损伤的方法，所述菌株具有 MAT1-1基因座并且不能与具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株交配，其中 通过权利要求2-8中任一项的方法鉴定的一个或多个突变的或者完全或部分缺失的基因 和/或遗传元件是被相应的功能性基因和/或遗传元件替代或补充。12. 权利要求11的方法，其中所述被替代或补充的基因和/或遗传元件选自SEQ ID N0s:8-155或SEQ ID N0s:163-174,并且其中所述被修正的突变、插入或缺失选自表3。13. 权利要求12的方法，其中所述被替代或补充的基因和/或遗传元件选自SEQ ID NO: 36、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:112、SEQ ID N0:118、SEQ ID N0:120、SEQ ID N0:122、SEQ ID N0:124、SEQ ID NO: 134、SEQIDN0:138、SEQIDN0:144、SEQIDN0:146、SEQIDN0:148和SEQIDN0:152。14. 权利要求12的方法，其中所述被替代或补充的基因和/或遗传元件选自SEQ ID NO: 40、SEQIDN0:110、SEQIDN0:112和SEQIDN0:134。15. -种通过权利要求11 -14中任一项的方法获得的里氏木霉QM6a或其衍生菌株的能 够自体交配的真菌菌株。16. -种适用于目的产物的工业生产的木霉属（肉座菌属）的真菌菌株，其中所述菌株 是已根据权利要求11-14中任一项的方法获得，并且已经用编码目的产物的基因转化。17. 根据权利要求16的真菌菌株用于目的产物的工业生产的用途。18. 权利要求16的菌株或权利要求17的用途，其中所述目的产物选自食品酶、饲料酶、 工艺酶、激素、免疫球蛋白、疫苗、抗菌蛋白或抗病毒蛋白。19. 与里氏木霉QM6a或其衍生菌株中的交配损伤相关的基因/遗传元件，其具有SEQ ID NO :8-155或SEQ ID NO :163-174的序列。20. 与里氏木霉QM6a或其衍生菌株中的交配损伤相关的基因/遗传元件，其具有SEQ ID N0:40、SEQIDN0:110、SEQIDN0:112或SEQIDN0 :134的序列或从其衍生的功能等价序 列。21. 里氏木霉QM6a或其衍生菌株的交配能力所必需的基因或遗传元件，其具有SEQ ID N0:216、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:220、SEQ ID N0:222或SEQ ID N0:224、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230的序列或从其衍生的功能等价序列。
【文档编号】C12N15/80GK105980565SQ201380068881
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2013年12月23日
【发明人】C·P·库比切克, R·林克, B·赛博斯, T·哈曼, P·劳伦茨
【申请人】Ab酶有限公司