，试剂管中阴性对照的体积为0.lml，试剂管规格为0.5mI ο
[0045]所述的胞苷脱氨酶基因⑶A单核苷酸检测反应液包括50mM的三羟甲基氨基甲烷、255mM的氯化钾、0.45mM的三磷酸核糖核苷酸混合液、I 1nM的上游引物和下游引物、10nM的A79C和G208A两个检测位点的野生型和突变型检测探针、3U脱氧核糖核酸聚合酶、1.5U尿嘧啶-N-糖基化酶、4.5mM/L氯化镁。
[0046]所述的胞苷脱氨酶基因CDA单核苷酸多态性检测引物包括:
[0047]厶79(:上游引物，其序列为:5’-丁厶0^厶0厶丁6600^6厶厶6(:-3’；
[0048]厶79(:下游引物，其序列为:5’-6(:11^00^66厶6666厶6厶厶-3’；
[0049]6208厶上游引物，其序列为:5’-丁厶6厶厶厶厶丁60^60^001；(:1'-3’；
[0050]6208厶下游引物，其序列为:5’-厶1'1'1^^6660厶厶1760^1^6(:-3’。
[0051 ]所述的胞苷脱氨酶基因CDA单核苷酸多态性检测探针包括:
[0052]A79C野生型检测探针，其序列为:5 ’-TGCTCCCAGGAGGCCAAGAAGTCA-3 ’，其5 ’端标记物为J0E，3’标记物为BHQ1;
[0053]A79C突变型检测探针，其序列为:5 ’-TGCTCCCAGGAGGCCAAGCAGTCA-3 ’，其5 ’端标记物为CY5，3 ’标记物为BHQ2 ；
[0054]G208A野生型检测探针，其序列为:5 ’-AACGGACCGCTATCCAGAAGGCCGT-3 ’，其5 ’端标记物为ROX，3 ’标记物为BHQl ；
[0055]G208A突变型检测探针，其序列为:5 ’-AACGGACCACTATCCAGAAGGCCGT-3 ’，其5 ’端标记物为TAMRA，3 ’标记物为BHQ2。
[0056]所述的装有胞苷脱氨酶基因CDA单核苷酸多态性检测反应液的试剂管、装有多个阳性对照和阴性对照的试剂管均放置于海绵衬垫上的容器孔，海绵衬垫放置于试剂盒内。
[0057]所述的海绵衬垫上有8个容器孔，分为两排排列，每排均为4个。
[0058]本实用新型所述的胞苷脱氨酶基因CDAA79C和G208A位点单核苷酸多态性检测方法如下:
[0059]1、从试剂盒中取出胞苷脱氨酶基因CDA单核苷酸多态性检测反应液，室温解冻，完全融化后，轻轻振荡混匀，并作短暂离心备用；
[0060]2、取待检测样本，优选为全血样本，常规提取基因组DNA，取5yL作为模板；
[0061 ] 3、反应液分装，反应体系为40yL，每反应总体积(40yL) =PCR反应液(35yL)+模板(5yL)；
[0062]4、加样，在准备好试剂的PCR反应管中分别加入阴性对照、待测样本DNA、阳性对照各5yL，盖紧管盖后，瞬时低速离心；
[0063]5、PCR扩增优选ABI 7500荧光PCR仪:
[0064]5.1、样品设置:在仪器软件的相应样本设置窗口内填写各样本的名称、类型；
[0065]5.2、荧光通道选择:每个样品选择JOE、CY5、ROX和T層RA 4个通道；
[0066]5.3、反应条件设定:反应体积设定为40yL，37 °CUNG酶反应5分钟，95 °C预变性5分钟，95 °C 15秒，60 °C I分钟，扩增反应为40个循环。
[0067]6、结果分析:
[0068]将Baseline设为3_15(根据实际情况，Baseline Cycler可在一定范围内变化)，焚光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值显示为Undet。使用仪器配套软件自动分析结果；
[0069]7、质控标准
[0070]7.1、阴性对照:JOE、CY5、ROX和TAMRA 4个通道均无明显扩增曲线，且Ct显示为Undet；
[0071]7.2、八79(:野生型阳性对照:<1(^通道有扩增曲线，且(^〈36;0￥5、1?(^和了八11^通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet;
[0072]7.3、A79C突变型阳性对照:CY5通道有扩增曲线，且Ct〈36; J0E、R0X和TAMRA通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet;
[0073]7.4、六79(:杂合子阳性对照:1(^、0￥5通道有典型的扩增曲线，且(^〈36;1?(^和了六11^通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet;
[0074]7.5、G208A野生型阳性对照:ROX通道有扩增曲线，且Ct〈36 ； JOE、CY5、TAMRA通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet;
[0075]7.6、G208A突变型阳性对照:TAMRA通道有扩增曲线，且Ct〈36 ； JOE、CY5、ROX通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet;
[0076]7.7、G208A杂合子阳性对照:ROX和TAMRA通道有典型的扩增曲线，且Ct〈36 ； JOE、CY5通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet;
[0077]7.8、上述7个条件必须同时满足，否则，本次试验无效。
[0078]8、检验结果解释:
[0079]当JOE通道有扩增曲线，且Ct〈36 ； CY5、ROX和TAMRA通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet，则检测结果为A79C野生型；
[0080]当CY5通道有扩增曲线，且Ct〈36 ； JOE、ROX和TAMRA通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet，则检测结果为A79C突变型；
[0081 ] 当JOE、CY5通道有典型的扩增曲线，且Ct〈36 ； ROX和TAMRA通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet，则检测结果为A79C杂合子；
[0082]当ROX通道有扩增曲线，且Ct〈36 ； JOE、CY5、TAMRA通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet，则检测结果为G208A野生型；
[0083]当TAMRA通道有扩增曲线，且Ct〈36 ； JOE、CY5、R0X通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet，G208A突变型；
[0084]当ROX和TAMRA通道有典型的扩增曲线，且Ct〈36 ； JOE、CY5通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示为Undet，G208A杂合子。
[0085]在实验有效的前提下，结果分析如下:
[0086]本实用新型中对样本的检测结果如图2(A79C位点野生型、G208A位点野生型样本)，图3(A79C位点野生型、G208A位点突变型样本)，图4(A79C位点野生型、G208A位点杂合子样本)，图5(A79C位点突变型、G208A位点野生型样本)，图6(A79C位点突变型、G208A位点突变型样本)，图7(A79C位点突变型、G208A位点杂合子样本)，图8(A79C位点杂合子、G208A位点野生型样本)，图9(A79C位点杂合子、G208A位点突变型样本)，图10(A79C位点杂合子、G208A位点杂合子样本)所示，结果分析依据【具体实施方式】7和8。
[0087]在此说明书中，本实用新型已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
[0088]综上所述，本实用新型结构简单、使用方便、设计合理、检测过程不易受污染，该试剂盒在胞苷脱氨酶基因CDA单核苷酸多态性检测时具有敏感性强、特异性强、耗时短、方便运输等优点。
【主权项】
1.一种胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括盒体1、海绵衬垫2，所述的海绵衬垫2置于盒体I内，海绵衬垫2上设有的容器孔装有多个装有试剂的试剂管，分别为装有胞苷脱氨酶基因多态性扩增检测反应液的试剂管3、装有A79C野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照的试剂管4-6、装有G208A野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照的试剂管7-9、装有阴性对照的试剂管10。2.根据权利要求1所述的一种胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒，其特征在于，所述海绵衬垫2上的容器孔有8个，每个容器孔分别为装有胞苷脱氨酶基因多态性扩增检测反应液的试剂管3、装有A79C野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照的试剂管4-6、装有G208A野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照的试剂管7-9、装有阴性对照的试剂管10。3.根据权利要求1所述的一种胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒，其特征在于，所述的海绵衬垫2上的8个容器孔分为两排排列，每排均为4个。
【专利摘要】本实用新型公开了一种胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒,其包括盒体1、海绵衬垫2，所述的海绵衬垫2置于盒体1内，海绵衬垫2上设有的容器孔装有多个装有试剂的试剂管，分别为装有胞苷脱氨酶基因多态性扩增检测反应液的试剂管3、装有A79C野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照的试剂管4-6、装有G208A野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照的试剂管7-9、装有阴性对照的试剂管10。该实用新型试剂盒将与吉西他滨毒副作用相关的胞苷脱氨酶基因两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内,使用更方便而且成本更低,进而使得评估个体与相关药物的毒副作用也变得更便捷。
【IPC分类】C12Q1/68, C12M1/34
【公开号】CN205368374
【申请号】CN201620067521
【发明人】卿志荣, 郑帮
【申请人】上海睿玻生物科技有限公司
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2016年1月25日