专利名称：一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米稀土荧光材料，具体地说是一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用。
背景技术：
纳米尺度上的生物分析化学是纳米生物技术的最主要发展方向之一，是当今国际生物分析科学领域的研究前沿及发展方向，是各国的研究热点。功能性纳米荧光材料是近年来纳米材料研究中的一个新生长点，其应用焦点目前主要集中在生物技术领域如生物大分子的单分子原位检测、荧光显微镜检测、免疫组织化学、细胞化学等。现在已报道的技术及其存在的问题包括如下几个方面(1)纳米级ZnS-CdSe荧光微粒(又称量子点)技术(文献1Warren C.W.Chan and Shuming Nie，Science，1998，281，2016-2018)。量子点的发明，开创了纳米荧光微粒作为标记物应用的新领域。但是量子点在水中分散不好、易结块、发光不稳定易闪烁，所以目前尚未广泛应用。
(2)纳米级高分子塑料荧光微粒技术(文献2Harri Hrm，Tero Soukka，Timo Lvgren，Clin.Chem.，2001，47，561-568；文献3赵艺强，高海峰，杨武利，府寿宽，荧光标记的高分子微粒及其制备方法，中国专利，
公开日2001年1月3日，公开号CN1278534A)。纳米级高分子塑料荧光微粒又可以分为两类一类是用聚苯乙烯内包铕与β-二酮类荧光配合物的纳米塑料荧光微粒，该类高分子塑料微粒在水中易凝集，而在有机溶剂中高分子又易溶胀而导致微粒内荧光分子泄漏；另一类是以聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯类、聚丙烯酰胺类为微粒主体，表面键合或吸附荧光素(Fluorescein，如FITC等)、若丹明(Rhodamine，如Rhodamine 6G)、青色素(Cy染料)等荧光物质的纳米荧光微粒。此类纳米荧光微粒除了第一类高分子塑料微粒的不足之外，由于微粒表面键合或吸附的是常规荧光物质，因此还存在常规荧光测定时各种散乱光和背景荧光干扰，阻碍了检测灵敏度的提高。
(3)内含三(联二吡啶)钌荧光配合物的纳米级硅胶微粒技术(文献4Swadeshmukul Santra，Peng Zhang，Kemin Wang，Rovelyn Tapec，and WeihongTan，Anal.Chem.，2001，73，4988-4993；文献5Swadeshmukul Santra，KeminWang，Rovelyn Tapec，Weihong Tan，Journal of Biomedical Optics，2001，6(2)，160-166；文献6谭蔚泓，王柯敏，肖丹，核壳型纳米颗粒，中国专利，
公开日2002年4月3日，公开号CN1342515A)。该法以三(联二吡啶)钌荧光配合物为核，二氧化硅为外壳制备了大小均匀的纳米荧光微粒。与传统方法相比较，该法制得的纳米球的耐氧化、耐光稳定性都有显著提高，应用于识别人外周血中SmIgG+B淋巴细胞，结果与异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体或SPA检测值相近。但是此类纳米荧光微粒的发光内核-三(联二吡啶)钌荧光配合物所发出的仍然是常规荧光，无法从根本上彻底排除各种散乱光和短寿命荧光对测定的干扰。
稀土荧光化合物的荧光具有非常特殊的性质，其最大的特征是荧光寿命非常长。基于这一特征，以稀土荧光化合物作为标记物的时间分辨荧光免疫测定法的生物检测技术近20年来已经取得了重大的进展，在医学与生命科学的实践与研究中发挥着越来越重要的作用。时间分辨荧光生物检测技术的最大优点就是可完全消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度。但是稀土荧光化合物直接作为标记物使用的不利之处是这类化合物一般荧光量子产率都较小，荧光较弱，虽然采用时间分辨荧光测定法已极大地提高了这类化合物的荧光测定灵敏度，但仅从改进稀土荧光标记物的荧光量子产率进而大幅度提高时间分辨荧光生物检测技术的灵敏度，已经不太可能。由于纳米荧光微粒中可内包较高浓度的荧光化合物，理论上以纳米荧光微粒作为标记物使用可以解决较弱荧光化合物直接作为标记物使用时测定灵敏度较低的问题，但许多荧光化合物由于存在浓度消光的问题，不适用于制备内含较高浓度荧光化合物的纳米荧光微粒。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种无散乱光和短寿命荧光干扰、高灵敏度的功能性纳米稀土荧光微粒(Lanthanide FluorescenceNanoparticles，简称LFNP)及其制备。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下功能性纳米稀土荧光微粒以稀土荧光配合物为发光中心，采用化学包裹成粒技术制备而成，并且纳米球表面具有化学结合功能的官能团；具体为以稀土离子与含有2，2’6’，2”-联三吡啶骨架结构或2，6-二吡唑基吡啶骨架结构类配位体和β-二酮类配位体形成的荧光配合物为发光内核，其所述配位体的化学结构式如下
有机配位体的结构式中R、R1及R2为各种芳香烃类取代基及脂肪烃类取代基，R3为-H或氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)等取代基；其中较为常用的取代基为 等，R1为各种芳香烃类取代基，如噻吩基、苯基、萘基、菲基等，R2为-CF3，-C2F5，-C3F7等脂肪烃类取代基；其中所述的稀土离子为三价铕(Eu3+)，铽(Tb3+)，钐(Sm3+)及镝(Dy3+)离子；其制备方法为采用化学包裹成粒技术制备而成，即采用硅胶聚合成粒技术制备包裹稀土荧光配合物的纳米硅胶荧光微粒的制备技术及在该技术所制备纳米硅胶荧光微粒表面导入活性官能团的表面修饰技术；将稀土荧光配合物用化学包裹成粒，具体地说就是采用正硅酸乙酯(TEOS)，以环己烷为油相，聚氧乙烯基辛基苯基醚(Triton X-100系列)、聚氧乙烯基壬基苯基醚(NP-5系列)为表面活性剂，乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇、正癸醇等为助表面活性剂和水形成的反相微乳液体系，加入上述的稀土荧光配合物，以氨水引发聚合，在纳米微粒制备过程中或制备完成后导入活性基团从而制备成可以发出强荧光的并且具有生物结合功能荧光纳米微粒；微粒表面导入活性官能团的表面修饰技术方式为
a.在引发聚合过程中加入3-巯基丙基三烷氧基硅或3-氨基丙基三烷氧基硅使之生成功能性荧光纳米微粒，纳米微粒表面具有可供化学结合的-SH或-NH2活性基团；b.在引发聚合成荧光纳米微粒后，加入CNBr与纳米球表面的硅羟基发生共价结合反应，同时与生物分子上的-NH2发生反应，从而实现其化学结合功能；c.在引发聚合成荧光纳米微粒后，加入3-巯基丙基三烷氧基硅、3-氨基丙基三烷氧基硅等硅烷化试剂与纳米球表面的硅羟基反应，使荧光纳米球表面带有可供化学结合的-SH、-NH2活性基团，形成具有化学结合功能荧光纳米微粒；本发明的另一目的是功能性纳米稀土荧光微粒在应用于物理、化学以及生命科学领域应用；本发明的纳米稀土荧光微粒具有与生物分子等结合的功能，其可以广泛地应用于时间分辨荧光生物检测技术(即应用于时间分辨荧光测定法中)，如时间分辨荧光免疫测定、DNA杂交测定、细胞识别、时间分辨荧光显微镜成像测定、单细胞原位测定、生物芯片等，进而确立基于纳米稀土荧光材料作为标记物的时间分辨荧光生物检测技术平台；其中所述的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法，时间分辨荧光DNA杂交测定法，时间分辨荧光显微镜成象测定法，时间分辨荧光细胞活性测定法或时间分辨荧光生物芯片测定法。
本发明具有如下优点(1)完全解决常规纳米荧光材料作为标记物使用时存在非常强散乱光的问题。使用本发明纳米稀土荧光微粒作为标记物的时间分辨荧光测定法可完全消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度。
(2)显著提高作为标记物使用时的稳定性，解决荧光漂白问题。本发明采用的稀土配合物本身是一种光比较稳定的物质，但在需要强光测定的场合，如荧光显微镜测定时，依然会发生荧光漂白现象(发射光强度随光照时间增加而衰减的现象)，不能很好的满足测定的需要；稀土荧光配合物分子经成粒技术制成纳米球以后，其光稳定性显著增强。
(3)避免标记物大量使用时的“浓度消光”现象。许多荧光化合物当浓度较高时，就会发生浓度消光的问题，不适用于制备内含较高浓度荧光化合物的纳米荧光微粒。由于本发明采用稀土荧光化合物的荧光Stokes位移(最大发射波长与最大激发波长之间的位移)非常大，在毫摩尔浓度水平仍然基本不存在浓度消光的问题(荧光素等有机荧光化合物在微摩尔浓度水平即发生浓度消光)，所以非常适用于纳米荧光微粒的制备。
(4)突破性地解决了强稀土荧光配合物直接标记的难点。本发明采用2，2’6’，2”-联三吡啶骨架结构或2，6-二吡唑基吡啶骨架结构类配位体与稀土离子铕、铽等具有非常强的荧光，但是这些稀土配合物没有直接用于标记的官能团，不能直接用于生物分子的标记；本发明以其为发光内核，制成纳米微粒以后，对纳米微粒表面进行化学修饰，可以引入用于标记的官能团，成功地解决了这一难题。
(5)本发明采用正硅酸乙酯(TEOS)聚和后生成的SiO2为包裹介质，一方面由于硅的纳米颗粒密度较大，易于制备分离；另一方面，生成的纳米硅球本身是透明的，不会对球内荧光物质所发射的荧光产生太大的屏蔽衰减作用，而且硅球表面残留的硅羟基也易于进行表面修饰，为进一步与生物分子结合创造了有利的条件；此外还有一点就是硅介质耐有机溶剂，纳米球内的荧光物质不易发生泄漏，解决了聚苯乙烯塑料等为包裹介质的稀土荧光纳米微粒在这方面的不足。
(6)本发明建立以硅纳米稀土荧光材料为标记物的高灵敏度时间分辨荧光生物检测技术。由于稀土纳米荧光微粒作为标记物使用才刚刚起步，随着研究的不断深入，稀土纳米荧光标记物必将在高灵敏度检测方面，尤其是以时间分辨荧光显微镜为检测手段的免疫组织化学等领域将会有着不可估量的作用。
图1是内含铕配合物TTTA-Eu3+的LFNP的透射电子显微镜照片。
图2是内含铕配合物TTTA-Eu3+的LFNP的常规荧光光谱和时间分辨荧光光谱。
图3是内含铕配合物TTTA-Eu3+的LFNP标记链亲合素的时间分辨荧光光谱。
图4是内含铕配合物TTTA-Eu3+的LFNP的光稳定性实验结果图。
图5是用LFNP标记链亲和素(SA)的反应原理图。
图6是用内含铕配合物TTTA-Eu3+的LFNP标记链亲合素测定人血清中甲胎蛋白(AFP)的原理图。
图7是用内含铕配合物TTTA-Eu3+的LFNP标记链亲合素测定人血清中甲胎蛋白(AFP)的工作曲线。
图8是内含铽配合物BPTA-Tb3+的LFNP的透射电子显微镜照片。
图9是内含铽配合物BPTA-Tb3+的LFNP的常规荧光光谱和时间分辨荧光光谱。
图10是内含铽配合物BPTA-Tb3+的LFNP标记链亲合素的时间分辨荧光光谱。
图11是内含铽配合物BPTA-Tb3+的LFNP的光稳定性实验结果图。
图12是用内含铽配合物BPTA-Tb3+的LFNP标记链亲合素测定人血清中的前列腺特异抗原(PSA)的工作曲线。
图13是内含铕配合物BHHT-Eu3+的LFNP的透射电子显微镜照片。
图14是内含铕配合物BHHT-Eu3+的LFNP的常规荧光光谱和时间分辨荧光光谱。
图15是内含铕配合物BHHT-Eu3+的LFNP的光稳定性实验结果图。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1内含4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸铕(简称TTTA-Eu3+)纳米荧光粒子的制备(1)TTTA-Eu3+配合物的制备将411mg的TTTA·H2O用6ml水溶解，用固体NaHCO3将pH调到6.5。然后将116mg的Eu2O3用稀盐酸加热溶解后，加入到TTTA水溶液中，用固体NaHCO3将pH调到6.5，室温下搅拌2小时，滤除去沉淀，加入300ml丙酮，室温下搅拌1小时，过滤收集沉淀，真空干燥，再用干燥甲醇洗涤干燥固体，滤液减压蒸干，真空干燥，即可制得470mg的TTTA-Eu3+配合物(收率67.7％)。
(2)内含铕配合物TTTA-Eu3+的纳米荧光微粒的制备将铕荧光配合物TTTA-Eu3+加入到水中溶解，再加入正硅酸乙酯(简称TEOS)。环己烷、正辛醇和Triton X-100按一定比例(摩尔比为20～25∶3～7∶1)均匀混合形成微乳液加到上述溶液中，再加入28％氨水(NH3占水相1-10％)引发聚合，室温反应24小时后，离心分离即得到内含铕配合物TTTA-Eu3+的纳米荧光微粒。
内含TTTA-Eu3+配合物纳米荧光粒子的性质表征。
(1)铕荧光纳米微粒的形态及大小尺寸图1是内含TTTA-Eu3+配合物的LFNP的透射电子显微镜照片，结果表明采用TEOS反相乳液聚合方法制得的铕荧光纳米微粒呈圆球形，大小均匀，粒径尺寸为52±4nm。粒径的大小可以通过调整水与表面活性剂的比例、助表面活性剂的种类、氨水的浓度、TEOS的量以及反应时间等来进行控制。
(2)铕荧光纳米微粒的荧光光谱特性图2是内含TTTA-Eu3+配合物荧光纳米微粒的荧光光谱和时间分辨荧光光谱。图中可见LFNP的荧光光谱的发光峰存在严重的散乱光干扰峰，而它的时间分辨荧光光谱的发光峰则彻底没有干扰峰的存在。在自由配合物TTTA-Eu3+的荧光光谱上其最大发光波长是615nm，制备成荧光纳米微粒后其荧光光谱的最大发光波长也是615nm，波长没有发生变化，说明制备纳米微粒的过程中TTTA-Eu3+配合物的组成及能级没有受到影响。该法制得的纳米荧光微粒的荧光寿命经测定为0.46ms，说明纳米荧光微粒的荧光仍保持了铕配合物的超长荧光寿命的特征。
图3是LFNP标记链亲合素(简称SA)的时间分辨荧光光谱，在340nm光的激发下，最大发光波长仍然是615nm，使用LFNP标记SA溶液测得LFNP在pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液中的荧光寿命为0.77ms，说明在铕纳米荧光微粒表面健合了蛋白质后其荧光寿命显著增长。
(3)铕荧光纳米微粒的光稳定性实验内含TTTA-Eu3+配合物荧光纳米微粒的光稳定性实验结果如图4所示，所用光源为25W氘灯。在氘灯发射出的强紫外光照射65分钟后，自由TTTA-Eu3+荧光配合物本身的荧光强度衰减到起始时的43.4％，而纳米荧光微粒的荧光强度仅衰减到起始时的79.1％，说明制成硅纳米微粒后铕配合物荧光的光稳定性得到明显的增强。
实施例2
使用内含TTTA-Eu3+配合物的LFNP作为标记物的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中的甲胎蛋白(简称AFP)(1)利用纳米稀土荧光微粒标记链亲和素(SA)将纳米球分散到2mol/L的Na2CO3水溶液中，用超声波活化20分钟后，加入溶有CNBr的乙腈溶液，室温反应2-10分钟，离心收集沉淀，沉淀用冰水和0.1mol/L NaHCO3(pH＝8.5)缓冲溶液各洗两次，再将活化后的纳米粒子加入到含有牛血清白蛋白(简称BSA)的水溶液中，反应过夜，用0.1mol/LNaHCO3(pH＝8.5)缓冲溶液洗后，加SA和戊二醛反应24小时后，加入NaBH4还原，室温反应30分钟，洗涤数次后悬浮于含有0.2％BSA-0.1％ NaN3-0.9％NaCl的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液1)中备用，该标记法的反应原理见图5。
(2)生物素标记山羊抗人AFP抗体的制备1.0ml的山羊抗人AFP抗体(0.5mg/ml，Nippon Bio-Test Laboratories，Inc.)在4℃，24小时对3L水两次透析后，加入8.4mg的NaHCO3和3mg的NHS-LC-biotin(Pierce Chemical Co.)，室温搅拌1小时后，4℃下放置24小时。反应液在4℃，24小时对3L含有0.25gNaN3的0.1mol/L NaHCO3水溶液两次透析后加入5mg的BSA和5mg的NaN3，放置-20℃备用。当用于免疫测定时，用缓冲溶液1稀释1000倍后使用。
(3)人血清中AFP的测定(a.)96微孔板的包被将含抗人AFP单克隆抗体(Biostride，Inc.，5μg/ml)的0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液50μl分注于96微孔板的各孔中，4℃，24小时包被后，用含有0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液2)洗两次，再用0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液3)洗1次，此包被后的微孔板-20℃下可保存1个月以上。
(b)AFP的时间分辨荧光免疫分析测定该测定的反应原理如图6所示。用含有5％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液4)稀释人AFP(Dakopatts，Denmark)制得AFP标准溶液。将此标准溶液和血清样品分别50μl注入上述包被后的微孔板的各孔中，37℃，1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净，然后加入50μl生物素标记的抗AFP抗体溶液，37℃，1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净，再加入50μl LFNP标记的SA溶液，37℃，1小时反应后，用缓冲溶液2洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。测定用仪器为WALLAC VICTOR 1420多标记计数仪，测定条件为激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。
用该法测定AFP的工作曲线如图7所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算AFP测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为0.54ng/ml。工作曲线上限可达100ng/ml。
实施例3内含N，N，N1，N1-[2，6-二(3’-胺甲基-1’-吡唑基)-4-(2”-苯基)吡啶]四乙酸铽(简称BPTA-Tb3+)的纳米荧光微粒的制备(1)BPTA-Tb3+配合物的制备将192mg的BPTA(合成方法参见文献7Yuan J，Wang G，Majima K，Matsumoto K.nal.Chem.2001，73，1869-1876)溶于4ml水中，用NaHCO3将pH调到6.5。然后将120mg的TbCl3溶于2ml水的溶液加入到BPTA水溶液中，用NaHCO3将pH调到6.5，室温下搅拌2小时，过滤除去沉淀，滤液中加入300ml丙酮，室温下搅拌1小时，过滤收集沉淀，真空干燥，再用干燥甲醇洗涤干燥固体，滤液减压蒸干，真空干燥，即可制得198mg的BPTA-Tb3+配合物(收率为72.9％)。
(2)内含BPTA-Tb3+配合物的纳米荧光微粒的制备将铽荧光配合物BPTA-Tb3+加入到水中溶解，再加入正硅酸乙酯(TEOS)。环己烷、正辛醇和Triton X-100按一定比例(摩尔比为20～25∶3～7∶1)均匀混合形成微乳液加到上述溶液中，再加入28％氨水(NH3占水相1-10％)引发聚合，室温反应24小时后，离心分离即得到内含BPTA-Tb3+配合物的纳米荧光微粒。
内含BPTA-Tb3+配合物纳米荧光微粒的性质表征(1)铽荧光纳米微粒的形态及大小尺寸图8是内含BPTA-Tb3+配合物的LFNP的透射电子显微镜照片，其大小均匀，粒径尺寸为43±3nm。
(2)稀土荧光纳米微粒的荧光光谱特性图9是内含BPTA-Tb3+配合物LFNP的荧光光谱和时间分辨荧光光谱。与内含TTTA-Eu3+的LFNP粒子一样，其荧光光谱的发光峰存在严重的散乱光干扰峰，而它的时间分辨荧光光谱的发光峰则彻底没有干扰峰的存在。在自由配合物BPTA-Tb3+的荧光光谱上其最大发光波长是545nm，而制备成荧光纳米微粒后其荧光光谱的最大发光波长也是545nm，波长没有发生变化，说明制备纳米微粒的过程中BPTA-Tb3+配合物的组成及能级没有受到影响。该法制得的纳米荧光微粒的荧光寿命经测定为1.515ms，说明纳米荧光微粒的荧光仍保持了铽配合物的超长荧光寿命的特征。
图10是内含BPTA-Tb3+配合物的LFNP标记SA的时间分辨荧光光谱，在321nm光的激发下，最大发射波长仍然是545nm，使用内含BPTA-Tb3+配合物LFNP标记SA溶液测得其在pH值为7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液中的荧光寿命为1.836ms，说明在铽纳米荧光微粒表面健合了蛋白质后其荧光寿命也显著增长。
(3)稀土荧光纳米微粒的光稳定性实验内含BPTA-Tb3+配合物LFNP的光稳定性实验结果如图11所示，所用光源为25W氘灯，在氘灯发射出的强紫外光照射65分钟后，自由BPTA-Tb3+荧光配合物本身的荧光强度衰减到起始时的20.2％，而纳米荧光微粒的荧光强度仅衰减到起始时的48％，说明制成硅纳米微粒后铽配合物荧光的光稳定性也得到明显的增强。
实施例4使用内含BPTA-Tb3+配合物的LFNP作为标记物的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中的前列腺特异抗原(简称PSA)(1)利用内含BPTA-Tb3+配合物纳米荧光微粒标记SA标记方法与用内含TTTA-Eu3+配合物纳米荧光微粒标记SA的方法相同。
(2)生物素标记山羊抗人PSA抗体的制备1.0ml的山羊抗人PSA抗体(0.5mg/ml，OEM Concepts Co.)在4℃，24小时对3L水两次透析后，加入8.4mg的NaHCO3和3mg的NHS-LC-biotin(PierceChemical Co.)，室温搅拌1小时后，4℃下24小时放置。反应液在4℃，24小时对3L含有0.25g NaN3的0.1mol/L NaHCO3水溶液两次透析后加入5mg的BSA和5mg的NaN3，放置-20℃备用。当用于免疫测定时，用缓冲溶液1稀释300倍后使用。
(3)人血清中PSA的测定(a)96微孔板的包被将小鼠抗人PSA单克隆抗体(OEM Concepts Co.)用0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液稀释后(10μg/ml)50μl分注于96微孔板的各孔中，4℃，24小时包被后，用缓冲溶液2洗两次，再用缓冲溶液3洗1次，此包被后的微孔板在-20℃下可保存1个月以上。
(b)PSA的免疫分析测定用缓冲溶液4稀释人PSA(Biogenesis Ltd.)制得PSA标准溶液。将此标准溶液分别50μl注入上述包被后的微孔板，37℃，1.5小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净。加入50μl生物素标记的山羊抗人PSA抗体，37℃，1小时反应后，用上述缓冲溶液2(2回)，缓冲溶液3(1回)洗净后，再加入50μlLFNP标记的SA溶液，37℃，1小时反应后，用缓冲溶液2洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。测定用仪器为WALLAC VICTOR 1420多标记计数仪，测定条件为激发波长，340nm；检测波长，545nm；迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。
用该法测定PSA的工作曲线如图12所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算PSA测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为0.29ng/ml。工作曲线上限可达100ng/ml。
实施例5内含4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)-邻二苯基苯(BHHT)-Eu3+铕配合物的纳米荧光微粒的制备(1)BHHT-Eu3+配合物的制备在1.41gBHHT(合成方法参见文献8Jingli Yuan，Kazuko Matsumoto andHiroko Kimura，Anal.Chem.，1998，70，596-601)中，加入50ml乙醇、0.258gEuCl3和0.113gN(CH2CH3)3，1小时回流反应后，减压蒸去溶剂，沉淀用30ml水洗3次，真空干燥，干燥后的固体用丙酮充分溶解，过滤除去不溶物，将滤液蒸干，所得固体真空干燥，即可制得1.6gBHHT-Eu3+配合物。
(2)内含铕配合物BHHT-Eu3+的纳米荧光微粒的制备将铕荧光配合物BHHT-Eu3+加入到水中溶解，再加入正硅酸乙酯(简称TEOS)。环己烷、正辛醇和Triton X-100按一定比例(摩尔比为20～25∶3～7∶1)均匀混合形成微乳液加到上述溶液中，再加入28％氨水(NH3占水相1-10％)引发聚合，室温反应24小时后，离心分离即得到内含铕配合物BHHT-Eu3+的纳米荧光微粒。
内含BHHT-Eu3+配合物纳米荧光粒子的性质表征(1)铕荧光纳米微粒的形态及大小尺寸图13是内含BHHT-Eu3+配合物的LFNP的透射电子显微镜照片，从照片可见铕荧光纳米微粒呈圆球形，大小均匀，粒径尺寸为35±4nm。粒径的大小可以通过调整水与表面活性剂的比例、助表面活性剂的种类、氨水的浓度、TEOS的量以及反应时间等来进行控制。
(2)铕荧光纳米微粒的荧光光谱特性图14是内含BHHT-Eu3+配合物荧光纳米微粒的荧光光谱和时间分辨荧光光谱。图中可见LFNP的荧光光谱的发光峰存在严重的散乱光干扰峰，而它的时间分辨荧光光谱的发光峰则彻底没有干扰峰的存在。在自由配合物BHHT-Eu3+的荧光光谱上其最大发光波长是612nm，而制备成荧光纳米微粒后其荧光光谱的最大发光波长也是612nm，波长没有发生变化。该法制得的纳米荧光微粒的荧光寿命经测定为0.556ms，说明纳米荧光微粒的荧光仍保持了铕配合物的超长荧光寿命的特征。
(3)稀土荧光纳米微粒的光稳定性实验内含BHHT-Eu3+配合物LFNP的光稳定性实验结果如图15所示，所用光源为25W氘灯，在氘灯发射出的强紫外光照射65分钟后，自由BHHT-Eu3+荧光配合物本身的荧光强度衰减到起始时的35％，而纳米荧光微粒的荧光强度仅衰减到起始时的50％，说明制成硅纳米微粒后铕配合物荧光的光稳定性也得到明显的增强。
使用内含BHHT-Eu3+配合物的LFNP作为标记物的时间分辨荧光免疫测定法可以参照实施例2和实施例4进行。
本发明中稀土荧光配位体的合成路线如下
4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸(简称TTTA)合成方法(1)4’-(2-噻吩基)2，2’6’，2”-联三吡啶(化合物1)的合成在500ml干燥甲醇中加入23.1克醋酸铵，16.3克N-[2-(pyrid-2’-yl)-2-oxoethyl]pyridinium iodide(N-[2-(2′-吡啶基)-2-氧代乙基]吡啶碘化物，50mmol)，和10.76克(E)-3-(2”-thenyl)-1-(pyrid-2’-yl)prop-2-enone((E)-3-(2″-噻吩基)-1-(2’-吡啶基)-2-丙烯酮，50mmol)，溶液搅拌下回馏24小时。反应液冷至室温后，在-15℃放置1小时，过滤收集沉淀，用冷甲醇(-15℃左右)充分洗涤后，产品用乙腈重结晶。得目标化合物6.91克(43.8％收率)。1H NMR(CDCl3即氘代氯仿)测定结果8.74(d，J，7.9Hz，2H)，8.69(s，2H)，8.64(d，J，7.9Hz，2H)，7.87(t，J，7.9Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.44(d，J，5.1Hz，1H)，7.38-7.32(m，2H)，7.19-7.15(m，1H)。
(2)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-联三吡啶-1，1”-二氧化物(化合物2)的合成500ml二氯甲烷中加入12.61克化合物1(40mmol)和40克间氯过氧化苯甲酸，室温下搅拌反应20小时后，反应液用200ml的10％碳酸钠洗涤4次。有机相用无水硫酸钠干燥后，蒸馏除去二氯甲烷。将产物溶于300ml甲醇中，过滤除去微量的不溶物，滤液减压蒸馏除去甲醇后，产品用乙腈充分洗涤并真空干燥。得目标化合物8.53克(61.4％收率)。1H NMR(CDCl3)测定结果9.23(s，2H)，8.35(d，J，6.6Hz，2H)，8.23(d，J，7.9Hz，2H)，7.70(d，J，3.6Hz，1H)，7.45-7.28(m，5H)，7.16-7.13(m，1H)。
(3)6，6”-二腈基-4’-(2-噻吩基)-，2’6’，2”-联三吡啶(化合物3)的合成在300ml二氯甲烷中加入8.69克化合物2(25mmol)和24.80克(CH3)3SiCN(250mmol)，室温搅拌20分钟后，搅拌下缓慢(约20分钟)滴入14.05克苯甲酰氯(100mmol)。反应液室温下搅拌20小时后，减压蒸发溶剂至溶液体积为150ml，加入10％碳酸钾水溶液600ml，继续室温下搅拌1小时。过滤收集沉淀，用水充分洗涤后，再用冷二氯甲烷(-15℃左右)洗涤，然后真空干燥。得目标化合物9.0克(98.5％收率)。1H NMR(DMSO-d6)测定结果8.95(d，J，7.9Hz，2H)，8.62(s，2H)，8.32-8.26(m，2H)，8.19(d，J，7.6Hz，2H)，8.07(d，J，3.6Hz，1H)，7.86(d，J，5.1Hz，1H)，7.28-7.31(m，1H)。
(4)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-联三吡啶-6，6”-二羧酸甲酯(化合物4)的合成将4.40克化合物3加入到45ml硫酸-45ml醋酸-12ml水的溶液中。75-80℃下搅拌反应48小时后，反应液加入到300ml冰水中，过滤收集沉淀，用水充分洗涤后，再用无水乙醇洗涤，真空干燥(得4.85克水解产物)。
在400ml干燥甲醇中，外部用冰水冷却下加入8克氯化亚砜，搅拌15分钟后，加入4.85克上述水解产物，反应液搅拌回馏8小时后，室温下继续搅拌16小时。蒸去溶剂后，生成物用氯仿反复抽提。氯仿溶液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥。蒸去溶剂后，生成物用硅胶柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇(w/w，99∶1)展开，收集最先洗出的第一个组分。蒸去溶剂后，产品用甲苯重结晶，真空干燥，得目标化合物2.50克(48.1％收率)。元素分析结果(％)，按C23H17N3O4S计算值C＝64.03，H＝3.97，N＝9.74；实测值C＝63.76，H＝3.83，N＝9.52。1H NMR(CDCl3)测定结果8.16(d，J，7.8Hz，2H)，8.78(s，2H)，8.20(d，J，7.6Hz，2H)，8.03(t，J，7.8Hz，2H)，7.82(d，J，3.6Hz，1H)，7.49(d，J，5.1Hz，1H)，7.22-7.19(m，1H)，4.08(s，6H)。
(5)6，6”-二羟甲基-4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-联三吡啶(化合物5)的合成在200ml干燥乙醇中加入2.89克化合物4(6.7mmol)和1.05克NaBH4，室温下搅拌3小时后，搅拌回馏1小时。减压蒸去乙醇，产物中加入100ml饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌下加热至沸腾。冷却后过滤收集不溶物，用水洗涤后真空干燥。将产品加热溶于200ml四氢呋喃中，过滤除去不溶物，减压蒸去四氢呋喃后，产品用乙腈充分洗涤，真空干燥。得目标化合物1.82克(72.2％收率)。1H NMR(DMSO-d6)测定结果8.63(s，2H)，8.50(d，J，7.3Hz，2H)，8.03(t，J，7.3Hz，2H)，7.93(d，J，3.6Hz，1H)，7.82(d，J，5.1Hz，1H)，7.61(d，J，7.1Hz，2H)，7.28-7.31(m，1H)，4.74(s，4H)。
(6)6，6”-二溴甲基-4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-联三吡啶(化合物6)的合成在200ml干燥四氢呋喃-30ml干燥N，N-二甲基甲酰胺中加入2.17克化合物5和4.75克三溴化磷，反应液搅拌回馏5小时后，减压蒸去溶剂。将生成物溶入300ml氯仿，氯仿溶液用4×100ml(即四次每次使用100毫升)的10％Na2CO3水溶液洗涤4次后，用无水硫酸钠干燥。过滤除去硫酸钠，减压蒸去氯仿溶液，产品用正己烷充分洗涤，真空干燥，得目标化合物2.02克(69.7％收率)。1H NMR(CDCl3)测定结果8.71(s，2H)，8.54(d，J，7.8Hz，2H)，7.87(t，J，7.8Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.52(d，J，7.8Hz，2H)，7.48(d，J，5.1Hz，1H)，7.21-7.19(m，1H)，4.70(s，4H)。
(7)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸四乙酯(化合物7)的合成在200ml干燥乙腈-50ml干燥四氢呋喃中加入2.04克化合物6(4mmol)，1.53克二乙酸乙酯基胺(8.1mmol)溶于30ml干燥乙腈的溶液和5.52克K2CO3(40mmol)，反应液搅拌回馏24小时后，过滤除去不溶物。减压蒸去溶剂后，将生成物溶于200ml氯仿中，氯仿溶液用4×100ml饱和硫酸钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤后溶液减压蒸去溶剂，用石油醚洗涤后真空干燥。所得油状物用硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯-甲醇-四氢呋喃(w/w/w，10∶3∶2)展开，收集最先洗出的第一个组分。蒸去溶剂后，真空干燥。得目标化合物1.95克(67.9％收率)。1H NMR(CDCl3)测定结果8.67(s，2H)，8.51(d，J，7.8Hz，2H)，7.86(t，J，7.8Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.63(d，J，7.8Hz，2H)，7.45(d，J，5.1Hz，1H)，7.20-7.17(m，1H)，4.19(q，J，7.3Hz，8H)，3.72(s，8H)，3.46(s，4H)，1.26(t，J，7.3Hz，12H)。
(8)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸(简称TTTA)的合成将1.94克化合物7(2.7mmol)加入到120ml乙醇中，然后加入4克氢氧化钾和10ml水，反应液搅拌回馏3小时。减压蒸去溶剂，将生成物溶于150ml水中，过滤除去微量不溶物，向搅拌下的溶液中漫漫滴入的三氟乙酸水溶液至溶液的pH值约为1为止。溶液室温下搅拌3小时后，过滤收集沉淀，用1％的三氟乙酸水溶液充分洗涤，真空干燥。将生成物加入到200ml乙腈中，搅拌回馏2小时，过滤收集沉淀，真空干燥。得目标化合物0.89克(51.4％收率)。元素分析结果(％)，按C29H31N5O9S(TTTA·2H2O)计算值C＝54.29，H＝4.87，N＝10.91；实测值C＝54.09，H＝4.57，N＝10.41。1H NMR(DMSO-d6)测定结果8.75(s，2H)，8.59(d，J，7.8Hz，2H)，8.18(t，J，7.8Hz，2H)，8.10(d，J，3.6Hz，1H)，7.87(d，J，5.1Hz，1H)，7.75(d，J，7.8Hz，2H)，7.34-7.31(m，1H)，4.72(s，4H)，4.28(s，8H)。
权利要求
1.一种功能性纳米稀土荧光微粒，其特征在于以稀土荧光配合物为发光中心，采用化学包裹成粒后，并且在微粒表面引入具有化学结合功能的基团。
2.根据权利要求1所述的功能性纳米稀土荧光微粒，其特征在于其中所述的稀土荧光配合物是指稀土离子中的三价铕(Eu3+)，铽(Tb3+)，钐(Sm3+)或镝(Dy3+)离子与下述有机配位体形成的荧光配合物，有机配位体的结构式为 式中R、R1及R2为各种芳香烃类取代基或脂肪烃类取代基，R3为-H、氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)。
3.根据权利要求2所述的功能性纳米稀土荧光微粒，其特征在于其中所述的有机配位体结构式中较为常用的取代基为 中之一，R1为噻吩基、苯基、萘基或菲基，R2为-CF3，-C2F5或-C3F7。
4.一种功能性纳米稀土荧光微粒的制备，其特征在于将稀土荧光配合物用化学包裹成粒，具体地说就是采用正硅酸乙酯，以环己烷为油相，聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚为表面活性剂，乙醇、丙醇、正己醇、正辛醇或正癸醇为助表面活性剂和水形成的反相微乳液体系，加入权利要求1、2或3中所述的稀土荧光配合物，以氨水引发聚合，在纳米微粒制备过程中或制备完成后导入活性基团，从而制备成可以发出强荧光的并且具有生物结合功能荧光纳米微粒。
5.根据权利要求4所述的功能性纳米稀土荧光微粒的制备，其特征在于在引发聚合过程中加入3-巯基丙基三烷氧基硅或3-氨基丙基三烷氧基硅，使之生成功能性荧光纳米微粒。
6.根据权利要求4所述的功能性纳米稀土荧光微粒的制备，其特征在于在引发聚合成荧光纳米微粒后，加入CNBr与纳米球表面的硅羟基发生共价结合反应，使之生成功能性荧光纳米微粒。
7.根据权利要求4所述的功能性纳米稀土荧光微粒的制备，其特征在于在引发聚合成荧光纳米微粒后，加入3-巯基丙基三烷氧基硅或3-氨基丙基三烷氧基硅硅烷化试剂与纳米粒表面的硅羟基反应，使之生成功能性荧光纳米微粒。
8.一种权利要求1、2或3所述的功能性纳米稀土荧光微粒在时间分辨荧光测定法中的应用。
9.根据权利要求8所述的功能性纳米稀土荧光微粒在时间分辨荧光测定法中的应用，其特征在于其中的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法，时间分辨荧光DNA杂交测定法，时间分辨荧光显微镜成象测定法，时间分辨荧光细胞活性测定法或时间分辨荧光生物芯片测定法。
全文摘要
本发明公开了一种强荧光性稀土荧光纳米微粒(Lanthanide Fluorescence Nanoparticles，简称LFNP)的制备及其在生物检测技术中的应用方法。它以强荧光性稀土配合物为发光中心，采用硅胶化学包裹成粒技术制备而成。LFNP的荧光寿命长，Stokes位移大，发射峰窄，特异信号强，用其作为荧光标记物进行时间分辨荧光测定时不受各种散乱光和短寿命荧光对测定的干扰，并且其表面具有化学结合功能的官能团，可直接作为荧光标记物应用于物理、化学以及生命科学领域。
文档编号C09K11/77GK1493647SQ0214451
公开日2004年5月5日 申请日期2002年11月1日 优先权日2002年11月1日
发明者袁景利, 谭明乾, 叶志强, 王桂兰 申请人:中国科学院大连化学物理研究所