. 83-7. 75 (m, 2H), 4. 24 (t ,J = 7. 2Hz, 2H), 3. 76 (t, J = 6. 3Hz, 2H), I. 89-1. 79 (m, 2H), I. 74-1. 57 (m, 2H). ESI-MS: ([M+H]+) :327. 5〇
[0062] (3)中间体6的制备：
[0063] 将中间体5(0. 60g，1.84mmol)溶于干燥乙酸乙酯中，再将0. 5mL三溴化磷溶于 5mL干燥乙酸乙酯中得混合物1，将混合物1在冰浴下逐滴加入至中间体5溶液中，滴加完 毕后，转移至油浴80°C，回流反应6h。待反应液冷却至室温，将其倒入碎冰中，析出棕色固 体，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥得棕色固体。收率95. 2%。1H-NMR(300MHz，⑶Cl3): δ 8.63 (d ,J = 7. 2Hz, 1H), 8. 60 (d, J = 8. 1Hz, 1H), 8. 39 (brs, 1H), 8. 20 (d, J = 8. 4Hz, 1H), 7. 81-7. 7 5 (m, 2H), 4. 24 (t, J = 6. 9Hz, 2H), 3. 49 (t, J = 6. 3Hz, 2H), 2. 38 (s, 3H), 2. 04-1. 85 (m, 4H)； ESI-MS: ([M+H]+) :389. 4〇
[0064] (4)化合物LI的制备：
[0065] 将中间体 3 (90mg，0. 22mmol)与中间体 6 (llOmg，0. 28mmol)溶于 18mL 干燥乙 腈和2mL干燥N, N-二甲基酰亚胺的混合溶液中，再加入无水碳酸钾（70mg，0. 50mmol), 于80 °C回流反应6h。待反应液冷却至室温，滤去碳酸钾，将滤液浓缩至大约2mL，过柱 纯化，得淡黄色固体，收率为 50. 5 %。1H-NmrGOOMHz, DMSO) : δ 10. 45 (s, 1H)，9. 26 (br s，lH)，8.74(d，J = 12Hz，lH)，8.55(d，J = 12Hz，lH)，8.50(d，J = 12Hz，lH)，8.33(d，J =12Hz, 1H), 7. 91 (t, J = 12Hz, 1H), 7. 23 (s, 3H), 7. 16 (t, J = 12Hz, 3H), 6. 96 (d, J = 36Hz, 2H), 5. 34 (s, 2H), 4. 11 (t, J = 12Hz, 2H), 4. 00 (brs, 1H), 3. 56 (d, J = 12Hz, 2H) ,3.10( brs, 4H), 2. 29 (s, 3H), 2. 23 (d, J = 18Hz, 2H), 2. 03 (brs, 1H), I. 74 (m, 5H) ； 13C-NMR (7 5MHz, C D3OD) : δ 171. 26, 164. 37, 163. 88,140. 06, 133. 22, 131. 80, 131. 48, 131. 02, 128. 78, 128. 73 ,128. 34, 128. 25, 126. 43, 125. 08, 122. 42, 121. 94, 120. 75, 120. 65, 118. 45, 115. 31, 115. 09 ,114. 21, 108. 54, 44. 31, 38. 78, 24. 86, 22. 51, 21. 43. ESI-MS: ([M+H]+) calcd for C37H37FN5O 3:633. 2945, found:633. 3081。
[0066] 实施例3 :光学活性的测定
[0067] 表1 :探针分子的光学特征
[0068]
[0070] 注：以上所有光学性质均在pH = 7. 4的磷酸缓冲液中测量。
[0071] 实施例4:生物活性的测定
[0072] 以阿司咪唑（Astemizole)为阳性药，采用放射性配体竞争性结合实验，测定荧光 探针分子与hERG钾离子通道的结合活性，结果如表2所不。合成的探针分子LI、L3、L5的 活性较阳性药阿司咪唑低，探针L4的活性与阿司咪唑活性相当。
[0073] 表2探针分子与hERG钾离子通道的亲和力
[0074]
[0075] 注：IC5tl为化合物与hERG钾离子通道结合50%的浓度，K i代表化合物与hERG钾 离子通道的结合常数。
[0076] 实施例5 :探针分子在hERG钾离子通道细胞成像中的应用
[0077] 以探针分子Ll为研宄对象，考察其在细胞成像中的应用，选择hERG转染的HEK293 细胞、神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y)为阳性细胞，相同条件下，加入抑制剂阿司咪唑作为阴 性对照。
[0078] 具体步骤为：1^1?转染的册1(293细胞用含有10%胎牛血清和40(^8/1^6418的 DMEM培养基；神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y)用含有10%胎牛血清的1640培养基，在5% CO2空气及37°C的环境中进行培养，成像前，将细胞接种于共聚焦小皿中，培养12-24h，将 培养基吸掉，用不含血清的培养基洗涤一次，加入探针Ll (不含血清的培养基配制，浓度为 ΙμΜ);相同条件下，另一小皿加入探针Ll与抑制剂阿司咪唑（不含血清培养基配制，Ll浓 度为1 μ Μ，阿司咪唑浓度为50 μ Μ)作阴性对照，孵育，然后吸出培养基，洗涤一次，用Zeiss Axio Observer Al 成像。
[0079] 成像结果如图1和图2所示，探针分子能够标记hERG钾离子通道及其高表达的神 经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y)，该探针在hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病的研宄中有 广阔的应用前景。
[0080] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对发明保护范围 的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需 要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种苯并咪唑类hERG钾离子通道的小分子荧光探针，该荧光探针的结构通式如式 (I)所示：式中，&为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代或多取代基；R2为荧光团；n= 1-6。2. 根据权利要求1所述的小分子荧光探针，其特征在于：所述Ri为对位卤素；R2为香 豆素类、萘二酰亚胺类、NBD类、Cy5类及异硫氰酸荧光素类荧光团；n= 4。3. 根据权利要求2所述的小分子荧光探针，其特征在于：所述小分子荧光探针选自具 有如下结构式的化合物：4. 一种苯并咪唑类小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤： (1)识别基团的制备：2_氯苯并咪唑在碱性条件下，与对氟苄溴反应，生成1-对氟 苄基-2-氯苯并咪唑，再与4-氨基-1-乙氧甲酰基哌啶在微波150~180°C的条件下反 应，生成4-((1_对氟苄基-1H-2-苯并咪唑基）氨基）-1_哌啶甲酸乙酯，再与质量分数为 30 %~60 %氢溴酸回流生成1-对氟苄基-N-(4-哌啶基）-lH-2-氨基苯并咪唑溴酸盐， 接着与N-(4-溴丁基）邻苯二甲酰亚胺在碱性条件下反应，生成N-(4-((4-((l-对氟苄 基-1H-2-苯并咪唑基）氨基）1_哌啶）丁基）邻苯二甲酰亚胺，再与质量分数为70%~ 80%水合肼反应得到^(1-(4-氨丁基）哌啶基）-1-对氟苄基-111-2-氨基苯并咪唑； (2)探针分子的制备：制备各种荧光团，在荧光团上引入羧基，然后与N-(l-(4-氨丁 基）哌啶基）-1-对氟苄基-1H-2-氨基苯并咪唑通过缩合反应，制得探针分子；或者在荧光 团上引入卤素，与N- (1- (4-氨丁基）哌啶基）-1-对氟苄基-1H-2-氨基苯并咪唑发生取代 反应，制备探针分子。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1)中，2-氯苯并咪唑、对 氟苄溴以及4-氨基-1-乙氧甲酰基哌啶的加入的摩尔比为0.5~1.2 :1~1.8 :1~2。6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1)中，4-氨基-1-乙氧 甲酰基哌啶、氢溴酸、N-(4-溴丁基）邻苯二甲酰亚胺以及水合肼加入的摩尔比为1~1. 8 : 50 ~70 :1. 2 ~2 :60 ~80。7. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1)中，回流时间为30~ 40h〇8. 权利要求1-3任一所述苯并咪唑类小分子荧光探针在hERG钾离子通道及其高表达 的肿瘤细胞或组织标记中的应用。9. 权利要求1-3任一所述苯并咪唑类小分子荧光探针在hERG钾离子通道抑制剂的高 通量筛选以及在新药心脏毒性评价中的应用。10. 权利要求1-3任一所述苯并咪唑类小分子荧光探针在作为识别hERG钾离子通道的 探针以及在hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病研宄中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种苯并咪唑类hERG钾离子通道的小分子荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针的结构通式如式(Ⅰ)所示：式中，R1为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代或多取代基；R2为荧光团；n＝1-6，所述R1为对位卤素；R2为香豆素类、萘二酰亚胺类、NBD类、Cy5类及异硫氰酸荧光素类荧光团。在hERG钾离子通道及其高表达的肿瘤细胞或组织标记中、在hERG钾离子通道抑制剂的高通量筛选以及在新药心脏毒性评价中以及在作为识别hERG钾离子通道的探针以及在hERG钾离子通道生理、病理及相关疾病研究中的应用。
【IPC分类】C07D493/10, G01N21/64, C09K11/06, C07D405/14, C07D401/14, C07D401/12
【公开号】CN104910894
【申请号】CN201510224724
【发明人】杜吕佩, 李敏勇, 汪蓓蕾
【申请人】山东大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月5日