一种检测细胞内co的荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种B0DIPY类荧光探针、其合成方法及其在 检测细胞内C0的应用，属于检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 多年来，一氧化碳(carbon monoxide，C0)因其极易与血红蛋白结合，形成碳氧血 红蛋白，使血红蛋白丧失携氧的能力和作用，造成组织室息，严重时死亡。一直以来，C0被人 们认为是一种有毒气体。20世纪70年代，人们发现机体可以内源性产生C0，它在体内主要是 由血红素氧化酶酶解血红素产生。C0与其它气体信号小分子N0、H 2S-样，在机体调节的生 理和病理方面都起着重要作用。C0的主要生理作用是为心肌局部缺血和再灌注时组织损伤 提供保护。相比传统直接给机体吸入C0气体，过渡金属羰基复合物的C0释放分子(CORMs)被 认为是临床上防止心肌局部缺血和再灌注时组织损伤的潜在药物。内源性气体信号分子因 其具有持续产生、传播迅速等特别。目前的 C0检测技术，如硫酸钯-钼酸铵比色式法、电化学 法、气相色谱法、红外线一氧化碳检测法等，往往需要延后处理或破坏的组织或产生细胞裂 解产物。
[0003] 近年来，用于检测体内⑶的荧光探针，比较少见。如以B0DIPY为荧光母体(Brian ff.Michel,Alexander R.Lippert,and Christopher J.Chang,J.Am.Chem.Soc.2012,134, 15668-15671)探针，以及以双光子染料香豆素衍生物为荧光母体(K. Zheng，W. Lin，L. Tan， H.Chena and H.Cuia，Chem.Sci. ,2014,5,3439-3448.)的荧光探针。以上两种探针的响应 基团都是以苄胺形成的环钯化物，虽然选择性好，但反应时间长(lh或30min)。
【发明内容】
[0004] 为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种检测细胞内C0的荧光探针及其制备方 法和应用，该类荧光探针结构新颖、灵敏度高、光稳定性好。
[0005] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0006] -种检测细胞内C0的荧光探针，结构式如下：
[0007]
[0008]其中，R为H、-CH3、-CH2CH3 或-COOEt。
[0009] 本发明合成新型环钯基 ?够对C0的响应性更快更灵敏，其与B0DIPY结 合后不仅提高了对C0的选择性，而且实现更快更灵敏的检测C0。
[0010] 一种检测细胞内co的荧光探针的制备方法，将对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯和三 氟化硼乙醚，或对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反应生成硝基苯基氟 硼二吡咯(硝基苯基B0DIPY)，然后将硝基苯基B0DIPY中的硝基还原成氨基，再加入亚硝酸 盐和3，5-二甲基苯酚偶氮化反应，最后加入钯盐进行环钯化反应得到目标产物，即检测细 胞内C0的荧光探针(ACP-C0)。
[0011]本发明合成方法简单，适于工业化生产。
[0012]优选的，所述二甲基吡咯为2,4_二甲基吡咯。
[0013] 其反应过程如下：
[00141
[0015] 其中，R为H、-CH3、-CH2CH3 或-COOEt。
[0016] 优选的，步骤如下：
[0017] (1)将对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍生物溶 解于溶剂1中，加热回流后冷却，加入溶剂2,加入三氟化硼乙醚升温反后得到5,5_二氟-1， 3，7，9-四甲基-10-(4-硝基苯基)-5Η-4λ 4，5λ4-二吡咯[1，2-c: 2 '，Γ -f ] [ 1，3，2 ]二氮杂硼， 即硝基苯基B0DIPY;
[0018] (2)将硝基苯基B0DIPY和甲酸铵溶于溶剂中，然后加入Pd/C搅拌反应后即得氨基 苯基 B0DIPY;
[0019] (3)将氨基苯基B0DIPY和浓盐酸溶于溶剂中，加入亚硝酸盐溶液，搅拌后，加入3， 5-二甲基苯酚的碱溶液搅拌后得到偶氮B0DIPY;
[0020] (4)将偶氮B0DIPY染料溶解于溶剂中，然后加入PdCl2,室温搅拌过夜后，即得检测 细胞内C0的荧光探针。
[0021] 进一步优选的，所述步骤（1)的具体步骤为:将对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或 对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍生物溶解于CH 2C12中，加热回流l_2h，冷却后加入三乙胺、 甲苯，待反应10-20分钟后加入三氟化硼乙醚，升温至50-60°C反应2-4小时，旋干，用色谱柱 分离，所得固体即硝基苯基BODIPY;
[0022]所述的硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯或二甲基吡咯衍生物、三乙胺、甲苯、三氟化硼 乙醚及CH2CI2的用量比为7-10:7-20:3 · 5-5 · 5:30-50:3-6:20-50(g: g:mL:mL:mL:mL);色谱 柱分离洗脱剂比例为V?_:VjffiK=4-6:1。提高原料的转化率，同时提高硝基苯基BODIPY的 产率和纯度。
[0023]进一步优选的，所述步骤（2)的具体步骤为：将硝基苯基B0DIPY、甲酸铵溶于 CH2C12,然后加入Pd/C，常温搅拌1-3小时后过滤，将滤液旋干得氨基苯基B0DIPY;所述的硝 基苯B0DIPY、甲酸铵、Pd/C、CH 2C12的用量比例为:5~10:50~70:l~5 :10-30(g:g:g:mL)<^ 高原料的转化率，同时提高氨基苯基B0DIPY的产率和纯度。
[0024]进一步优选的，所述步骤（3)的具体步骤为：将氨基苯基B0DIPY、浓盐酸溶于DMF 中，加入亚硝酸钠水溶液，在〇-5°C下搅拌3-4h，然后将其缓慢滴加到3,5-二甲基苯酚的 NaOH溶液中，在0-5 °C下搅拌4-5h，过滤后的滤渣色谱柱分离，得黄色固体偶氮B0DIPY;
[0025] 所述的氨基苯基B0DIPY、浓盐酸、DMF、亚硝酸钠、3,5-二甲基苯酚、似0!1、水的用量 比为 1-3:3-5:10-15:3-5:3-5:4-8:20-30(g:mL:mL:g :g:g:mL)。色谱柱分离洗脱剂比例为 VjiWi: Ve麵=1-3:2。提高原料的转化率，同时提高偶氮B0DIPY的产率和纯度。
[0026] 进一步优选的，所述步骤⑷中的溶剂为CH30H;所述的偶氮BODIPY、CH 3OH、PdCl2的 用量比例为5~10:10~30:10~20(g:mL:g)。提高原料的转化率，同时提高检测细胞内C0的 荧光探针的产率和纯度。
[0027] -种上述检测细胞内C0的荧光探针在检测细胞内C0中的应用。
[0028] 一种检测细胞内C0的方法，步骤为：
[0029] (1)将上述检测细胞内C0的荧光探针溶解于生理盐水、缓冲溶液或者培养液中，配 制成储备液储存待用；
[0030] (2)将步骤(1)中的储备液加入含有细胞组织的适当缓冲液进行测试。
[0031] 一种检测活细胞内C0的方法，步骤为：
[0032] (1)将含有上述检测细胞内C0的荧光探针的缓冲溶液5-10μΜ加入培养好的细胞放 于培养箱是孵育8-12分钟；
[0033] (2)将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像，如 果是检测内源性物质，刚是直接进行共聚焦成像，而如果是外加检测的，刚是加了待检测物 质后，再次孵育8-12分钟，然后进行成像。
[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0035] 1.合成简单，检测速度快，检测过程中不需要长时间的孵育；
[0036] 2.选择性高，其它生物活性小分子不干扰；
[0037] 3.检测波长512nm处于可见光区，对细胞损伤小。有利细胞内进行C0的检测。
【附图说明】
[0038] 图1是本发明的探针ACP-C0荧光强度和C0RM-2浓度变化的关系；横坐标是波长 (nm)，纵坐标是荧光强度;该图为512nm处的荧光光谱；
[0039] 图2是本发明的探针ACP-C0的相对于生物体内常见的活性小分子的选择性实验；
[0040] 图3是本发明的探针ACP-C0的相对荧光强度和C0RM-2浓度的工作曲线;横坐标是 C0RM-2的浓度，纵坐标为相对荧光强度；
[0041 ]图4是本发明的探针ACP-C0对人肝癌细胞(HepG2)的激光共聚显微成像；图a与图b 为细胞成像图，图c为前两者的叠加图，图d为细胞明场图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0043] 实施例1
[0044] (1)将对硝基苯甲酰氯(7g)、2，4-二甲基吡咯（7g)溶解CH2C1 2(20mL)中，加热回流 lh。冷却后加入三乙胺(3.5g)、甲苯(30ml)。待反应15分钟后加入三氟化硼乙醚(3g)，升温 至50度反应3小时，旋干，用色谱柱分离(洗脱剂:V?鍵:5:1 )，旋干得橙色固体硝基 苯基 B0DIPY。
[0045] 核磁及质谱表征：
[0046] 4匪1?(4001抱，0)(：13):3 = 1.36(8,6!〇,2.57(8,6!〇,6.02(8,2!〇,7.54((1, J = 8Hz， 2H),8.39(d ,J = 8Hz,2H)
[0047] ESI-MS:calculated for[M_H]-=368.1，found 368.1。
[0048] (2)将硝基苯基B0DIPY(5g)、甲酸铵（50g)溶于CH2Cl 2(10mL)，然后加入Pd/Cl2 (1 g)，常温搅拌2小时，过滤，滤液旋干得氨基苯基BODIPY。
[0049] 核磁及质谱表征：
[0050] ^NMRC^OMHz.CDCb) ：5 = 1.49(s,6H) ,2.54(s,6H) ,3.89(s,2H) ,5.97(s,2H), 6.79(d ,J = 4Hz,2H),7.01(d ,J = 8Hz,2H)
[0051] ESI-MS:calculated for[M+H] + = 340.2,found 340.2〇
[0052] (3)将氨基苯基BODIPY(lg)、浓HCl(3mL)溶于DMF(lOmL)中，加入亚硝酸钠（3g)水 溶液（10mL)，在0-5 °C下搅拌3h，然后将其缓慢滴加到3，5-二甲基苯酚(3g)的Na0H( 4g)溶液 中，在0-5 °C下搅拌4h，过滤，滤渣溶解旋干，色谱柱分离(洗脱剂:V；a瞧=1:1)，得黄 色固体偶氮B0DIPY。
[0053]核磁及质谱表征：
[0054] 1HNMR(400MHz,DMS0-d6)：5=1.44(s,6H),2.47(s,12H),6.21(s,2H),6.63(s,2H), 7.56(d ,J = 8Hz,2H),7.95(d ,J = 8Hz,2H),10.07(s,lH)
[0055] ESI-MS:calculated for[M-H]_ = 471.2,found 471.2〇
[0056] (4)将偶氮B0DIPY(5g)溶解于CH30H(10mL)中，然后加入PdCl 2(10g)，室温搅拌过 夜，过滤得黄色固体。
[0057]核磁表征：
[0058] 1HNMR(400MHz,DMS0-d6)：5 = 1.50(s,6H) ,2.20(s,6H) ,2.47(s,6H),6.23(s,2H), 6.60(s，2H)，7.35(d，J = 8Hz，lH)，7.56(s，lH)，8.12(d，J