= 8Hz，lH)，9.75(s，lH)。
[0059] 实施例2
[0060] (1)将对硝基苯甲酰氯(0.14g)、2，4-二甲基吡咯(0.14g)溶解CH2C1 2 (2mL)中，加热 回流lh。冷却后加入三乙胺（0.35g)、甲苯（3ml)。待反应15分钟后加入三氟化硼乙醚 (0.3g)，升温至50度反应3小时，旋干，用色谱柱分离(洗脱剂:5:1)，旋干得橙 色固体硝基苯基B0DIPY。
[0061] 核磁及质谱表征：
[0062] 4匪1?(4001抱，0)(：13):3 = 1.36(8,6!〇,2.57(8,6!〇,6.02(8,2!〇,7.54((1, J = 8Hz， 2H),8.39(d ,J = 8Hz,2H)
[0063] ESI-MS:calculated for[M_H]-=368.1，found 368.1。
[0064] (2)将硝基苯基BODIPY(lOg)、甲酸铵（lOOg)溶于CH2Cl 2(20mL)，然后加入Pd/Cl2 (2g)，常温搅拌2小时，过滤，滤液旋干得氨基苯基B0DIPY。
[0065] 核磁及质谱表征：
[0066] ^NMRC^OMHz.CDCb) ：5 = 1.49(s,6H) ,2.54(s,6H) ,3.89(s,2H) ,5.97(s,2H), 6.79(d ,J = 4Hz,2H),7.01(d ,J = 8Hz,2H)
[0067] ESI-MS:calculated for[M+H] + = 340.2,found 340.2〇
[0068] (3)将氨基苯基B0DIPY( 2g)、浓HC1 (6mL)溶于DMF( 20mL)中，加入亚硝酸钠（6g)水 溶液（1 OmL)，在0-5 °C下搅拌3h，然后将其缓慢滴加到3，5-二甲基苯酚(6g)的Na0H( 8g)溶液 中，在0-5 °C下搅拌4h，过滤，滤渣溶解旋干，色谱柱分离(洗脱剂:V；a瞧=1:1)，得黄 色固体偶氮B0DIPY。
[0069]核磁及质谱表征：
[0070] 1HNMR(400MHz,DMS0-d6)：5=1.44(s,6H),2.47(s,12H),6.21(s,2H),6.63(s,2H), 7.56(d ,J = 8Hz,2H),7.95(d ,J = 8Hz,2H),10.07(s,lH)
[0071] ESI-MS:calculated for[M-H]_ = 471.2,found 471.2〇
[0072] (4)将偶氮B0DIPY(15g)溶解于CH30H(30mL)中，然后加入PdCl 2(30g)，室温搅拌过 夜，过滤得黄色固体。
[0073]核磁表征：
[0074] 1HNMR(400MHz,DMS0-d6)：5 = 1.50(s,6H) ,2.20(s,6H) ,2.47(s,6H),6.23(s,2H), 6.60(s，2H)，7.35(d，J = 8Hz，lH)，7.56(s，lH)，8.12(d，J = 8Hz，lH)，9.75(s，lH)。
[0075] 实施例3
[0076] 本发明与实施例1相同，不同之处在于：将2,4_二甲基吡咯改为2，3,4_三甲基吡 咯。
[0077] 实施例4
[0078] 本发明与实施例1相同，不同之处在于:将2，4-二甲基吡咯改为2，4-二甲基-3-乙 基吡咯。
[0079] 实施例5
[0080] 本发明与实施例1相同，不同之处在于:将2，4-二甲基吡咯改为2，4-二甲基-3-吡 咯甲酸乙酯。
[0081 ]效果试验：
[0082] 1 ·分别用5 · ΟμΜ实施例 1 的探针ACP-⑶对0，10，20，30，40，50，60，70，80和90μΜ CR0M-2进行荧光响应测试，得到探针ACP-C0的荧光强度和C0RM-2浓度变化的关系；实验条 件：激发/发射波长= 495/512nm，50mM PBS/DMS0(pH 7 · 4，7:3，v/v)，37°C下孵育20min。横 坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。探针的激发波长为495nm，发射波长为512nm，测试效 果显示如图1，可以看出，在512nm处荧光随着C0RM-2浓度增大，荧光逐渐增强。可以说明本 探针可以用于C0的检测，其孵育时间仅为20min，时间短，检测速度快。
[0083] 2.本发明实施例1的探针ACP-C0的选择性实验。将5. ΟμΜ的探针ACP-C0分别与不同 的生物活性物质如活性氧.〇H、HS-和巯基小分子Hcy、Cys、GSH以及还原性 物质Vc、Fe 2+孵育，将其荧光强度与探针孵育C0RM-2对比。测试结果如图2,可以说明本发明 的探针ACP-C0的选择性高，其它生物活性小分子不干扰。
[0084] 3.本发明实施例1的探针ACP-⑶的相对荧光强度和⑶RM-2的浓度的工作曲线，如 图3;横坐标为C0RM-2的浓度，纵坐标为相对荧光强度。
[0085] 4 .本发明实施例1的探针ACP-⑶对人肝癌细胞（HepG2)的激光共聚显微成像； HepG2细胞由高糖的DMEM培养液培养，成像前，细胞贴壁于盖玻片上，然后加入5μΜ探针的 PBS缓冲液，37°C孵育10分钟，加入200μΜ C0RM-2,然后进行激光共聚焦显微成像。其结果如 图4,图a为405nm激光器激发下采集430-480nm的细胞核染料DAPI的细胞成像图，可以观察 到细胞核被染色，细胞保持很好的活性。图b为488nm激光器激发下采集500-550nm的细胞成 像图，探针ACP-C0其在细胞质有明显的染色。图c为图a与图b的叠加图，图d为细胞明场图， 以表明细胞在整个实验过程中仍保持良好的细胞活力。
[0086]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对发明保护范围 的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需 要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种检测细胞内CO的荧光探针，其特征是，结构式如下：其中，R为 H、-CH3、-CH2CH3 或-COOEto2. -种检测细胞内CO的荧光探针的制备方法，其特征是，将对硝基苯甲酰氯、二甲基吡 咯和三氟化硼乙醚，或对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反应生成硝基 苯基氟硼二吡咯，然后将硝基苯基B0DIPY中的硝基还原成氨基，再加入亚硝酸盐和3,5-二 甲基苯酚偶氮化反应，最后加入钯盐进行环钯化反应得到目标产物，即检测细胞内C0的荧 光探针。3. 如权利要求2所述的一种检测细胞内C0的荧光探针的制备方法，其特征是，步骤如 下： (1) 将对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍生物溶解于 溶剂1中，加热回流后冷却，加入溶剂2,加入三氟化硼乙醚升温反后得到5,5_二氟_1，3,7， 9-四甲基-10-(4-硝基苯基)-5Η-4λ 4,5λ4-二吡咯[1，2-(：:2'，1'-幻[1，3,2]二氮杂硼，即硝 基苯基B0DIPY; (2) 将硝基苯基B0DIPY和甲酸铵溶于溶剂中，然后加入Pd/C搅拌反应后即得氨基苯基 B0DIPY； (3) 将氨基苯基B0DIPY和浓盐酸溶于溶剂中，加入亚硝酸盐溶液，搅拌后，加入3，5-二 甲基苯酚的碱溶液搅拌后得到偶氮B0DIPY; (4) 将偶氮B0DIPY染料溶解于溶剂中，然后加入PdCl2,室温搅拌过夜后，即得检测细胞 内C0的荧光探针。4. 如权利要求3所述的一种检测细胞内C0的荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤 (1) 的具体步骤为:将对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯，或对硝基苯甲酰氯和二甲基吡咯衍生 物解于CH2C1 2中，加热回流1-2h，冷却后加入三乙胺、甲苯，待反应10-20分钟后加入三氟化 硼乙醚，升温至50-60°C反应2-4小时，旋干，用色谱柱分离，所得固体即硝基苯基B0DIPY; 所述的硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯或二甲基吡咯衍生物、三乙胺、甲苯、三氟化硼乙醚 及 CH2CI2 的用量比为 7-10:7-20:3.5-5.5:30-50:3-6:20-50，g:g:mL:mL :mL:mL;色谱柱分离 洗脱剂比例为Va鍵:4-6:1。5. 如权利要求3所述的一种检测细胞内C0的荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤 (2) 的具体步骤为:将硝基苯基B0DIPY、甲酸铵溶于CH2C12，然后加入Pd/C，常温搅拌1-3小时 后过滤，将滤液旋干得氨基苯基B0DIPY;所述的硝基苯B0DIPY、甲酸铵、Pd/C、CH 2C12的用量 比例为：5~10:50~70:1~5:10-30，g:g:g:mL。6. 如权利要求3所述的一种检测细胞内CO的荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤 (3) 的具体步骤为:将氨基苯基B0DIPY、浓盐酸溶于DMF中，加入亚硝酸钠水溶液，在0-5 °C下 搅拌3_4h，然后将其缓慢滴加到3，5-二甲基苯酚的NaOH溶液中，在0-5°C下搅拌4-5h，过滤 后的滤渣色谱柱分离，得黄色固体偶氮B0DIPY; 所述的氨基苯基B0DIPY、浓盐酸、DMF、亚硝酸钠、3,5-二甲基苯酚、似0!1、水的用量比为 1-3:3-5:10-15:3-5:3-5:4-8:20-30，g:mL:mL:g :g:g:mL;色谱柱分离洗脱剂比例为 Vn甲焼： V? 麵=1_3:2〇7. 如权利要求3所述的一种检测细胞内C0的荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤 (4) 中的溶剂为0130!1;所述的偶氮肋01?￥、0130!1、？(1(：1 2的用量比例为5~10:10~30:10~ 20，g:mL:g〇8. -种如权利要求1所述的检测细胞内CO的荧光探针在检测细胞内CO中的应用。9. 一种检测细胞内C0的方法，其特征是，步骤为： (1) 将权利要求1所述的检测细胞内C0的荧光探针溶解于生理盐水、缓冲或者培养液 中，配制成储备液储存待用； (2) 将步骤(1)中的储备液加入含有细胞组织的适当缓冲液进行测试。10. -种检测活细胞内C0的方法，其特征是，步骤为： (1) 将含有权利要求1所述的检测细胞内C0的荧光探针的缓冲溶液5-10μΜ加入培养好 的细胞放于培养箱是孵育8-12分钟； (2) 将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像，如果是 检测内源性物质，刚是直接进行共聚焦成像，而如果是外加检测的，刚是加了待检测物质 后，再次孵育8-12分钟，然后进行成像。
【专利摘要】本发明公开了一种检测细胞内CO的荧光探针及其制备方法和应用，一种检测细胞内CO的荧光探针，结构式如下：其中，R为H、-CH3、-CH2CH3或-COOEt。本发明合成新型环钯基团能够对CO的响应性更快更灵敏，其与BODIPY结合后不仅提高了对CO的选择性，而且实现更快更灵敏的检测CO。其制备方法是对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，或对硝基苯甲酰氯、二甲基吡咯衍生物和三氟化硼乙醚反应生成硝基苯基氟硼二吡咯(硝基苯基BODIPY)，然后将硝基苯基BODIPY中的硝基还原成氨基，再加入亚硝酸盐和3,5-二甲基苯酚偶氮化反应，最后加入钯盐进行环钯化反应得到目标产物，即检测细胞内CO的荧光探针(ACP-CO)。本发明合成方法简单，适于工业化生产。
【IPC分类】C12Q1/02, C09K11/06, G01N21/64, C07F15/00
【公开号】CN105623647
【申请号】CN201610069351
【发明人】唐波, 王栩, 李勇, 解希雷, 李萌萌
【申请人】山东师范大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月29日