入到10ml冰水中，沉淀产物，得到淡黄色沉淀，真空过滤，用重蒸水彻底清洗，真空干燥。
[0084](3)、得到BCPDA:取上述得到的固体0.42g，分批缓慢加入到搅拌着的2.1ml冷的97 %的冷氯磺酸中，油浴加热，维持温度80 0C4h，当反应物自然冷却到室温后，小心将其加入到80ml搅拌着的冰水中，外面还要冰浴;立即有淡黄色固体生成。将其在真空过滤，用冷去离子水，快速冼至中性；真空(0.1torr)干燥12h，得到一定数值(0.1484g)的BCPDA(C26Hi4Cl2N2S208M=617)。
[0085]具体实施例5制备BCPDA-Eu3+荧光纳米微球:
[0086](D、原材料预备:
[0087]按重量预备原材料:30g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.1Og过硫酸钾(KPS)、12g苯乙烯(St)、120ml乙醇或水和4，7-二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸(BCPDA);
[0088](2)、制备复合微球:
[0089]I)、制备氨基化纳米微球:
[0090]将30g聚乙烯吡咯烷酮、0.1(^过硫酸钾、128苯乙烯加入到12011^乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中，通氮气排除体系中的氧气，开启超声波发生器进行聚合反应，在反应10小时后得到聚苯乙烯纳米微球分散液；[0091 ]离心搜集聚苯乙稀纳米微球，以5mL无水乙醇悬浮，加入5yL氨基娃烧，室温搅拌反应I小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集；
[0092]2)、制备稀土荧光纳米微球:
[0093]将4，7_二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸(80?04)配制成111^/1^，按等体积加入到氨基化纳米微球悬浮液中，室温避搅拌15min，离心收集，悬浮于50mmol/L pH = 7.8磷酸盐缓冲液中，加入等体积0.lmol/L EuC13溶液，室温避光搅拌反应lOmin，
[0094]离心收集后悬浮于等体积无水乙醇溶液中，加入5yL氨基硅烷，室温搅拌反应I小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集，即得到稳定的稀土荧光标记的复合微球标记物。
[0095]具体实施例6制备BCPDA-Eu3+荧光纳米微球:
[0096](I)、原材料预备:
[0097]按重量预备原材料:25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.06g过硫酸钾(KPS)、1g苯乙烯(St)、100ml乙醇或水和4,7-二氯磺基苯-1,10菲咯啉-2,9二羧酸(BCPDA);
[0098](2)、制备复合微球:
[0099]I)、制备氨基化纳米微球:
[0100]将25g聚乙烯吡咯烷酮、0.06g过硫酸钾、1g苯乙烯加入到10mL乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中，通氮气排除体系中的氧气，开启超声波发生器进行聚合反应，在反应8小时后得到聚苯乙烯纳米微球分散液；
[Ο?Ο? ]离心搜集聚苯乙稀纳米微球，以5mL无水乙醇悬浮，加入5yL氨基娃烧，室温搅拌反应I小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集；
[0102]2)、制备稀土荧光纳米微球:
[0103]将4，7_二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸(80?04)配制成111^/1^，按等体积加入到氨基化纳米微球悬浮液中，室温避搅拌15min，离心收集，悬浮于50mmol/L pH = 7.8磷酸盐缓冲液中，加入等体积0.lmol/L EuC13溶液，室温避光搅拌反应lOmin，
[0104]离心收集后悬浮于等体积无水乙醇溶液中，加入5yL氨基硅烷，室温搅拌反应I小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集，即得到稳定的稀土荧光标记的复合微球标记物。
[0105]其中BCPDA激发光、发射光测定:
[0106]取0.0023g BCPDA溶于37ul水中，配制成10—Vol/L母液，稀释成10—3mol/L，取
1.5ml与同摩尔浓度的EuCl31.5ml混合均匀测定荧光值。
[0107]所述4，4，-双(I，I，I，2，2，3，3_七氟_4，6_己二酮基)氯磺基_邻-三联苯或4，7-二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸与乙醇或水的体积比为3:1。
[0108]所述聚合反应过程中通循环水维持的反应温度为60°C，且保持恒定的功率300W和恒定的氮气气流速;所述氮气气流速根据使用氮气管道的直径不同而不同，通常情况下是2-3个氮气气泡/秒。
【主权项】
1.一种稀土荧光标记的复合微球标记物，其特征在于，先将聚乙烯吡咯烷酮、过硫酸钾、苯乙烯加入乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中，在氮气的保护下产生聚合反应;在一定温度下、且保持恒定的功率和氮气气流速，反应一定时间后得到聚苯乙烯纳米微球分散液;再利用带有活性基团的有机硅烷在二氧化硅微球引入活性基团，再将稀土荧光络合物4，7-二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸-铕或4，4，-双(I，I，I，2，2，3，3，-七氟_4，6,-己二酮基)氯磺基-邻-三联苯-铕通过化学键合的形式固定于二氧化娃微球的表面，而后在微球表面以带有活性基团的有机硅烷再次引入活性基团，制成稀土荧光标记的复合微球标记物。2.—种如权利要求1所述的一种稀土荧光标记的复合微球标记物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)、原材料预备: 按重量预备原材料:15_30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.10g过硫酸钾、8-12g苯乙烯、80-l20ml乙醇或水和4，4，-双(l ,1,1,2,2,3,3 h氣_4，6_己二酬基)氣横基-邻-二联苯； (2)、制备复合微球: 1)、制备氨基化纳米微球: 将15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^过硫酸钾、8-128苯乙烯加入到80-1201111乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中，通氮气排除体系中的氧气，开启超声波发生器进行聚合反应，在反应6-10小时后得到聚苯乙烯纳米微球分散液； 离心搜集聚苯乙稀纳米微球，以5mL无水乙醇悬浮，加入5yL氨基娃烧，室温搅拌反应I小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集； 2)、制备稀土荧光纳米微球: 将4，4，-双(1,1,1,2,2,3,3h氣-4,6-己二酮基)氯横基-邻-二联苯配制成lmg/mL，按等体积加入到氨基化纳米微球悬浮液中，室温避搅拌15min，离心收集，悬浮于50mmol/L、pH值=7.8的磷酸盐缓冲液中，加入等体积0.lmol/L氯化铕溶液，室温避光搅拌反应1min， 离心收集后悬浮于等体积无水乙醇溶液中，加入5yL氨基硅烷，室温搅拌反应I小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集，即得到稳定的稀土荧光标记的复合微球标记物。3.—种如权利要求1所述的一种稀土荧光标记的复合微球标记物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)、原材料预备: 按重量预备原材料:15-3(^聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^过硫酸钾、8-128苯乙烯、80-120ml乙醇或水和4，7-二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸； (2)、制备复合微球: 1)、制备氨基化纳米微球: 将15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^过硫酸钾、8-128苯乙烯加入到80-1201111乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中，通氮气排除体系中的氧气，开启超声波发生器进行聚合反应，在反应6-10小时后得到聚苯乙烯纳米微球分散液； 离心搜集聚苯乙稀纳米微球，以5mL无水乙醇悬浮，加入5yL氨基娃烧，室温搅拌反应I小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集； 2)、制备稀土荧光纳米微球: 将4，7-二氯磺基苯-1，10菲略啉-2，9二羧酸配制成lmg/mL，按等体积加入到氨基化纳米微球悬浮液中，室温避搅拌15min，离心收集，悬浮于50mmoI/L、pH值=7.8的磷酸盐缓冲液中，加入等体积0.lmol/L氯化铕溶液，室温避光搅拌反应1min， 离心收集后悬浮于等体积无水乙醇溶液中，加入5yL氨基硅烷，室温搅拌反应I小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集，即得到稳定的稀土荧光标记的复合微球标记物。4.根据权利要求2或3所述的一种稀土荧光标记的复合微球标记物的制备方法，其特征在于，所述4，4，-双(I，I，I，2，2，3，3-七氟-4，6-己二酮基)氯磺基_邻-三联苯或4，7-二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸与乙醇或水的体积比为3:1。5.根据权利要求2或3所述的一种稀土荧光标记的复合微球标记物的制备方法，其特征在于，所述聚合反应过程中通循环水维持的反应温度为60-80°C，且保持恒定的功率300W和恒定的氮气气流速。
【专利摘要】一种稀土荧光标记的复合微球标记物及其制备方法。本发明涉及功能高分子生物材料技术领域，其制备方法是：先将聚乙烯吡咯烷酮、过硫酸钾、苯乙烯加入乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中，在氮气的保护下产生聚合反应后得到聚苯乙烯纳米微球分散液；再将稀土荧光络合物4,7-二氯磺基苯-1,10菲咯啉-2,9二羧酸-铕或4,4,-双(1,1,1,2,2,3,3,-七氟-4,6,-己二酮基)氯磺基-邻-三联苯-铕通过化学键合的形式固定于二氧化硅微球的表面，最终制成稀土荧光标记的复合微球标记物；本发明具有荧光寿命长、稳定性好、易合成、成本较低和易标记的优点。
【IPC分类】C09K11/06, C09K11/02, B01J13/02
【公开号】CN105623651
【申请号】CN201610126200
【发明人】曾骥孟, 胡鹏, 唐振洲, 蒙明慧, 林辉暖
【申请人】江苏医诺万细胞诊疗有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月7日