专利名称：编码脱硫生物催化剂的重组dna的制作方法
矿物燃料中的硫污染物会在炼油厂成本高昂的精馏过程中造成许多问题。存在于矿物燃料中的硫污染物属于下列总的分类中的任何一种矿化(无机的，例如黄铁矿)硫和有机硫(与碳分子共价结合的硫，称为有机硫化合物)。硫的存在已关系到管道、泵和炼油设备的腐蚀以及内燃机的过早损坏。硫还毒害许多在精炼矿物燃料过程中所用的催化剂。此外，硫燃烧产物(例如二氧化硫)在大气中散发导致被称为酸雨的酸沉淀物形成。酸雨对于水生动植物和森林生态系统以及位于燃烧设备顺风地带的农田有持久的损害(Monticello，D.J.and W.R.Finnerty，1985，Ann.Rev.Microfiol 39∶371-389)。按有关法规(例如1964年制订的清洁空气条例)要求，应该从实际上所有的煤和石油基燃料中除去燃烧前或者燃烧后的硫。由于增加利用更低级别、更高含量硫矿物燃料作为清洁燃烧、低硫石油储备的需求趋于不复存在，以及立法当局对硫散发的要求不断降低，因而，人们对有关法规的遵守已日渐成为问题(Monticello，D.J.and J.J Kilbane，“Practical Considerations in Biodesulfurization of Petroleum”，IGT′S 3d Intl.Symp.On Gas，Oil.Coal.and Env.Biateeh.，Dec.3-5，1990 New Orleans，L A.)。
目前用于燃烧前从液体矿物燃料(例如汽油)中除去有机硫的一种技术是加氢脱硫(HDS)。HDS适用于矿物燃料中的有机硫化合物在已有的硫污染物中占重要(例如大部分)比例的燃料脱硫。因此HDS可用于处理原油或沥青、汽油馏出液馏份或精炼的中间体、液体发动机燃料等有关HDS的更具体的描述可参见下列文献Shih，S.S.et al.，“Deep Desulfurization of Distillate Componets”，Abstract No.264B AIChE Chicago Annual Meeting，1990，11.12(全文可从美国化学工程研究所索取);Gary，J.H.and G.E.Handwerk，1975.Petroleum RefiningTechnology and Econamics，Marcel Dekker，Inc.，New York，pp114-120;Speight，J.G.，1981，The Desulfurization of Heavy oils and Residue，Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.119-127。HDS是以在金属催化剂存在下将有机硫还原转变为硫化氢(H2S)为基础的。HDS是在升高的温度和压力条件下进行的。经HDS产生的H2S是一种腐蚀性气体物质，其可借助已知技术从矿物燃料中除去。已知H2S水平的升高或维持存在会毒害(失活)HDS催化剂，这将使得对硫含量高的液体矿物燃料进行的脱硫变得复杂化。
煤和石油矿物燃料中所含的有机硫以无数种化合物形式存在，其中一些被称为是不稳定的，它们易于脱硫;其它一些则被称为是高熔点的，它们不易于受常规脱硫处理如HDS的影响(Shih，S.S.etal.，)。甚至常常必须利用一种装置如烟道涤气器对已经过HDS处理的矿物燃料进行燃烧后脱硫。安装烟道涤气器非常昂贵，而且保养起来很困难，尤其是对于较小的燃烧设备。此外，在上面提到的因硫产生的问题中，结合使用烟道涤气器与HDS所涉及的是环境酸沉积，而不是其它的与硫相关的问题，如腐蚀机器和损害催化剂。
在认识到HDS的上述及其它不足之处后，许多研究者致力于开发利用微生物脱硫(MDS)。MDS一般被描述为利用适宜微生物的代谢过程对矿物燃料脱硫。因此，典型的MDS包括温和的条件物催化剂可以是含有本发明的DNA，并表达由之编码的酶的存活的(例如培养的)或非存活的(例如加热杀死的)非人宿主生物体，或者可以是由所说生物体衍生并含有所说生物催化酶的无细胞制剂。
另一方面，本发明涉及利用上述非人生物体使矿物燃料脱硫的方法，其中所用的生物体表达一种脱硫生物催化剂。另外，本发明涉及利用含有从所说生物体分离出的一种或多种酶的生物催化剂制剂使矿物燃料脱硫的方法。本发明的方法包括1)将所说的生物体或由之得到的生物催化剂制剂与含有有机硫的矿物燃料接触，形成混合物;2)针对由生物体表达或制备的生物催化剂，将混合物保温足够的时间以脱去矿物燃料中的硫。保温后所得的，经生物催化处理过的矿物燃料与相应的未处理矿物燃料样品相比，有机硫化合物的含量明显减少。
另一方面，本发明涉及与本发明的重组DNA杂交的核酸探针。
另一方面，本发明涉及生产含有本发明的重组DNA、并最好能表达其中编码的生物催化剂的新的非人生物体。本发明的重组DNA的可得性大大简化并方便了用于矿物燃料脱硫的生物催化剂的生产和纯化。生物催化剂纯化过程中所牵涉到的成本和时间消耗可以减小，而不必再从天然存在的或经诱变产生的一种或多种非人生物体中产生生物催化剂。更具体地说，可以生产以高水平表达本发明基因的非人宿主生物体。此外，本文所描述的发明还进一步发现了在另外的非人宿主生物体中编码脱硫生物催化剂的基因。这一目的是利用本发明的核酸探针对由已知或可疑存在生物催化功能的一种或多种其他生物体中制得的DNA文库进行筛选而实现的。可以利用已知技术，例如聚合酶链反应(PCR)，大规模地复制存在于上述生物体中并编码脱硫生物催化剂或其成分的任何基因。PCR的优点在于不必为了获得大量目的DNA而例如在培养基中培养非人生物体。
图1为流程图，说明分离本发明的重组DNA的分步过程。
图2图解说明玫瑰色红球菌复制能力和氯霉素抗性载体 pRF29，所说的载体衍生于Rhodococcus faciens。
图3图解说明玫瑰色红球菌复制能力和氯霉素抗性载体pRR-6。
图4图解说明DNA质粒pTOXI-1的限制图，该质粒编码能够裂断碳-硫键的生物催化剂。
图5图解说明衍生于质粒pTOXI-1的亚克隆pMELV-1的限制图。
图6图解说明pMELV-1的限制图及其插入到亚克隆pSMELV-1A、pSMELV-2A、pSMELV-3A和pSMELV-4A中的片段的限制图。
图7图解说明pTOXI-1顺序中三个非常邻近的开放读码(DRFs;具体地说是ORF1、ORF2和ORF3)的推测位置，所说的ORF编码负责Dsz+表型的多肽表达产物。
图8图解说明pTOXI-1的限制图及其插入到亚克隆pENOK-1、pENOK-2、pENOK-3、pENOK-14、pENOK-13、pENOK-16、pENOK-18、pENOK-Nsi、pENOK-19和pENOK-20中之片段的限制图。
图9图解说明pRR-12的限制图。
图10图解说明pKAMI的限制图。在下面的插图中详细显示了pKAMT中的工程克隆位点。
图11图解说明pSBG-12的限制图，其中，来自pTOXI-1的无启动子Dsz基因群的表达是由氯霉素抗性启动子驱动的。
在石油提炼和精馏技术中，术语“有机硫”通常是指具有共价结合了一个或多个硫原子(称为杂原子)之烃骨架的有机分子。这些硫(例如室温和生理条件)而不涉及HDS所要求的极端温度及压力。一般还认为生物脱硫剂的优点在于能够在适宜条件下自身更新或补充。有关微生物脱硫技术的综述可参见Monticello and Finnerty，1985，39 ANN.REN.MI(ROBIOL.371-389;Bhadra et al.，1987，5 BIOTECH.ADV.1-27;Hartdegan et al.，1984，5 CHEM.ENG.PROGRESS 63-67;Kilbane，1989，7 TRENDS BIOTECHNOL.No.4，97-101，它们提供了有关该领域中进展的附加评论。
一些研究者报道了用诱变剂处理天然存在的微生物，使之成为得有分解硫芴(DBT)之能力的突变株(Hartdegan F.J.et al.，1984.5，Chen.Eng.Progress 63-67)。DBT是见于矿物燃料中的有机硫分子的代表，很难用HDS从其中除去硫。所报道的突变微生物中的大多数是通过裂解C-C键非特异性地作用于DBT，以释放出较小有机裂解产物形式的硫。微生物的这种作用的结果之一是使所处理的矿物燃料的燃烧值降低。但是，Isbister和Doyle的美国专利4，562，156中报道了假单孢子菌属突变菌株的衍生，所说的突变菌株似乎能够从DBT中选择性释放出硫，从而保持被处理的矿物燃料的燃烧值。
Kilbane最近报道了对混合细菌培养物的诱变，生成了能够通过氧化途径从DBT中选择性释放硫的细菌群体(Resour.Cons.Recycl.3∶69-79，1990)。随后从该群体中分离一株玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)。该菌株已按布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心，登记号为ATCC 53968。该菌株还被称为IGTS8，它是本发明所描述的生物催化活性的来源。ATCC 53968菌株通过选择性地氧化裂解有机硫分子中的碳-硫键使已知存在于矿物燃料中呈有机硫形式的硫释放出来。Kilbane已在US 5，104，801中详细描述了所说菌株的分离和鉴定。
本发明的一个方面涉及到含有编码一种或多种酶之一个或多个基因的脱氧核糖核酸(DNA)分子，所说的酶可单独或彼此一起作为生物催化剂，使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫。本发明的DNA分子可从天燃来源中纯化和分离，或者可以是例如整合到非人宿主生物体基因组中的重组DNA分子的一个片段或一部分。本发明的一个或多个基因可以得自例如具有适宜生物催化活性的玫瑰色红球菌菌株。这就是说，本发明的一个或多个基因可以从非人生物体，例如微生物中获得，所说基因表达一种或多种酶，所说的酶可以单独或彼此一起作为生物催化剂。正如将在下文更详尽描述的那样，生物催化作用是对有机硫化合物中的碳-硫键进行选择性地氧化裂解。本发明特别适用于含有有机硫化合物，如DBT的矿物燃料的脱硫。
本发明进一步涉及重组DNA载体、重组DNA质粒和含有外源(重组的、异源的)DNA的非人生物体，其中的外源DNA编码能够对含有有机硫化合物的矿物燃料脱硫的生物催化剂。所说的这类生物体在本文称为宿主生物体。
因此，本文所描述的发明包括本发明基因的核糖核酸(RNA)转录本，以及本发明基因的多肽表达产物。本发明的多肽表达产物在经过必需的转录后加工和/或折叠，与必要的任何辅酶、辅助因子或辅助反应剂相结合后，形成一种或多种蛋白质生物催化剂(酶)，所说生物催化剂可以单独或彼此一起催化(启动、指导或促进)从存在于矿物燃料中的有机硫化合物除去硫。所说的催化过程是借助于选择性地氧化裂解存在于所说化合物中的碳-硫键而完成的。本发明的生原子可以通过例如一个或多个碳-硫键直接连接到烃骨架上，或者存在于连接到分子的烃骨架上的取代基，例如磺酰基基团(含有碳-氧-硫共价键)中。具有一个或多个硫杂原子的有机分子总类被称为“有机硫化合物”。这些化合物的烃部分可以是脂族、芳香族或部分脂族和部分芳香族的。
所谓“带有硫原子的杂环”指的是环化或缩合的多环有机硫化合物，其中一个或多个硫杂原子通过芳香族的碳-硫键连接到烃骨架中的相邻碳原子上。鉴于五元芳香环上存在硫杂原子，所以将存在于许多类型的带硫杂环中的硫称为“噻吩硫”。最简单的这类含硫杂环是其组成为C4H4S的噻吩。
已知含硫杂环对常规的脱硫处理，如HDS是稳定的。由于这一原因，故一般认为所说的杂环对HDS处理难以奏效或有强烈的对抗性。含硫杂环可以有相对简单或相对复杂的化学结构。在复杂的杂环中，可以存在多个缩合的芳香环，其中的一个或多个可以是杂环。随着分子的结构复杂化，脱硫的难度也随之增大(Shih et al.)。这就是说，对于复杂的含硫杂环，如二苯并噻吩(DBT，C12H8S)接受脱硫处理的难度尤为突出。
DBT是一个具有综合、多芳香环结构的含硫杂环，其中的五元噻吩环的两侧接有两个六元苄环。在矿物燃料精炼中间体和可燃产物中，大多数HDS后残余的有机硫是噻吩硫。该残余噻吩硫的大部分存在于DBT及其具有一个或多个烷基或芳基的衍生物中，所说的烷基或芳基附接于一侧或两侧翼苄环的一个或多个碳原子上。因而认为这类DBT衍生物的用这些基团“修饰”了的。在有关技术中，DBT本身被用作说明包括DBT及其烷基和/或芳基修饰的衍生物在内的一类化合物在涉及噻吩硫的反应中之习性的模式化合物(Monticello and Finnerty，1985，Microbial desulfurization of fossil fuels，39 ANNUAL REVIEWS IN MICROBIOLOGY，371-389)。DBT及其经基团修饰的衍生物在特定的原油、煤和沥青总硫含量中占有显著的百分比。例如，有报道说含硫杂环在西德克萨斯原油的总硫含量中占70wt%，而在一些中东原油的总硫含量中占到40wt%。因此，DBT作为模式化合物被认为与在矿物燃料例如特定地理来源的原油、煤或沥青和各种精炼中间体以及由它们制得的燃料产物中所见的噻吩硫形成特别相关。DBT和其经基团修饰的衍生物的另一个特征是在矿物燃料释放入环境中后，这些含硫杂环保持很长的一段时间而未发生明显的生物降解作用(Gundlach et al.，1983，221 SCIENCE122-129)。因此，最通用的天然存在的微生物不能有效地代谢和分解含硫杂环。
适合于根据本发明进行脱硫处理的矿物燃料含有有机硫。这类矿物燃料称为“底物矿物燃料”。富含噻吩硫(其中，总的有机硫之大部分是噻吩硫，以含硫杂环，如DBT形式存在)的底物矿物燃料特别适合用本发明描述的方法脱硫。这类底物矿物燃料的例子包括Cerro Negro或Orinoco重原油;Athabascan焦油和其它类型的沥青;石油精炼馏份如轻循环油、重常压瓦斯油和1号柴油;以及由3号Pocahontas，Lewis-Stock，Australia Glencoe或Wyodak煤等来源所制得的煤衍生的液体。
生物催化脱硫(生物催化作用或DBS)是借助于生物催化剂选择性氧化裂解有机硫化合物中的碳-硫键而使化合物中硫排出(释出或除去)，所说的有机硫化合物包括难以处理的有机硫化合物，如含硫杂环。BDS处理产生前述难处理之有机硫化合物的脱硫可燃烃骨架，以及无机硫底物，并可借助已知技术如分馏法或水萃取法很容易地将它们彼此分开。例如，当进行BDS处理时，DBT被转化为羟基二苯或二羟基二苯。借助包括一种或多种功能性表达一种或多种酶的非人生物体(如微生物)的生物催化剂进行BDS，经选择性裂解包括含硫杂环在内的有机硫化合物中的碳-硫键而从所说化合物中除去硫，所说的生物催化剂或者包括从上述微生物中获得的一种或多种酶，或者包括所说微生物与酶的混合物。显示出生物催化活性的生物体在本文称为CS+或Dsz+，反之则称为CS-或Dsz-。
综上所述，本文所描述的发明一方面涉及含有编码生物催化剂基因的DNA分子及其片段，所说的生物催化剂能够使含有有机硫化合物的矿物燃料脱硫。本发明的DNA分子或其片段可以是从例如天然来源中获得的纯化和分离的DNA，或者可以是例如存在于非人宿主生物体中的重组(异源或外源)DNA。下面的讨论不能被看作是以任何方式对本发明进行限制，而是为了说明本发明而提出的，它详细说明了从已知能表达适宜生物催化活性的玫瑰色红球菌菌株(ATCC53968)中分离编码脱硫生物催化剂的DNA。这一优选的玫瑰色红球菌菌株已在US5，104，801(1992年出版)中公开，其中公开的技术内容并入本文作为参考，所说菌株在上述专利文献中称为IGTS8。IGTS8是由Institute of Gas Technology in Chicago IL的研究人员开发的。已知能表达适宜生物催化活性并因此而作为本发明DNA的合适来源的其它生物包括US5，002，888中公开的(保藏于美国典型培养物收集中心，ATCC 53969)和Omori等人(Omori et al.，1992，Desulfurization of dibenzothiophene by Corynebacteriumsp.strain SYI，58 APPL.ENV.MICROBIOL.NO.3 911-915)描述的棒状杆菌属细菌。图1已对从ATCC53968菌株中分离本发明DNA的程序作了图解说明，下面将对此进行详细描述。
将表现出生物催化活性(即CS+或Dsz+)的玫瑰色红球菌(例如ATCC 53968)在本领域技术人员已知或易于了解的条件下暴露于突变剂，产生不能够裂解碳-硫键(CS-或Dsz-)的玫瑰色红球菌突变株。适宜的诱变剂包括辐射(如紫外线辐射)和化学诱变剂如N-甲基-N′-亚硝基胍(NTG)、羟胺、乙基-甲磺酸盐(EMS)和亚硫酸。使如此产生的突变株在合适的培养基中生长，并基于碳-硫键裂解活性筛选之。将鉴定为缺乏碳-硫键裂解活性的突变株称为CS-。任何能够准确地检测碳-硫键断裂活性的筛选方法都适用于本发明。适用于活性筛选的方法包括使不同的突变株与含有碳-硫键的分子(例如DBT)接触，并检测碳-硫键的断裂情况。在一优选实施方案中，使突变株与DBT接触，从而产生在短波紫外光下发射荧光的裂解产物羟基联苯(HBP)。也可以用Gibbs′试剂通过HBP的兰色反应产物对其进行比色检测。其它的方法包括气相和液相色谱法、红外和核磁共振分光光度法(参见Kadama et al.，Applied and Environmental Microbiology，Pages 911-915，1982;Kilbane and Bielaga，Final Report D.O.E.Contract NO.DE-AC22-88PC8891，1991)。一旦鉴定和分离出CS-突变株，即可利用标准技术繁殖该突变株的克隆，并用于进一步的分析。
在如上述诱变CS+生物体玫瑰色红球菌培养物的同时，仍维持培养同-CS+生物体(1)第二培养物。从该玫瑰色红球菌的培养物中提取CS+生物体DNA(3)。各种DNA提取法都适用于从该生物体中分离DNA。合适的方法包括酚-氯仿提取法(参见Maniatis et al，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d.Cold Spring Harbor Laboratory Press，page16.54 1989，本文称为Manual et al.)。
一旦从玫瑰色红球菌1中提取出DNA后，即将DNA切割成不同Kb长度的片段，选择性地将其构成DNA文库5。可利用各种方法将玫瑰色红球菌DNA裂解成片段并从中纯化DNA包括本发明的DNA，所说的方法例如酶学方法和机械方法。任何识别4个碱基的限制性核酸内切酶例如Taq I或Sau 3A都适用于裂解所说的DNA。Maniatis等人描述了裂解DNA的合适方法。
将不同的DNA片段插入到玫瑰色红球菌(2)的几个CS-突变株克隆中，以分离编码本发明生物催化剂的DNA片段。以前将CS-突变细胞转化成为CS+转化细胞的工作即证明插入的DNA片段编码生物催化剂。任何将DNA插入玫瑰色红球菌中使所说片段得到被摄取和表达的方法都是适用的。在优选实施方案中，用电穿孔技术将DNA片段导入玫瑰色红球菌中(参见Maniatis et al.，)。
一旦转化后，即产生CS+突变玫瑰色红球菌7，然后进行鉴定，并可从突变株中鉴定和分离编码CS+生物催化剂的DNA片段9。可利用按本领域技术人员已熟知或易于了解到的各种方法分离的DNA生产其编码的生物催化剂。此外，还可以借助已知技术(例如参见Maniatis et al.，)对分离的DNA测序和复制分离的DNA。
如前所述，用于分离本发明DNA的上述方法可应用于玫瑰色红球菌微生物例如ATCC 53968菌株微生物以外的CS+生物体。因此，可使用B.sulfasportare ATCC53969和棒状杆菌SY1作为本发明DNA来源的生物体。而且，本发明的DNA一经被分离即可转染至除了来源生物体的CS-突变株以外的非人宿主生物体中。因此，可将本发明DNA转染到例如适宜的大肠杆菌菌株中。还可以应用其它类型的非人宿主生物体，包括单细胞生物体(例如酵母)和存在于多细胞生物体之培养物中的细胞。
分离本发明DNA的其它方法包括在前文所述及图1所示的基本原理基础上改进的方法。例如，有可能将CS-DNA质粒随机插入玫瑰色红球菌CS+菌株的克隆中。然后借助于筛选已从CS+转化为CS-的克隆来鉴定编码CS+生物催化剂的DNA。
本发明的重组DNA分子或其片段将包括借助化学或生物学手段在核酸链中插入编码能选择性残断碳-硫键的生物催化剂的一个或多个基因所得到的任何DNA。所说的基因并非天然存在于所插入的核酸链中。重组DNA包括借助限制性核酸内切酶、核酸杂交、DNA克隆、DNA测序或上述方法相结合的方式构建的DNA。构建方法包括Maniatis等人描述的以及本领域技术人员已知的其它方法。
用于构建本发明DNA质粒或载体的方法包括那些Maniatis等人所描述的以及本领域技术人员已知的其它方法。适宜的质粒载体包括分别示于图2或图3中的pRF-29和pRF-6。术语“DNA质粒”和“载体”意在包括任何复制感受态质粒或载体，其能够借助化学或生物学方法将外源或异源DNA插入其中，继而在将DNA质粒和载体转染到合适非人宿主生物体中后能够表达外源或异源DNA插入段的产物(即能够表达本发明的生物催化剂)。此外，质粒或载体必须易于接受含有本发明的一种或多种基因的DNA分子或其片段的插入，所说的基因编码选择性断裂有机硫化合物中碳-硫键的生物催化剂。构建DNA质粒载体的方法包括由Maniatis等人所描述的以及本领域技术人员已知的其它方法。
本发明的质粒包括含有编码选择性断裂有机硫化合物中碳-硫键之生物催化剂的一个或多个基因的任何DNA片段。术语“质粒”意在包括任何DNA片段。所说DNA片段应该可以利用转化或结合方式而转移到宿主微生物中。构建或提取DNA质粒的方法包括由Maniatis等人所述的方法以及本领域技术人员已知的方法。
本发明被转化的非人宿主生物能够利用本领域技术人员已知的各种方法获得。例如，可利用Maniatis等人所述的转染电穿孔法。术语“非人宿主生物体”是指能够摄入并表达外源、异源或重组DNA(即DNA并非原始生物体之核物质的一部分)的任何非人生物体。
本发明的矿物燃料脱硫方法涉及两个方面。首先，使宿主生物体或由其获得的生物催化制剂与待脱硫矿物燃料接触。该过程可以在任何适宜容器中进行，所用容器可以配有搅拌或混合装置。将混合物充分混匀，并保温足够长时间以裂断有机硫化合物中大量的碳-硫键，从而产生脱硫的矿物燃料。在另一个实施方案中，用生物体和矿物燃料的水性培养物产生含水乳浊液，使得生物体在乳浊液中增殖，同时用表达的生物催化剂残断碳-硫键。
诸如温度、混和速率、脱硫速度这些变量可根据所用生物体的不同而变化。这些参数可通过常规实验来确定。
几种适合于监测脱硫速度和程度的方法是本领域技术人员已熟知和易于了解的。可从保温混合物中收集基线和时间进程样品，并准备用来确定矿物燃料中的残余有机硫。可使用例如X射线荧光(XRF)或原子发射光谱法(火焰光谱法)来监测从受到生物催化处理之样本所含有机硫化合物(如DBT)中脱失的硫。最好是首先用例如气相色谱法分离样品中的分子成分。
本发明的核酸探针包括任何能够至少与本发明DNA的一部分进行杂交的核材料。术语“核酸探针”包括能够与DNA杂交的任何核材料。
现将借助下面的具体实施例进一步举例说明本发明，这些实施例不能看作是以任何方式对本发明进行限制。
实施例1分离编码脱硫活性生物催化剂的DNA本文所用的术语“Dsz+”是指生物体通过选择性裂解噻吩化合物例如联苯噻吩(DBT)中的碳-硫键而利用噻吩化合物作为硫的唯一来源能力。玫瑰色红球菌菌株IGTS8显示出Dsz+表型。术语“Dsz-”是指生物体通过选择性裂解噻吩化合物中的碳-硫键而利用所说的噻吩化合物作为硫的唯一来源的。
材料细菌菌株和质粒玫瑰色红球菌菌株IGTS8(ATCC 53968)得自Institnte of Gas Technology(Chicago，IL)，它作为亲本株用于产生丧失了脱硫表型(Dsz-)的突变株。菌株IGTS8也被用于从中分离能够补充所说突变株使之成为Dsz+突变株的DNA片段。玫瑰色红球菌载体pRF-29得自Institute of Gas Technology。有关pRF-29的构建可参见Desomer，et al.，1990，Transformation of Rhodococcus fascians by High-Voltage Electropopration and Development of R.fascians Cloning Vectors，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICRO-BIOLOGY 2815-2825。pRF-29的结构示于图2中。
大肠杆菌菌株JM109在用衍生于质粒pUC18和pUC19(Bethesda Researeh Laboratories，Bathsda，MD)的质粒构建体进行转化的过程中被作为宿主。
酶和试剂限制性核酸内切酶购自Bathesda Research Laboratories(BRL)和New England Biolabs(Beverly，MA)。T4连接酶和大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段购自BRL。HKTM磷酸酶购自Epicentre Technologies(Madison，WI)。所有的酶均按制造商推荐的方法使用。酶检测底物联苯噻吩(DBT)、联苯噻吩S-氧化物(DBT亚砜)和联苯噻吩砜(DBT砜)购自Aldrich(Milwaukee，WI)。Gibb′s试剂2，6-二氯醌-4-氯酰亚胺购自Sigma(St.Louis，MO)。化学诱变剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)也购自Sigma。
生长培养基及生长条件大肠杆菌生长在LB培养液(Difco，Detroit，MI)中。在补充了1.5%琼脂和含有125μg/ml氨苄青霉素的L平板上筛选转化体。大肠杆菌在37℃下生长。红球菌菌株维持于红球菌培养基(RM)中，每升RM含有8.0g营养肉汤(Difco)、0.5g酵母提取物、10.0g葡萄糖。在添加了1.5%琼脂和含有25μg/ml氯霉素的RM平皿上筛选红球菌菌株的转化体。为了表达Dsz+表型，在基本盐培养基(BSM)中培养红球菌菌株，每升BSM含有2.44g KH2PO4、5.57g Na2HPO4、2.0g NH4Cl、0.2g MgCl2·6H2O、0.001g CaCl2·2H2O、0.001g FeCl3·6H2O、0.004g MnCl2·4H2O和6.4ml甘油。还可以在每升BSM中加入5.0g葡萄糖。红球菌菌株在30℃下生长。
方法硫生物可利用性测定可使用美国专利5，104，801中所述的硫生物可利用性测定法检测生物体从底物(如DBT、DBT亚砜、DBT砜)中释放有机结合的硫的能力，其中所说的底物被用作生物体生长所需硫的唯一来源。在该试验中，向不含硫的BSM中补充一种或多种含硫底物(例如DBT)。根据由监测OD600所知的生物体在适当培养条件下的生长能力来检测生物体从其中释放硫的能力。
2-羟联苯的Gibbs检测法与IGTS8菌株一起保温的DBT、DBT亚砜和DBT砜的氧化产物是2-羟联苯(2-HBP)。用Gibbs试验对由DBT及其上述氧化衍生物产生的2-HBP进行比色定量分析。该检测法是在与DBT保温后检测培养物上清液中产生的2-HBP。在加入Gibb′s试剂之前，必须将培养基的pH值调节到8.0。Gibb′s试剂2，6-二氯醌-4-氯酰亚胺(10mg/ml，溶于乙醇中)以1∶100(v/v)加入到培养物上清液中。在室温下保温30分钟后检测显色物在610nm处的吸光率。
2-羟联苯的HPLC检测法与DBT一起保温的2-HBP生产培养物还可借助得自Waters，Millipore Corporation，Milford，MA.的检测装置以HPLC法进行检测。为了溶解所有其余的DBT和2-HBP，向培养物液中加入1∶1(v/v)的试剂醇。将样品以220rpm搅拌5分钟。除去提取的培养液样品，并离心去除细胞团块。然后在下列条件下对澄清的上清液进行HPLC分析柱Waters 4μ Phenyl Novapak检测参数 DBT 233nm,1.0AUFS2-HBP 248nm, 0.2AUFS定量检测范围 DBT 10-250μM2-HBP 6-60μM移动相 等梯度70%乙腈 1.5ml/分钟滞留时间 DBT 4.5分钟2-HBP 2.9分钟IGTS8诱变为了产生不能代谢DBT的玫瑰色红球菌突变菌株(Dsz-突变株)，用短波紫外光灯和化学诱变剂N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(NTG)对生物催化剂来源菌IGTS8(Dsz+)进行诱变。用紫外线暴露诱变应达到大于99%的杀死率。使光密度(A660)为0.3的持续搅拌的玫瑰色红球菌细胞以10cm距离暴露由Mineralight Lamp Model UVG-254(Ultra-Violet Products，Inc.San Gabriel，CA)发出的紫外光55-65秒，以达到97.9-99.0%的杀死率。对于NTG诱变，用500μg/ml NTG处理细胞悬液一段时间，以达到30-50%的杀死率。还可以将NTG和UV两种诱变方法联合使用。为此，所用的总杀死率大于99.9%。挑出PM平皿上存活的诱变菌落，按下述方法进行Dsz-表型筛选。
筛选实施例A首先，用喷洒DBT的平板屏筛选Dsz-突变株。将突变株菌落经复制铺敷在不含硫的基本盐培养基(BSM)电泳级琼脂糖平板上。使菌落在30℃生长24小时。然后用溶解于醚中的10%DBT均匀包被喷洒平板，并在30℃下保温90分钟。继之擦净平板，并在短波紫外线灯下观察。在短波紫外线灯下观察到DBT代谢的终产物2-羟联苯(2-HBP)发出的荧光。从而，利用琼脂糖上的荧光点鉴定产生2-HBP的菌落。那些不产生2-HBP的菌落(Dsz-)不出现荧光点。
筛选实施例B一个较简单的改进的筛选方法包括将存活的突变菌落经复制铺敷到添加了DBT的饱和醇溶液(1.2ml/L)的BSM琼脂糖平板上。24小时后，可按上述方法在紫外线照射条件下观察到2-HBP的产生。
用硫生物可用性检测法检测经上述方法筛选发现没有产生2-HBP的突变株(其中以DBT作为唯一的硫来源)。分散于24孔平板(Falcon)中之BSM加DBT培养基内的1.25ml液体发酵液中检查可能的突变株的生长情况。于30℃保温1天后，用Gibbs比色测定法监测2-HBP的产生。在更大体积的BSM加DBT的培养基中培养持续表现为Dsz-表型的菌株，并用HPLC法分析2-HBP或中间产物。因为BSM是一种限定的基本培养基，所以对含有附加有机硫的重复对照培养物进行培养，以便区分真正的Dsz-突变株和营养缺陷型突变株。在对照培养基和实验培养基中都不能生长的突变株被断定为营养缺陷型突变株。
在1970个逐一分析的可能的突变株中，有两个被鉴定为Dsz-。其中一个GPE-362是经NTG诱变产生的，另外一个CPE-648是经NTG/UV联合诱变产生的。两者在硫生物可用性试验中都生长很缓慢，这可能是由于玻璃器皿上或培养基成分中有痕量的硫。然而，GPE-362和CPE-648在与DBT一起经过6-10天延长保温后，用Gillb或HPLC检测法检测均未发现有可检测量的2-HBP产生。因此，分别产生的玫瑰色红球菌IGTS8突变株GPE-362和CPE-648均为Dsz-生物体。
载体构建载体构建体衍生于玫瑰色红球菌并具有氯霉素抗性。所有构建体均在E.coli JM109中生长。按制造商推荐的方法利用Gene Pulsar(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)转化JM109。用标准方法(Birnboim and Doly，1979，A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA，7 NUCLEICACIDS RES.1513-1523;Maniatis et al.，1982，MOLECULAR CLONINEA LBORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press)从 JM109中分离质粒。用限制性酶切分析法鉴定含有正确载体构建体的转化体。
载体构建体ApRR-6(图3)含有红球菌的复制起点和氯霉素抗性标记(CmR)。Ori和CmR已作为6.9kb XhoⅠ/Xba(部分)片段从pRF-29中去除。用Klenow填平未端，并连接至经SamⅡ/XbaⅠ酶切的pKF39上。pKF39是用BgⅢ位点取代了SamⅡ位点的pUC18。可利用唯一的NarⅠ位点将其克隆在pRR-6中。NarⅠ未端与识别4个碱基的核酸内切酶TaqⅠ具有相容性。
玫瑰色红球菌的转化可用电穿孔法转化IGTS8及其Dsz-突变株。下述条件可用于所有的玫瑰色红球菌的转化过程。细胞在RM中生长至对数生长中期，经离心(5000xg)收集细胞后用冷的去离子蒸馏水洗3次，并在10%甘油中浓缩50倍。所得的细胞浓缩物可直接用于电穿孔或贮存于-80℃。
用Gene Pulser(Bio-rad)装置进行电穿孔。将100μl细胞与转化DNA在2mm的电导小池(Bio-rad)中混合，并经脉冲控制器(25μF电容器，200Ω外电阻)接受2.5kv脉冲。将经脉冲处理的细胞与400μl RM混合，并于30℃在定时搅拌下保温4小时。然后将细胞置于添加有适宜抗菌素的RM中。
在用pRF-29转化IGTS8后，可在含有25μg/ml氯霉素的平皿上清楚地选出以105-106个细胞/μg DNA的频率转化的氯霉素抗性菌落。
从玫瑰色红球菌中小规模制备质粒用玫瑰色红球菌的单个菌落接种2-7ml PM加25μg/ml氯霉素。将培养物在30℃下振荡保温2天。离心得到细胞团块并重新悬浮于300μl蔗糖缓冲液(20%蔗糖、0.05M Tris-Cl pH8.0、0.1M EDTA、0.05M NaCl和10mg/ml溶菌酶)中，于37℃保温1小时。加入300μl醋酸钾-醋酸溶液，pH4.8(60ml 5M KOAc、11.5ml冰醋酸、28.5ml去离子水)，并轻轻翻转混匀。将混合物在冰上放置5分钟，然后经离心沉淀细胞碎片。将500μl上清液移至加有0.05μg/μlRNAse的新试管中，于37℃下保温20分钟。然后用酚∶氯仿提取样品，再用等体积的异丙醇于-80℃下沉淀。离心沉淀出DNA并重新悬浮于0.3M NaOAc pH8.0中。再次用等体积异丙醇于-80℃下沉淀DNA。离心沉淀DNA重悬于0.3M NaOAc pH8.0中。再用两倍体积95%乙醇-80℃下沉淀DNA。用70%乙醇洗DNA沉淀团块，然后重新悬浮于50μl TE(Tris EDTA)中。
从玫瑰色红球菌IGTS8菌株分离基因组DNA按上述方法分离IGTS8基因组DNA。用IGTS8的单个菌落接种20ml RM，并于30℃振荡下(220rpm)保温48小时。离心(5000xg)收集细胞，并重新悬浮于含100mg溶菌酶的10ml TE(10mM Tris碱，1mM EDTA)中，于30℃保温30分钟。加入1ml20%十二烷基硫酸钠(SDS)裂解细胞。立即加入10ml用TE饱和的苯酚和1.5ml 5M NaCl并将混合物在室温下缓慢搅拌20分钟。离心除去苯酚，再用等体积氯仿将水层抽提两次。向水层中加入等体积的异丙醇以沉淀DNA。将DNA缠绕到吸管上，并重新悬浮于TE中。用RNAse(20μg/ml)于37℃下将所得的DNA处理1小时以除去RNA。使样品中含有终浓度为100mM NaCl和0.4%SDS。并用100μg/ml的蛋白酶K消化之。然后如前所述，用酚和氯仿提取样品，并用异丙醇沉淀之。将含有本发明DNA的纯化的基因组DNA重新悬浮于TE中。
IGTS8质粒文库的构建用Taq I酶切割Dsz+来源生物体(IGTS8)的基因组DNA以产生0.5-23kb长度的片段。将所得的DNA通过0.8%低熔点温度琼脂糖进行电泳，并用标准方法(Maniatis et al.，1982，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，Cold Spning Harbor Laboratory Press)分离并纯化长度大于5kb的片段。用Nar I 完全切割载体pRR-6。用HKTM磷酸酶使载体末端脱磷酸化以防止载体自身连接。将按大小分离的基因组DNA片段连接到经过酶切和脱磷酸化的pRR-6上。
Dsz-突变株CPE-648的分子补偿按前述电穿孔法用质粒文库连接混合物(见上)转化Dsz-突变株CPE-648。还进行了不含DNA的CPE-648的阴性对照转化(模拟转化)。在RM中保温4小时后，经离心法将细胞从悬液中分离出来并除去上清液。将所得细胞重新悬浮于不含硫的BSM中。用这些细胞接种250ml添加了300μl DBT之饱和乙醇溶液的BMS。通过上述步骤，即可用硫生物可用性检测法来筛选能够补偿Dsz-突变株的克隆，含有补偿顺序(即本发明的DNA)的菌株将成功地从DBT中除去硫，并能优先生长。
于30℃保温6天后，用HPLC法检测培养物中的2-HBP。在实验性培养物中检测到了2-HBP的积聚，而在对照培养物中则未检测到。将产生2-HBP的培养物散布于补充了氯霉素的RM平皿表面，以获得包含质粒的单个菌落。将这些平皿经影印转移到添加了1.2ml/L DBT的饱和乙醇溶液的BSM琼脂糖平皿上。于30℃培养24小时后，在短波紫外线照射下可于一些单个菌落周围检测到2-HBP。推测这些菌落含有通过恢复Dsz-突变株先前的Dsz+表型使之得到补偿的质粒。
补偿Dsz-突变株CPE-648的克隆的特征如前所述，两个独立的质粒文库成功地补偿突变株CPE-648使之成为Dsz+。从在BSM+DBT平皿(见上)上证实能产生2-HBP的单个菌落中分离质粒DNA，其中所说的菌落来自用两个文库各自转化的培养物。用该质粒DNA转化E.Coli JM109菌株。分离质粒DNA并用限制性核酶内切酶酶切，以制得克隆的限制性图。两个文库中的每一个都产生一个单一的补偿克隆。根据限制性图谱的相似性，两个克隆似乎都有重叠顺序。这两个克隆已被分别命名为pTOXI-1(图4)和pTOXI-2。pTOXI-1含有一个约6.6KD的插入段。pTOXI-2含有一个约16.8Kb的插入段。
Dsz-突变株GPE-362的补偿用质粒pTOXI-1和pTOXI-2转化Dsz-突变株GPE-362。作为对照，也用载体pRR-6转化GPE-362。在RM+氯霉素的平皿上筛选含有质粒DNA的转化体。将CmR菌落转移到加入DBT的BST琼脂糖平板上。于30℃保温24小时后，借助短波紫外光照射可观察到在含有pTOXI-1或者含有pTOXI-2的菌落周围产生了2-HBP。在只含有载体pRR-6的菌落周围未检测到2-HBP。
重新引入克隆的DNA后过表达Dsz+特性将质粒pTOXI-1和pTOXI-2转化到Dsz-突变株CPE-648中。在含RM+氯霉素的平皿上筛选含有质粒DNA的转化体。利用下列方法检查各个克隆的比活性。
将含有pTOXI-1或pTOXI-2的CPE-648单个菌落接种到装有25ml RM+氯霉素(25μg/ml)的250ml烧瓶中。作为阳性对照，亲本株igts8也在25ml RM中生长。于30℃下振荡(225rpm)培养48小时后，取2.5ml培养物加入25ml添加有0.7mM DMSO的BSM中。将培养物在30℃继续保温40小时。以适宜空白作对照，于600nm处测定各培养物的光密度。加入DBT使其终浓度为150μM，将培养物在30℃保温3小时。然后向各培养物中加入等体积的试剂醇(Baxter，McGaw Park，IL)，以溶解所有余留的DBT或2-HBP。取出1ml样品，并经离心除去细胞碎片。用上述HPLC检测法分析上清液中的2-HBP。比活性计作每升中2-HBP毫克数/培养小时数/OD600。上述测定结果列于表1中。
表1转化突变株的生物催化脱硫活性
实施例2用双脱氧法对来自质粒pTOXI-1脱硫活性生物催化剂进行DNA测序分析材料菌株和质粒用质粒pTOXI-1作为用于测序的DNA的来源。用E.coli JM109作为进行亚克隆和保持质粒的宿主。质粒pUC18和pUC19购自Bethesda Research Laboratary(Bathesda，MD)。
酶和试剂限制性核酸内切酶购自Bethesda Research Laboratary(BRL)和New England Bio-labs(Beverly，MA)。T4连接酶购自BRL。Sequenase Version 2.0 DNA测序试剂盒购自United States Biochemical Corporation(Cleveland，OH)。所用的酶和试剂盒均按照制造商推荐的方法使用。
生长培养基和条件包含质粒的E.coli JM109菌株在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB(Difco)中生长。在添加了1.5%琼脂并含有100μg/ml氨苄青霉素的L平皿上筛选转化体。E.coli菌株在37℃下生长。
方法从E.coli菌株中制备质粒DNA经用SDS裂解从E.coli中制备质粒DNA(Maniatis et al.)。在用于测序反应之前利用聚乙二醇沉淀法进一步纯化DNA。
质粒亚克隆用标准方法产生下列的pTOXI-1的亚克隆以助于DNA测序a).从pTOXI-1(如图4所示)中分离6.7kb HindⅢ/NdeⅠ片段并将其连接到已用HindⅢ/Nde Ⅰ切割的pUC-18上，从而得到pEMLV-1(图5)。经质粒分离和限制性核酸内切酶分析法来鉴定含有pEMLV-1的JM109细胞(Maniatis，et al.)。
b).pSMELV-1A(图6)含有被亚克隆到pUC-18中的pEMLV-1的1.6kb SphI/XhoI片段。
c).pSMELV-2A(图6)含有被亚克隆到pUC-18中的pEMLV-1的0.7kb BamHI/SacI片段。
d).pSMELV-3A(图6)含有被亚克隆到pUC-18中的pEMLV-1的3.5kb SacI/XhoI片段。
e).pSMELV-4A(图6)含有被亚克隆到pUC-18中的pEMLV-1的1.5kb SahI/BamHI片段。
质粒DNA的双脱氧顺序分析a).变性。在测序反应之前，必须使质粒DNA变性。该过程是用NaOH处理完成的。然后借助盐的加入和乙醇沉淀作用回收变性的DNA。优选的是将2-5μg变性的质粒DNA用于每次测序反应。参见制造商对Sequenase Version 2.0 DNA测序试剂盒(United States Biochemical Corporation)之使用方法的介绍。
b).双脱氧测序法。按照制造商提供的说明书，(U.S.Biochemical Corporation)用Sequenase 2.0进行链中止双脱氧顺序测定。用限定为5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′的“40通用引物”和限定为5′-AACAGCTATGACCATG-′的“反向引物”启动亚克隆pMELV-1A、pMELV-2A、pMELV-3A、pMELV-4A以开始DNA组群的测序反应。使用Gene Assembler Plus(Pharmacia，Piscataway，NJ)合成重叠的寡核苷酸将顺序延伸至以前的阅读顺序。用合成的寡核苷酸作为连续测序反应的引物。用质粒pMELV-1作所有其余顺序的模板。从质粒克隆的两条链阅读DNA顺序以提高精确度。
实施例3
来自粘性质粒文库的脱硫活性生物催化剂的补偿克隆;生物催化剂DNA转染到R.FASCIANS宿主生物体中材料与方法细菌菌株、培养基和试剂所用的红球菌种玫瑰色红球菌菌株IGTS8得自Institute of Gas Technology(Chicago，IL)。本文所描述的UVI是不能够使DBT脱硫的IGTS8的突变株。R.fascians D188-5(Desomer，etal.，J，Bacteriol.，170∶2401-2405，1988)和玫瑰色红球菌ATCC13808(ATCC的典型菌株)并不代谢DBT。E.Coli XL1-Blue(得自Stratagene Cloning System，La Jolla，CA)是recAl lac thiendA1 gyrA96 hsdR17 supE44 relAl[F′proAB Lac Lac△M15 Tn10]。E.coli CS109是W1485 thi supE F′。E.coli S17-1为E.coli 294的衍生物，它是recA thi pro hsdR--res+-mod+-[RP4-2-TC∶∶Mu-Km∶∶Tn7][Simon，et al.，Plasmid vector for the genetic analysis and manipulation of hizobia and other gram-negative bacteria，p640-659.In A.Weissbach，and H.Weissbach(eds)，Methods in enzymology，vol.，Academic Press，Inc.，orlando，1986]。
按照Giurard和Snell[Biochemical factors in growth，P79-111.In P.Gertardt，R.G.E.Murray，R.N.Costilow，E.W.Nester，W.A.Wood，N.R.Krieg，and G.B Phillips(eds)，Manual of method，for general bacteriolgy，American Society for Microbiology，Washington，DC，1981]所述的方法制备假单胞菌最低限度盐培养基(PMS)，它含有0.2%甘油、40mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)、2%Hutner氏矿物碱和0.1%(NH4)2SO4。用盐酸盐取代硫酸盐制备不含硫酸盐的PMS培养基。LB为1%细菌胰胨、0.5%酵母提取物和1%NaCl。所有的液体培养基保温均在水浴(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)中振荡进行。需要时可用氨苄青霉素(50μg/ml)和四环素(12.5μg/ml)作为筛选剂。联苯噻吩(DBT)购自Fluka Chemical Corporation of Ron-konkoma，NY。DBT-亚砜得自Biochemicals of Irvine，CA，而DBT-砜得自Aldrich Chemical Company of Milwaukee，WI。琼脂糖得自BRL。
质粒载体用pLAFR5(Keen，et al.，Gene.70∶191-197，1988)和pRF29(Desomer，et al.，1988)作为红球菌复制原点的来源。
粘性质粒库的构建除了细胞的裂解是在含有溶菌酶(5mg/ml)和SDS(2%)的TE(10mM 7ris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中完成外，从IGTS8中分离高分子量DNA的其余步骤均按照Consevage等人的方法(J.bACTER-IOL.，162∶138-146，1985)进行。用Sau 3AI部分消化DNA，并在通过氯化钠梯度离心(Frischauf，at al.，Digestion of DNASize fractionation，p183-189。In S.L.Berge，and A.R.Kimmel(eds.)，Methods in Enzymdogy，Vol 152，Academic Press，Inc，San Digo，CA.1987)后分离约为20kb的片段。用标准方法将这些片段连接到PLAFR5的BamHI位点上。用Gigapack plus(Stratagene)进行体外包装。将包装的粘性质粒转导到E.coliS17-1中。
DBT喷涂平板检测法用于鉴定能够修饰联苯噻吩(DBT)之细菌的喷涂平板检法最初是由Kiyohara等人(Appl.Environ.Microbiol.，43∶454-457，1982)描述并由Krawiec[Bacterial desulfurization of thiophnesscreening technique and some speculations regarding the biochemical and genetis Bases p103-114.In G.E.Pierle(eds.)，Developments in Industrial Microbiology，Vol 31，Sociely for Industrial Microbiology，Columbus，Ohio，1990)改良的。为适用于玫瑰色红球菌IGTS8对该检测法作了如下的进一步改良。将来自个别IGTS8菌落的细胞作为小斑块(0.5cm)转移到LB平板上，并在30℃下保温24-36小时。将这些细胞斑块中的大量细胞转移到缺乏硫源的PMS-1%琼脂糖平皿上。立即用溶于乙醚中的0.1%DBT溶液喷涂上述平皿。将PMS-DBT平皿在30℃下保温最少18小时，并借助短波(254nm)紫外线照射检测细胞斑块周围的荧光产物。
硫生物可利用性检测法将IGTS8在PMS培养基中于30℃培养24-48小时，离心沉淀出细胞团块，然后用无硫PMS洗两次。将洗过的细胞接种到含有浓度为0.2%的DBT或DBT-亚砜或DBT-砜、并以其作为唯一硫源的PMS中。调整接种物，以使600nm处的起始吸光率(A600)为0.02。培养物在30℃保温，并于A600处监测其生长。对于与DBT一起保温的培养物，于不同的时间间隔在短波紫外线灯下观察上清液，以检查荧光产物的产生。
质粒分离和杂交按Ish-Horowicz和Burke(Nucl.Acids Res.，9∶2989-2998，1981)所述方法从E.coli中分离粘性质粒DNA(pLAFR5)，根据Singer和Finnerty所述(J.Bacteriol.，170∶638-645，1988)方法从红球菌种中分离粘性质粒DNA(pLAFR5)。按照Birnboim和Doly(Nucl.Acids Res.，7∶1413-1423，1979)的方法进行粘性质粒的大规模制备。按Southern(J.Molec.Biol.，98∶503-517，1975)所述进行DNA杂交实验。采用Feinberg和Vogelstein的随机引物法(Anal.Biochem.，137∶266-267，1984)用32P＝dCTP(Amersham)标记DNA。
IGTS8的紫外线诱变将IGTS8在LB中30℃培养过夜并将约3000个菌落形成单位散布于另外的LB平皿上。这些平皿在距短波紫外灯(254nm)3.5cm处暴露5-20秒。将平皿在30℃下培养48小时或者直到菌落出现。用喷涂平板法检测表现为大于50%的细胞死亡的平皿上的菌落代谢DBT或使DBT脱硫的能力。
红球菌的电转化通过电穿孔(Gene Dulser，Biorad Laboratories，Inc，Hercules，CA)用质粒DNA转化玫瑰色红球菌IGTS8和UV1突变株。使细菌在LB中于30℃下生长24-48小时，并用新鲜LB稀释至A600＝0.15，再在30℃培养4小时。离心收集细胞，并用0.3M蔗糖洗4-5次，最后重新悬浮于0.5M蔗糖中使其浓度约为5×109个细胞/ml。向冰冷的0.2cm电穿孔小池(Biorad)中加入40μl此细菌溶液。用800Ω的脉冲控制器以25μF和2.5KV对细胞进行脉冲处理，并立即用1ml含有0.5M蔗糖的LB稀释。将细胞于30℃保温1小时，铺敷于加有适当抗菌素的LB琼脂平血上，于30℃培养直至菌落出现。当质粒携带有pRF29红球菌质粒复制原点时，即可在48小时后看到菌落。若没有pRF29复制原点，则在4-5天后才出现菌落。
以类似方式经电穿孔转化R.fascians D188-5，但由于该菌生长速度较慢，所以要在LB中保温过夜直至A600≈2.0。洗细胞，并重悬于代替蔗糖的蒸馏水中。脉冲控制器设定为400欧姆，电穿孔后的回收是在铺敷于选择培养基上之前4小时在LB中完成的。用E.COLI质粒成功地转化R.fascians D188-5要求必须事先在体外用CpG甲基化酶SssI(New England Bevlabs，Inc.，Beverly，MA)使DNA甲基化。
气相色谱和质谱细胞在LB培养基中于30℃培养过夜并用100μl菌液接种50ml PMS最低限度培养基。培养物在30℃保温4天后用无硫的PMS洗2次，并将离心沉淀的细胞接种到50ml含有0.1%DBT作唯一硫源的PMS中。将这些细胞在30℃保温24小时，于-20℃冻存上清液。为了完成包括R.fascians D188-5的检测，将培养时间增加2-3倍。
按OLson等人(Energy ＆ Fuels，submitted，1993)所述方法进行样品制备和分析。简言之，使各样品上清液(约50ml)解冻，并离心除去残余的不溶物。用HCl将澄清的上清液酸化至pH1.0，然后用50ml乙酸乙酯提取3次。得自离心步骤的不溶物也用乙酸乙酯提取3次。合并乙酸乙酯提取物，经无水氯化钙干燥，过滤，并经旋转蒸发除去乙酸乙酯。已知量的内部标准品(溶于氯仿溶液中的十八烷)加入到样品中，然后用GC/FID(气相色谱/火焰电离检测法)和GC/FTIR/MS(气相色谱/傅里叶变换红外线法/质谱法)分析之。在一些样品中，用重氮甲烷的醚溶液处理使乙酸乙酯提取物或抽提后之水层中的酸性成分甲基化。
按以前所述(Diehl，et al.，Speetros.Int。J.，843-72，1990;Olson and Diehl，Anal.Chem.，59∶443-448，1987)方法在系列联系的GC/FTI/MS系统上进行分析。该系统包括用AGC操作的Finnegan离子捕获装置(ITD800)和Nicolet 20sxb Fourier转变红外仪。使用30mx0.32mm DBS柱(1.0μm相厚度)以在330℃下测得的2.0ml/分钟氦载体流速进行气相色谱分析。因为亚砜和砜对热不稳定，而且它们可在分流或无冲分流中分解。(Vignie，et al.，J.High Resol.Chromatogr.＆chromatogr.commun.，6∶661-665，1983)，故利用柱上注射法导入样品。烘箱温度控制程序如下40℃注射，然后以20℃-80℃/分钟、5-200℃/分钟和10-330℃/分钟的速度升高温度，并保持5分钟。使用HP5880A以相似层析柱、流速控制程序和烘箱温度进行GC/FID分析。
结果玫瑰色红球菌IGTS8之Dsz-突变株的分离当将来自外源菌属的基因克隆到E.coli中时，并非所有的基因都得以表达，而且也不是所有的蛋白质产物都有活性。为了保证已克隆的脱硫基因将在宿主中表达，分离不再能使DBT脱硫的玫瑰色红球菌IGTS8的突变株。利用该突变株作为克隆受体将保证细胞环境适合于基因表达并使蛋白质具有功能活性，因而能够借助补偿作用筛选已克隆的脱硫基因。
将玫瑰色红球菌IGTS8暴露于紫外光下对其进行诱变，并筛选出1000个能够在DBT喷涂平板检测中产生UV荧光产物的存活菌。鉴定出3个可能的脱硫阴性实变株，然后用硫生物可利用性检测法重新评估之。两个分别命名为UV1和UV23的突变株不能利用DBT或DBT-砜作为唯一的硫源，并因此表现为Dsz-。用GC/MS分析法测知，当在DBT存在下生长时，UV1实变株不能将DBT代谢为2-HBP或任何其它可能的中间化合物。因而，UV1菌株被认为是Dsz-，并被用作进行补偿作用研究的宿主，以鉴定携带脱硫基因的克隆。
脱硫基因的粘性质粒克隆用得自Dsz+源生物体IGTS8的DNA在粘性质粒pLAFR5中构建文库。将该文库转导到E.coli S17-1中，并从约25，000个菌落中分离质粒。将这些粘性质粒经电穿孔导入玫瑰色红球菌UV1(IGTS8的一种Dsz-突变株)中，其转化效率为约300个转化体/μgDNA。合并不同数目的UV1转化体，于3℃下保温18小时，然后将细胞洗两次并重新悬浮于无硫PMS中。将大约7×108个收集的细胞接种到100ml以DBT作为唯一硫源的PMS中。推测DBT脱硫反应的产物是2-HBP，它在暴露于UV光下时发出荧光。因此，使成批培养物于30℃下生长，并观察上清液中的荧光。在不同的四批中筛选出约3300个UV1转化体。其中一批中(代表大约600个转化体)在培养5天后上清液中出现UV荧光产物。分离个别菌落并在与DBT接触时其中的12个菌落继续产生荧光产物。
从所说的分离物中回收粘性质粒的尝试没有成功，所以进行Southern杂交以确定是否粘性质粒已整合到UV1菌株染色体中。从七个转化体中分离染色体DNA并用EcoRI消化之。经琼脂糖电泳和吸印后，所得片段与来自pLAFR5的32P标记探针杂交。在所有被检测的转化体中，pLAFR5探针与大小约为20Kb的DNA片段杂交。载体衍生的探针不与对照组IGTS8的基因组杂交。因此，脱硫作用阳性的粘性质粒克隆已显然被整合到UV1菌株染色体中。
因为质粒已整合到染色体中，连接到质粒克隆位点之任一侧的基因组DNA必须代表能够补偿UV1菌株中Dsz-突变的玫瑰色红球菌IGTS8顺序(无论整合的方式是同源重组还是不符合惯例的重组，上述情况都将是事实)。用EcoRI或BamHI消化基因组制备物以从三个脱硫作用阳性转化体中回收位于被插入质粒侧翼的顺序。这些酶在多接头区切割pLAFR5一次，从而可回收到连接至来自IGTS8之相邻染色体片段上的完整pLAFR5顺序。使消化的DNA自身连接(浓度为约20ng/μl)并转化到E.coli S17-1中。获得十六个四环素抗性菌落，其中七个是用BamHI消化得到的，九个是用EcoRI消化得到的。限制性酶切分析揭示，所有由EcoRI营救的克隆均含有IGTS8 DNA的2.1kb片段。由BamHI营救的克隆则含有得自IGTS8的1.65kb片段。
用得自EcoRI解救实验的2.1Kb IGDS8 DNA作为模板以制备标记的DNA探针，该探针可与从中获得E.coli中之原始的完整粘性质粒文库的菌落杂交。在5000个菌落中，有17个与IGTS8探针杂交。从每个克隆中分离粘性质粒，并转化到UV1菌株中。17个DWA制备物中的3个能弥补Dsz-表型。
用EcoRⅠ和HindⅢ构建该区域的限制性酶切图。来自2.1kb IGTS8 DNA的探针与4.5kb EcoRI片段杂交。所有能赋予Dsz+表型的粘性质粒克隆都含有完整的4.5kb EcoRⅠ片段、部分4.5kb EcoRⅠ-HindⅢ片段和18kb EcoRⅠ片段。这些结果表明脱硫基因位于15kb区域内。
脱硫基因的亚克隆将4.5kb EcoRⅠ片段和4.5kb EcoRⅠ-HindⅢ片段亚克隆到pLAFR5中，但两者均不能补充UV1菌株的Dsz-突变。将来自GE1-H的9.0kb EcoRⅠ片段、来自GE1-C的15.0kb EcoRⅠ-HindⅢ片段和来自GE1-K的18kb片段亚克隆到pLAFR5中，分别产生质粒pSAD60-28、pSAD48-12和pSAD56-6。当这三种质粒转化到UV1菌株中时，三者在喷涂平板检测中均产生来自DBT的荧光产物，这一结果与根据限制性酶切图确定的Dsz+表型的定位相一致。得自该区域的其它亚克隆的构建将有关基因的定位局限在6.5kb BstBI片段内。
UV1菌株突变的性质EcoRⅠ消化的IGTS8和UV1 DNA的基因组印迹与由IGTS8的2.1kb EcoRⅠ片段产生的探针杂交。没有检测到与UV1 DNA的杂交，这表UV1的突变是大的缺失突变，而并非简单的点突变。
红球菌质粒复制原点增加UV1的转化率利用pSAD48-12对UV1菌株进行电穿孔一般只产生低的转化率(约S50/μg DNA)，并且只有约50%的转化体表现有Dsz+表型(推测可能因为在与染色体重组过程中DNA丢失或发生重排)。为了提高转化率，将来自pRF29的4.5kb Hind Ⅲ片段克隆到pSAD48-12的HindⅢ位点中以产生质粒pSAD74-12。该4.5kb片段含有红球质粒的复制原点，从而可使pSAD74-12作为质粒得以在UV1菌株中复制。该克隆转化之UV1的转化率大于104个转化体/μgDNA。其中100%的转化体表现出Dsz+表型。不幸的是，由UV1直接制备的质粒产量太少，以致于来自微量制备物中的DNA不能在琼脂糖凝胶上被观察到。然而，可用从UV1中分离的质粒转化E.coli S17-1，并可由该转化体大量制备质粒。
Dsz+表型在E.coli S17-1中不被表达用pSAD48-12转化E.coli S17-1，并用喷涂平板检测法来检测脱硫活性。结果未鉴定出阳性菌落。这可能是因为E.coli聚合酶不能识别pSAD48-12中的IGTS8启动子，所以将IGTS8 DNA置于E.coli Lac启动子的控制下。将得自pSAD48-12的15kb EcoRⅠ-HindⅢ IGTS8片段亚克隆到pBluescript载体sk和ks中，以使IGTS8片段在上相对于Lac启动子的两个方向上进行克隆。各克隆都未在E.coli XL1-Blue中表达Dsz+表型。还不清楚这种情况是由于该克隆之基因没有很好的转录或转译，还是因是在E.coli S17-1中过量产生的蛋白质没有活性所致。
Dsz+基因在R.fascians中表达因为已克隆的基因不能在E.coli中被表达或者在E.coli中产生了无活性的蛋白质，所以开始尝试在其他红球菌种中表达目的基因。R.fascians D188-5在DBT喷涂平板检测中或在硫的生物可利用性检测中未显示有脱硫作用。用脱硫作用阳性质粒pSAD74-12转化R.fascians的初期尝试未能成功。已知其他红球菌种具有在SaLI样限制性位点处裂解DNA的内源性限制系统。因为pSAD74-12含有多个SaLI识别顺序，所以使用CPG甲基化酶(SssI)对pSAD74-12进行体外甲基化处理。用甲基化的pSAD74-12 DNA进行转化后，所获得的R.fascians D188-5转化体的转化率约为7×103个转化体/μg DNA，这些转化体在喷涂平板检测中表现为Dsz+表型，而且对液体培养基上清液的GC分析表明形成了来自DBT的2-HBP。
尽管应用了未甲基化的或CPG-甲基化的质粒，但将pSAD74-12转化到第二个菌种，即玫瑰色红球菌ATCC 13808中的努力仍是无效的，这可能是因为尽管试验了很大范围内的电穿孔条件，但用于ATCC13808的电穿孔条件仍不完全适宜。更可能是因为ATCC 13808具有一个不能被CPG甲基化作用抑制的限制性系统。
2-HBP是主要的脱硫产物由玫瑰色红球菌IGTS8从DBT产生的主要代谢产物是2-HBP用GC/MS分析法(Qlson，et al.，Energy ＆ Fuels in Press，1993)还鉴定出少量的2′-羟联苯-2-亚磺酸(DBT-Sultine)和2′-羟联苯-2-磺酸(DBT-磺内酯)。IGTS8也以同样的途径产生这些产物(表2)。R.fascians D188-5或玫瑰色红球菌Dsz-突变株UV1都不能从DBT产生这些产物。然而，当用质粒pSAD74-12转化R.fascians D188-5和用质粒pSAD104-10转化玫瑰色红球菌UV1突变株时，这些细菌从DBT产生的产物与那些已鉴定的玫瑰色红球菌IGTS8的产物完全相同(表2)。尤其是，大量产生2-HBP表明对DBT的碳一硫键特异性脱硫作用是由来自IGTS8的克隆基因的产物介导的。
亚克隆pSAD90-11携带一个据推测与克隆到pSAD104-10中的片段完全相同的DNA片段，但这两个质粒的区别在于它们被导入玫瑰色红球菌UV1中后产生了不同的结果。在平板检测中，DBT的<p>表1铁氧体和B106催化剂的组成分析
a.代谢产物是DBT，二苯噻吩;DBTO，二苯噻吩5-氧化物(亚砜);DBTO2，二苯噻吩5.5-二氧化物(砜);DBT-磺内酯，2′-羟基联苯-2-磺酸(作为二苯[c，e][1，2]-氧硫杂环已二烯6，6-二氧化物检测的);DBT-Sultine，2′-羟基联苯-2-亚磺酸(作为二苯[c，e][1，2]-氧硫杂环已二烯6-氧化物检测的);二苯噻吩砜;2-HBP，2-羟基联苯(Krawiee，pg.103-104，In G.E.Dierce(ed)，Devel-opments in Industrial Microbiology，vol 31，Society for Ind-ustrial Microbiology，Columbus，Ohio，1990)。
b.来自亚克隆pLAFR5中的IGTS8的9.0kb EcoRI DNA片段加上来自pRF29的复制原点。
c.来自亚克隆pLAFR5中的IGTS8的突变的9.0kb EcoRI DNA片段加上来自pRF29的复制原点。
d.来自亚克隆pLAFR5中的IGTS8的15.0kb EcoRI-HindⅢDNA片段加上来自pRF29的复制原点。
e.所存在的代谢物以从很大量(+++++)到很小量(即痕量)的相对量进行报告。
IGTS8不能利用DBT-亚砜作为硫源玫瑰色红球菌IGTS8与作为唯一硫源的下列物质之一在最低限度培养基中一起培养DBT、DBT-亚砜或DBT-磺内酯。IGTS8不能利用由DBT-亚砜提供的硫，但在DBT或DBT-磺内酯存在时生长良好。当细胞在营养丰富的培养基(LB)中生产时，DBT-亚砜对细胞无毒性。因而，IGTS8既不能运输也不能作用于DBT-亚砜，或者说DBT-亚砜不是脱硫途径中的真正中间产物。
实施例4利用Sanger法对含有来自IGTS8的脱硫生物催化剂基因的9763核苷酸EcoRI-SAU3AI片段进行DNA顺序测定从IGTS8源生物体中分离含有负责Dsz+表型之基因的9763核苷酸EcoRI-Sau3AI片段。利用Sanger等人的双脱氧链中止法[Sanger et al.，1977，DNA Sequencing with Chain-termination inhibitors.74 PROC NATL ACAD.SCI.USA 5463-5467]用修饰的T7DNA聚合酶(USB)和[α-35S]-dCTP(Amersham)从DNA的两条链测定该片段的DNA顺序。利用核酸外切酶Ⅲ和Henikoff的方法[Henikoff，1984，Unidirectional digestion with exonu-clease Ⅲ Creates targeted breakpoints for DNA sequencing，28，GENE 351-359]在pBluescript中构建用于DNA测序的缺失克隆。
将得自141个个别缺失克隆的顺序用于重建完整的9763核苷酸片段。用DNA InspectorⅡ(Textco，Hanover，NH)进行计算机化顺序装配。独立地确定各DNA链的DNA顺序，但还没有对两条链的整个9763核苷酸片段进行完整的序列测定。从一条DNA链上确定的顺序覆盖了9763核苷酸顺序的95%。对另一条DNA链则确定了96%的顺序。从至少两个完整9763核苷酸片段的独立缺失克隆确定顺序。
实施例5进一步分辨pTOXI-1的序列和编码开放读码(ORF);Dsz+启动子基因工程化处理;在异源宿主生物体中表达Dsz+表型;脱硫基因表达产物的特大细胞(maxicell)分析脱硫作用基因群的组织根据对pTOXI-1测序的结果(列于下面的顺序表中)推测在克隆的一条链上有三个非常接近的开放读码(ORF)(图7)。推测每个ORF的大小为ORF1有1359个碱基(bps 786-2144)，ORF2有1095个碱基(bps 2144-3238)，ORF3有1251个碱基(bps 3252-4502)。下述亚克隆分析揭示了由DBT向2-HBP的转化需要有ORF1，2，3的存在，并且由这些ORF编码的所有基因均在作为操纵子的单个转录本上转录。下述的所有亚克隆均维持于大肠杆菌-红球菌穿梭载体pRR-6中。每个亚克隆的活性基于在含丰富营养的培养基中培养Dsz-菌株CPE-648的转化体48小时来确定。用1ml培养物接种添加了大于100μM DBT或DBT-砜的25ml BSM。48-120小时后检测培养物中的脱硫产物。各个亚克隆片段的图解显示于图8中。
在续后的研究中，使亚克隆生长在加入氯霉素的富集培养基中，然后转种(2%)到含100μM DBT或含100μM DBT-砜的BSM中。培养物在30℃下振荡2-5天并用HPLC法检测脱硫产物。
A.pENOK-1构建一个含有pTOXI-1的4.0kb SphI片段的亚克隆。该片段跨越ORF1和ORF2，但截去了ORF3。分析含pENOK-1转化体表明，当与DBT一起保温时没有产生脱硫产物。但这些转化体能够由DBT-砜产生2-HBP。
B.pENOK-2构建一个含有pTOXI-1的3.6kb SacI片段的亚克隆。该片段跨越ORF2和ORF3，但截去了ORF1。分析pENOK-2转化体后表明，没有从DBT或DBT-砜产生任脱硫产物。根据没有从ORF2或ORF1表达任何可检测的活性这一事实，提示这些ORF是作为有从单一上游启动子开始介导转录作用之操纵子排列的。由此推测，该启动子已从该亚克隆中被去除。
C.pENOK-3构建pTOXI-1的1.1kb XhoI缺失突变体。ORF1和ORF2都已被截掉，只保留了完整的ORF3。含有pENOK3的转化体显示能由DBT产生DBT-砜。未检测到可由DBT或DBT-砜产生2-HBP。还应注意的是，上述类型的缺失在核苷酸水平上没有产生极性突变。预示ORF1和ORF2的码内拼接顺序会产生可能无活性的杂合蛋白质，然而，在去掉中止密码子后，推定的单一mRNA转录本仍受核糖体的保护，从而使ORF3得以转译。ORF3产物将DBT转化为DBT-砜的能力证明DBT-砜是IGTS8的碳硫键特异性生物催化脱硫途径中的真正中间产物。
D.pENOK-11将pTOXI-1的3.4kb NcoI片段亚克隆到pRR-6的唯一NcoI位点中。该片段含有完整的ORF2和ORF3，但截去了ORF1的5′末端。pENOK-11的转化体未显示有针对DBT或DBT-砜的脱硫特异性酶促活性。这表明必须的编码区包含有该片段。这一点与预期结果一致，即完整的基因群如前述的亚克隆pENOK-2一样在单个转录本上得到表达。此外，用于基因转录的启动子不存在于该亚克隆中，亚克隆pENOK-13(见下文)也证实了上述推断。
E.pENOK-13构建具有2.6kb SphI-XhoI缺失的pTOXI-1的亚克隆。该亚克隆只含有完整的ORF3。ORF1被完全去除而且ORF2也被截掉。该亚克隆示显有针对于DBT产生DBT-砜的脱硫特异性酶促活性。这一结果与已证实可由DBT产生DBT-砜的pENOK-3的表型差不多。因为pENOK-13与pENOK-3的不同在于还缺失一个较小的SphI/XhoI片段，所以这将表明在1.6kb的SphI/XhoI片段中存在一个对于基因表达必不可少的成分。因为顺序测定结果已经揭示在该区中不含有占相当部分的ORF，所以认为启动子成分可能存在于该区域中。
F.pENOK-16将所构建的pTOXI-1亚克隆设计为从脱硫基因群中除去几乎所有的非必需顺序。该构建体含有4kb Bst BI-SnaBI片段，据此推测该片段包括了对于完全脱硫作用所必须的所有顺序，其中包括ORF1、ORF2和ORF3以及上游顺序的234个碱基。3′端的Sna BI位点位于PRF3终点之后的80bp处。含有该质粒的CPE-648能够将DBT和DBT-砜转化成2-HBP。因此，pENOK-16代表了迄今所观察到表现出完整脱硫作用表型的最小量的基因群。
G.pENOK-18该亚克隆含有pTOXI-1的NsiI-BfaI片段。NsiI位点位于推测的ORF1起点的下游23bp处。包含该亚克隆的CPE-648对DBT和DBT-砜都没有脱硫活性。该亚克隆很可能除去了启动子区并截去了第一个结构基因。
H.pENOK-Nsi为了有助于进一步阐明ORF1的起始位点，构建了一个在唯一的NsiI位点处导入了4bp缺失的亚克隆，所说的NsiI位点位于推测的ORF1起始位点下游23bp处。借助于用NsiI酶切和用T4 DNA聚合酶钝化末端来产生所说的突变。如果NsiI位点位于第一个结构基因内，那么该移码突变将在ORF1中产生一个早期中止信号。pENOK-NsiI的转化体能够由DBT产生DBT-砜。然而，未检测到2-HBP，这表明突变破坏了必需的结构基因。
在后续研究中，由于该克隆中ORF-3编码的氧化酶能得以明确表达，所以认为ORF2产物也可能被表达。据此，仅仅有ORF-2还不能进一步代谢DBT-砜。
I.pENOK-19构建含有从NotI位点到SnaBI位点之缺失的亚克隆，其中所说的NotI位点位于ORF2的较前部分中，而SnaBI位点位于ORF3之后。该亚克隆将证明只有ORF1时的活性。含有该亚克隆的CPE 648转化体表现出对DBT或DBT-砜没有酶促活性。
综合pENOK-Nsi和pENOK-19的结果提示，为了进一步代谢DBT-砜，ORF1和ORF2的产物必须同时被表达。
J.pENOK-20为了估价ORF2和ORF3不同于ORF1的功能，用聚合酶链反应(PCR)扩增跨越ORF2和ORF3的DNA。用Applied Biosystems 392 DNA/RNA合成仪合成。引物RAP-1(5′-GCGAATTCCGCACCGAGTACC-3′，碱基对2062-2082)和RAP-2(5′-ATCCATATGCGCACTACGAATCC-3′，碱基对4908-4886)。黑体字核苷酸是由模板顺序进行了改变，以建立用于亚克隆的限制性位点;因此引物RAP-1含有一个EcoRI位点，而引物RAP-2含有一个NdeI位点。借助基因扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus)用Taq聚合酶和Perkin Elmer Cetus 9600热循环仪进行基因扩增。实验参数如下模板pMELV-1质粒DNA 0.2或2.0ng引物RAP-1 0.5或0.2μMRAP-2 0.5或0.2μM循环1X＠ 96℃ 2分钟25X＠ 96℃ 30秒52℃ 30秒72℃ 2分钟基因扩增产生预定的2846bp片段。为了表达含有ORF2和ORF3的扩增片段，将其连接到来自Rhodococcus fascians的氯霉素抗性基因启动子的XbaI/EcoRI片段上(Desomer et al.，Mol-ecular Microbiology，1992，6(16)2377-2385)，产生质粒pOTTO-1。最后，鉴于用人工基因操作得到的限制性位点进行连接未能成功这一事实，所以用平端连接法来亚克隆已扩增的产物。将该融合体连接到穿梭载体pRR-6上，以产生质粒pENOK-20。pENOK-20的CPE 648转化体在DBT和25μg/ml氯霉素存在下生长以诱导启动子。所有的转化体都可将DBT转化为DBT-砜，推测此过程是通过如在亚克隆pENOK-3中所证实的ORF3的活性实现的。ORF2存在时不能进一步加工DBT-砜这一事实表明，不仅是ORF2的产物不能够用DBT-砜作为底物。这与由pENOK-Nsi获得的结果相一致，并且表明仅ORF2本身不能够利用DBT-砜作为底物。
ORF1、2和3的基因产物的指定基于前文所述的亚克隆分析，已尝试地性给存在于pTOXI-1顺序中的各ORF指定了功能。ORF3可被确定为负责能将DBT转化为DBT-砜的氧化酶。亚克隆pENOK-3已很清楚地证实了这一活性。ORF1和ORF2似乎可负责DBT-砜向2-HBP的转化。该芳基硫酸酯酶活性已在亚克隆pENOK-1中得到证明。然而，亚克隆pENOK-19和pENOK-20表明单独的ORF1和ORF2均不能够转化任何中间产物DBT-砜。这说明ORF1和ORF2的蛋白质产物是一起发挥作用以裂解碳-硫键的。推测上述作用是通过蛋白质的异二聚体排列或一种蛋白质对另一种蛋白质的调节功能而实现的。实施例3中反映的平行研究结果表明，ORF-1编码一种将DBT-砜转化为DBT-磺内酯的酶。长时间地培养含有pENOK-19(完整的天然启动子和ORF-1)的CPE-648后显示，既未消耗DBT-砜也无任何新产物的生成。这一结果与实施例3所示的结果相反。
可代用的启加子筛选法提高脱硫作用的特异活性是本文所述研究工作的重要目的。达到该目的的手段之一是用一个能够产生更高和实质性表达脱硫作用基因群的启动子替代原始启动子。因为几乎没有报道和鉴定过红球菌启动子，所以已制备了随机基因组文库并根据在两个体系中的活性来筛选启动子。在一个体系中，报导基因是用于上述质粒构建中的氯霉素抗性基因;在另一个体系中，将脱硫基因本身用作报导基因。
启动子筛选实施例A氯霉素抗性报导基因正如下文所述，部分消化的红球菌在基因组DNA已被克隆到无启动子氯霉素抗性基因的下游。然后将所得的文库转化到经过氯霉素选择的红球菌中。用pRHODOPRO-2恢复了四个明显的启动子成分，尽管可能因为载体的不稳定性而只能从其中之一分离出质粒来。已对稳定的质粒RP2-2A进行了序列分析。已观察到用限制性酶处理用于这些载体中之NarI克隆位点时所遇到的一些技术问题。不幸的是，NarI酶显示有严格的位点选择性，而且似乎不能很好地消化载体。为了解决这个问题而构建了一些新的载体，虽然因缺乏方便和唯一的限制性位点而减慢了这些研究工作的进程。最近对红球菌复制原点的观察将有助于构建更为有效的启动子探针(如下所述)。
最近，从pRR-6中去掉了1.4kb BglⅠ片段，然后将其末端修成平头并重新连接产生不含BglⅡ位点的pRR-12(图9)。据Desomer等人(Mo/ecular Microbiology，1992，6(16)2377-2385)报道，该区域是质粒复制所必需的。因此，令人惊奇的是该构建体能够产生CmR转化体，这表明该区域不是质粒在本研究中所使用之生物体中复制所必需的。这一观察结果形成了构建一个将利用合成的BglⅡ位点来克隆含随机基因组片段之载体的认识基础。BglⅡ可接受用Sau3A消化的DNA，Sau3A是IGTS8 DNA的有效和常用的切割酶。期望这些构建体能产生更好、更有代表性的随机基因组文库。
启动子筛选实施例B脱硫基因群报导基因已使用载体pKAMI作为第二种直接的“散弹”，用以发现合适的可代用的启动子(图10)。将Ndel位点插入到无启动子Dsz基因群的上游，用作插入经Ndel和适合的4bp切割酶MseI及BfaI分隔的随机基因组DNA(来自菌株GPE-362，GEP-648和IGTS8)的插入位点。起初是将该连接混合物直接转化到GPE-362细胞中，然后用转化细胞接种250ml BSM+DBT。由于这些转化细胞具有利用DBT作为唯一硫源的能力，故带着扩增优良Dsz+菌株的目的进行了上述工作。迄今，已经进行了14次这类转化。其中，除其中两个之外其余的都产生了Dsz+培养物。已分离和鉴定了11个单个克隆。它们能够以低水平(0.6-1.0mg/L 2-HBP/OD600/hr)在结构上表达脱硫特性。对从这11个克隆中分离的质粒进行限制性分析表明，所有的质粒除一个(KB4-3)以外都是pKAMI骨架的简单重排，产生带有启动子的载体的“无偿”表达。许多重新恢复的质粒尽管来源于不同的连接，但都显出完全相同的限制性图型，这表明了遗传载体的不稳定性。随着这类筛选的进行，似乎利用载体启动子顺序的pKAMI的重排可得以强有力的选择。
因此上述选择方法已给出了一种筛选启动子的途径，得以将质粒的重排减至最小程度。在该过程中，首先在E.coli中扩增pKAMI/基因组文库，然后将单个的JM109菌落收集在一起。提取质粒，并用于转化Dsz-菌株GPE-362。替代使用enmass富集，将GPE362转化体铺敷于用来筛选含有质粒之细胞的含氯霉素的营养培养基上。所得菌落经平板复制法影印到BSM琼脂糖+DBT平皿上，然后根据UV荧光的产生来检查脱硫活性。以该方式筛选了7000多个GPE-362转化体。从中分离出在BSM+DBT平皿上产生UV荧光的36个菌落。目前的工作集中在对由这36个转化体携带的工程质粒进行鉴定和特征描述方面。
可代用的启动子基因工程处理方法pTOXI-1的三个ORF的紧密物理排列不能为ORF2或ORF3的启动子提供足够的空间。该事实连同亚克隆分析(参见pENOK-2、pENOK-11和pENOK-13，其中完整的ORF2和3没有提供活性)结果提示该基因群是作为三个基因只有一个表达启动子之操纵子而组织的。已知IGTS8的脱硫特性受到硫酸盐的抑制(Kilbane and Bielaga，Final Report D.O.E.Contract No.DE-AC22-88PC8891，1991)，这可能是操纵子启动子受到硫水平的严格调控。随着对脱硫基因群分子排列的阐明，可以对另外的启动子进行合理的操作除去硫的抑制作用，以增强脱硫基因的表达，并因而增强Dsz+特性的特异活性。
可代用之潜在启动子的例子包括其它已知和已描述的启动子，例如来自Rhodococcms fascians的氯霉素抗性基因启动子(Desomer et al.，Mo/ecular Microbiology，1992，6(16)∶2377-2385)，来自玫瑰色红球菌的腈水解酶基因启动子(Kobayashi et al.，Biochimi ca et Biophysica Acta，1129(1991)23-33)或利用“散弹”启动子探查法从红球菌种中分离出的其它强启动子。可选用的其他有效启动子包括那些来自革兰氏阳性生物体，如棒状杆菌、芽胞杆菌、链霉菌等的启动子。
启动子基因工程操作实施例A从来自R.fascians之氯霉素抗性基因启动子开始的表达。
pSBG-2(图11)。从pTOXI-1中作为4.0kb DraI/SnaBI片段分离出无启动子脱硫基因群，并连接到pRR-6的唯一钝化的AflⅡ位点上。将该连接混合物插入到基因群氯霉素抗性基因启动子的下游和抗性结构基因的上游。因此，信使RNA(mRNA)的转录将通过Dsz基因群继续进行到抗性基因处。然而，原来在氯霉素上进行的转化体筛选方法没产生转化体，这表明不能很好地转录直读。包含质粒的Dsz+转化体首先是通过硫生物可利用性试验，继之又在氯霉素平皿上进行筛选的。与IGTS8不同，pSBG-2转化体能够在添加了20mMNa2SO4的BSM培养基中将DBT转化为2-HBP，这表明已通过启动子的替换去除了硫酸盐的抑制作用。在添加了25μg/ml氯霉素的营养培养基(RM)中培养16小时测得转化体的比活性为0.9-1.7mg 2-HBP/L/OD600小时。
pSBG-3。通过从pSGB-2中去掉4.0kb XbaI片段来除去红球菌的复制原点。没有了原点，转化只可以通过整合作用获得。在RM+氯霉素平皿上筛选携带该质粒的CPE-648转化体，并影印铺敷到BSM+DBT平皿上。于30℃保温18小时后，根据荧光检测结果获得产生2-HBP的菌落。
各个ORF的单独表达最近，已开始着手研究三个ORF的分别表达，每个ORF均用可替代的启动子进行工程化操作。这些研究期望阐明下列问题首先，将鉴别并克服在脱硫过程中存在的任何潜在的限速步骤。操纵子表达的潜在极性效果，即下游ORF2和ORF3的表达能力较差，可能导致这种限速作用。而且，已提出了有关ORF1和ORF2的各自功能尚未解决的问题，这些研究期望证实通过分别表达ORF1和ORF2来重建将DBT-砜转化为2-HBP的能力。
借助PCR扩增和继后的亚克隆来分离所有的ORF。已在ORF的上游工程化操作了一段典型的SD顺序和一个用于可代用之启动子的唯一克隆位点。所有读码内的中止密码子已工程化连接到每个ORF的下游以阻止通读。另外，已将用于松动启动子/ORF融合体的方便的侧翼限制性位点加至每个引物上。用于扩增每个ORF的引物列示如下。码内的中止密码子用星号(＊)标示。与pTOXI-1模板DNA相同的顺序用粗体显示。
ORF1上游:
XbaI5'-GGAATTCTAGACATATGAGGAACAGACCATGACTCAACAACGACAAATGC-3'EcoRI NdeI 起始ORF1下游:
Stop XbaI3'-GTACTGTTCGGCGCAGCTGGGGACTAAGATCTTAAGC-5'Stop* 终止 EcoRIORF2上游:
BqlII5'-GGAATTCAGATCTCATATGAGGAAACAGACCATGACAAGCCGCGTCGACC-3'EcoRI NdeI 起始
ORF2下游:
StopBqlII3'-CGGAGTTAGCGGTGGCTATCCTTAATCTAGACTTAAGC-5'终止*终止 BqlIIORF3上游:
MseI5'-GGAATTCTTAACATATGAGGAAACAGACCATGACACTGTCACCTGA-3'EcoRI NdeI 起始七ORF3下游:
MseI3'-GACTCCTAGACTCCGCGACTAATTCTTAAGC-5'终止*终止终止 EcoRI循环参数为1×96℃ 2.0分钟25×96℃ 30秒钟50℃ 30秒钟72℃ 1.0分钟已成功地扩增了每个ORF，并作为EcoRI片段亚克隆到pUC-19的NdiI位点中。可选用的启动子将连接至唯一的NdeI位点上，再将融合体连接到红球菌-大肠杆菌穿梭载体pRR-6上，用于在红球菌中表达。
Dsz+特性的异源表达为了确定质粒pTOXI-1是否含有表达Dsz+特性所必需的全部遗传物质，尝试着在一种不能代谢DBT的相关生物体(Dsz-)如Rhodococcus fascians中和也是Dsz-的非相关生物体如大肠杆菌中对pTOXI-1进行异源表达。
A.用pTOXI-1转化Dsz-菌株Rhodococcus fascians(ATCC12974)。单个转化体在BSM+DBT平皿上显示出UV荧光。当提供DBT作底物时，利用HPLC作进一步分析清楚地表明了2-HBP的产生。因此，pTOXI-1包含了使异源Dsz-菌株转化为Dsz+表型的足够信息。
B.也用pTOXI-1转化E.coli JM 109菌株，并与每种底物DBT和DBT-砜在最低限度培养基(BSM)或者富营养培养基(LB)中一起保温。用HPLC分析观察到所有情况均未产生2-HBP。E.coli不能表达脱硫基因并不是没预料到的，因为革兰氏阳性基因在没有进行启动子替代时在E.coli中并不是普遍可表达的。
为了替换脱硫基因群的启动子，从pTOXO-1中分离出一个4.0kb DraI/SnaBI片段。该片段包含全部的必需结构基因但缺乏启动子顺序。将该无启动子脱硫基因群连接到约BamHI酶切的E.coli表达载体pDR540(Pharmacia，Piscatanay，NT)上，并用Klenow填平末端。该构建过程使tac启动子与脱硫基因群融合。所说的tac启动子位于乳糖阻遇物的调控之下，并在LacIq宿主，如JM109中受到抑制。通过加入异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导从tac启动子开始的表达。使含有pDRDsz的JM109转化体在LB中于30℃生长，当与DBT一起培养并用IPTG诱导后显现出Dsz+表型。所观察到的pDBDsz比活性高达1.69mg 2-HBP/L/OD600/小时。当转化体在37℃下生长时，比活性大大降低。最高的比活性水平见于培养1小时后。
上述在相关和非相关异源宿主中表达Dsz+特性表明pTOXI-1携带将DBT转化为2-HBP所需的全部遗传信息。
在大肠杆菌中的成功表达提供了一个可对由脱硫基因群编码的蛋白质进行鉴定和特征描述的可行性体系。从Dsz+JM109细胞(pDRDsz)中分离蛋白质，并在变性丙烯酰胺凝胶上进行检查。经考马斯染色未检出新的带。也用考马斯兰染色凝胶分析了细胞蛋白质的胞质外、胞质及膜蛋白质组分。同样末检测到新的带。不经任何钝化，新表达的蛋白质显然含量水平太低而不易于检测并从本底中分辨出来。包含pDRDsz之E.COLI的特大细胞分析由质粒DNA上的基因编码的蛋白质可以在UV照射的大肠杆菌细胞中得以特异性放射标记(Sancar，et al.，Journal of Bacterio-logy.1979，p 692-693)。这项技术称作特大细胞分析法。简言之，使携带质粒的E.coli例如JM109的recA菌株在M9CA培养基(Maniatis et al.)中生长至细胞密度为2×108细胞/ml。然后将持续搅拌下的细胞暴露于距Mineralight Lamp Model UVG-254(Ultro-vilet Products，Inc，San Gabriel，CA)10cm处以0.5焦尔·米-2·秒-1的能量密度接受UV照射。暴露时间分别为60秒、90秒或120秒。然后将细胞在37℃保温16小时。在用M9缓冲液洗培养物之后悬浮于不含硫酸盐的最低限度培养基中。于37℃下饥饿1小时后，加入[35S]甲硫氨酸(＞1000Ci/mmol)(NEN Research Products，Boston，MA)，使其终浓度达到5μCi/ml，并继续保温1小时。经离心收集细胞并通过煮沸细胞法(Mariatis，et al.)分离蛋白质。在丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质。走完电泳后，干燥凝胶并且放射自显影3天。
包含载体pDRS40的JM109特大细胞仅表现有载体标记物半乳糖激酶蛋白质。对包含载体pDRDsz之JM109特大细胞分析显示有三个新的蛋白带存在，根据开放读码分析结果可知其大小与三个负贯Dsz+特性的蛋白质之推测的分子量有很好的相关性(见表3)。
表3
因此，由特大细胞分析所得的数据表明pTOXI-1的三个推测的开放读码编码构成脱硫作用表型的三个结构基因。
三条新带的相对强度反映了甲硫氨酸残基数目和每种蛋白质的翻译水平。很显然，只含1个甲硫氨酸的ORF-2产生最弱的带。除了仅掺入单个甲硫氨酸残基外，大肠杆菌还可以加工单个的未端甲硫氨酸，而进一步降低标记之蛋白质的量。因此，低强度的ORF-2带很可能不能严格地提示低的蛋白质翻译水平。
令人感兴趣的是，最远离启动子的ORF(即ORF-3)似乎以与ORF1差不多的水平存在，这说明当该操纵子在E.coli中表达时其中不存在极性效应。期望将从含有质粒pTOXI-1的红球菌种的类似特大细胞分析中获得有关蛋白质水平的更重要信息。此外，如上文所假定的，在非变性条件下可观察到ORF-1/ORF-2异聚体的存在。
本领域的技术人员将能够认识到他们可利用常规实验技术对本文所述的具体实施方案进行许多等同的改动。这些方案以及所有其它的这类等同方案将包括于下述权利要求中。
顺序排列1至553
权利要求
1.含有编码生物催化剂基因的重组DNA分子，所说的生物催化剂能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫。
2.如权利要求1的重组DNA分子，其中所说的矿物燃料是石油。
3.含有玫瑰色红球菌细菌菌株之基因的重组DNA分子，其中所说的基因编码能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
4.如权利要求3的重组DNA分子，其中的基因来自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
5.如权利要求3的重组DNA分子，其中所说的矿物燃料是石油。
6.来自玫瑰色红球菌菌株的纯化DNA，其中所说的DNA编码能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
7.如权利要求6的纯化DNA，其中所说的DNA来自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
8.来自玫瑰色红球菌菌株的纯化DNA，其中所说的DNA编码能够使含有有机硫分子的石油脱硫的生物催化剂。
9.如权利要求8的纯化DNA，其中所说的DNA来自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
10.含有包括编码生物催化剂基因之DNA分子的重组DNA载体，其中的生物催化剂能够使含有机硫分子的矿物燃料脱硫。
11.含有包括玫瑰色红球菌菌株基因之DNA分子的重组DNA载体，其中所说的基因编码能够使含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
12.如权利要求11的重组DNA载体，其中的基因来自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
13.含有来自微生物的DNA的DNA质粒载体，其中所说的DNA编码一种能够使含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
14.含有来自玫瑰色红球菌菌株之DNA的DNA质粒载体，其中所说的DNA编码一种能够使含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
15.如权利要求14的DNA质粒载体，其中所说的DNA来自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
16.含有包含微生物基因之重组DNA分子的DNA质粒，其中所说的基因编码能够使含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
17.含有包含玫瑰色红球菌菌株基因之重组DNA分子的DNA质粒，其中所说的基因编码能够使含有机硫的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
18.如权利要求17的DNA质粒，其中所说的基因来自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
19.含有衍生于玫瑰色红球菌菌株之分离DNA的DNA质粒，其中所说的DNA编码能够使含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
20.如权利要求19的DNA质粒，其中分离的DNA得自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
21.质粒pTOXI-1。
22.质粒pTOXI-2。
23.含有重组DNA质粒的微生物，其中所说的质粒含有表达能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫之生物催化剂的基因。
24.含有包含玫瑰色红球菌菌株基因之重组DNA质粒的微生物，其中所说的微生物表达能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
25.如权利要求24的微生物，其中的基因得自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
26.含有得自玫瑰色红球菌菌株之DNA的微生物，其中所说的被转化的微生物表达能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
27.如权利要求26的微生物，其中DNA质粒得自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
28.含有质粒pTOXI-1的补偿宿主生物体CPE-648。
29.含有质粒pTOXI-2的补偿宿主生物体CPE-648。
30.通过使用含有重组DNA质粒的生物体使含有有机硫分子之矿物燃料脱硫的方法，其中所说的质粒含有表达能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫之生物催化剂的基因，该方法包下列步骤a)使矿物燃料与微生物接触;和b)在足以引起有机碳-硫键酶促裂解的条件下保温矿物燃料与微生物的混合物，从而使矿物燃料中的有机硫含量显著降低。
31.通过使用含有包括来自玫瑰色红球菌菌株基因之重组DNA质粒的微生物，使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的方法，其中所说的微生物表达能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂，该方法包括下列步骤a)使矿物燃料与微生物接触;和b)在足以引起有机碳-硫键酶促裂解的条件下保温矿物燃料与微生物的混合物，从而使矿物燃料中的有机硫含量显著降低。
32.如权利要求31的被转化的微生物，其中基因衍生于玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
33.通过使用含有包括来自玫瑰色红球菌菌株DNA之DNA质粒的微生物，使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的方法，其中所说的微生物表达能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂，该方法包括下列步骤a)使矿物燃料与所说微生物接触;和b)在足以引起有机碳-硫键酶促裂解的条件下保温矿物燃料与被转化之微生物的混合物。从而使矿物燃料中的有机硫含量显著降低。
34.如权利要求33的使矿物燃料脱硫的方法，其中矿物燃料是石油。
35.如权利要求33的使矿物燃料脱硫的方法，其中DNA得自玫瑰色红球菌菌株IGTS8。
36.能够与含有生物催化剂基因的全部或部分重组DNA分子杂交的核酸探针，其中所说的生物催化剂能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫。
37.能够与含有玫瑰色红球菌菌株基因的全部或部分重组DNA分子杂交的核酸探针，其中所说的基因编码能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
38.能够与来自玫瑰色红球菌菌株的全部或部分DNA杂交的核酸探针，其中所说的DNA编码能使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
全文摘要
本发明涉及含有编码生物催化剂之基因的重组DNA分子，所说的生物催化剂能够使含有有机硫分子的矿物燃料脱硫。例如，本发明包括含有玫瑰色红球菌菌株之基因的重组DNA分子。
文档编号C10G32/00GK1085254SQ93116500
公开日1994年4月13日 申请日期1993年7月10日 优先权日1992年7月10日
发明者J·拉姆伯塞克, C·S·比丁顿, B·R·科瓦斯维奇, K·D·友格, S·A·迪诺姆 申请人:能量生物系统公司