专利名称：：灵芝子实体悬浮液与纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种灵芝液，特别是涉及一种经由机械式研磨制成的灵芝子实体悬浮液。
背景技术：
：纳米/次微米产品是近年来的热门话题，近年来已引起研究学者、业者与一般大众的注意，有鉴于纳米/次微米科技的重要性及潜力，很多国家已将纳米/次微米科技的相关研究列为优先考虑，且将纳米/次微米科技应用于食品材料上，而对全球的食品系统造成革命性的改变，虽然目前纳米/次微米食品材料的研究尚属于起步阶段，但是食材粒子细小后，应可提高吸收率，而有助于婴儿、老人或消化系统不良者摄取必须的营养物质，且可应用于中草药，使药效较容易发挥，为达到这些长远的目标，食品材料的纳米/次微米化技术与产品性质的了解是一项重要的课题。在中草药中，灵芝子实体被公认为具有多项保健功能，如抗肿瘤、调节免疫机能、降血脂、降血压、降血糖、抗病毒、抗过敏、抗氧化、抗辐射、抑制血小板凝集与止痛等，无论是以完整子实体或萃取物食用，灵芝确实是相当安全的中草药，甚至给予高剂量，例如每日30g的干燥子实体萃取物，经证实也无显著的毒性反应，且利用动物实验评估灵芝的营养价值和毒性，结果显示灵芝并无基因毒性(genotoxicity)。据估计，2001年全世界灵芝的产量为4800吨，中国是最大生产国(3500吨)，约有200万人食用灵芝，每人每年约消耗2.5公斤，消费者健康意识的增加，使灵芝产品市场将逐年成长。但是市面上的灵芝产品很多种，常见的为整株灵芝、灵芝切片、胶囊、颗粒、锭丸与液状饮品(灵芝茶、灵芝酒、灵芝糖浆及灵芝饮料)等，依其有效成份含量而言，质量优劣参差不齐。虽然灵芝保健食品是目前食品市场的热门商品，然而，其有效成分(例如几丁质、寡醣、葡聚糖)萃取不易、溶解度低，在人体内的吸收也不甚理想，且萃取后的灵芝渣(多为膳食纤维的成分)又常被视为废弃物，而造成资源的浪费。经申请人研究，若能将完整的灵芝子实体粒径纳米/次微米化处理，制成纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，除了有助于灵芝多醣等活性成分的释出，而获得完整的活性成分，及增加活性成分的吸收与利用外，还可从中获得纳米/次微米化的膳食纤维，而同时减少废弃物的产生。
发明内容本发明的目的是在提供一种经由机械式研磨制成，且具有细小灵芝微粒的灵芝子实体悬浮液。本发明的另一个目的是在提供一种经由机械式研磨制成，且具有纳米/次微米级灵芝微粒的灵芝子实体悬浮液。本发明灵芝子实体悬浮液，为灵芝子实体经由机械式研磨后所得到含有灵芝微粒的灵芝子实体悬浮液，并含有纤维质、几丁质及3“葡聚糖，且灵芝微粒的体积平均粒径小于10lim。本发明纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，是将灵芝子实体经由机械式研磨后所得到含有灵芝微粒的灵芝子实体悬浮液，再经离心所得到的离心上清液，该纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液含有灵芝微粒、纤维质、几丁质及3-葡聚糖，且灵芝微粒的体积平均粒径小于2iim。本发明的有益效果在于透过以机械式研磨来制成的灵芝子实体悬浮液，除了无须萃取便可获得完整的活性成分外，还可大幅提高纤维质比表面积，且纤维质的后续利用无须再粉碎，可作为一种良好的膳食纤维添加物。图1是体积平均粒径相对研磨转速与进料浓度的曲线图；图2是研磨时间相对粒径的曲线图；图3是灵芝子实体悬浮液的离心上清液的粒径分布图；图4是灵芝子实体悬浮液的离心沉淀物的粒径分布图；图5是新鲜灵芝子实体的影像图；图6是灵芝子实体经blender搅打后的影像图；图7是灵芝子实体经均质处理后的影像图；图8是灵芝子实体经两段式机械研磨后的影像图；图9是灵芝子实体悬浮液经4°C储存后的粒径分布图；图10是灵芝子实体悬浮液经过冷冻干燥后的粒径分布图；图11是灵芝子实体悬浮液经过高压蒸气灭菌后的粒径分布图；图12是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经冷冻处理后的粒径分布图；图13是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经高压蒸气灭菌后立刻量测所得的粒径分布图；图14是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经高压蒸气灭菌并经28天储存后的粒径分布图；图15是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经高压蒸气灭菌并经1年储存后的粒径分布图；图16是灵芝子实体悬浮液的离心上清液尚未浓缩处理的粒径分布图；图17是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经2倍浓缩处理后的粒径分布图；图18是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经4倍浓缩处理后的粒径分布图；图19是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经8倍浓缩处理后的粒径分布图；图20是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经12倍浓缩处理后的粒径分布图；图21是灵芝子实体悬浮液的离心上清液经20倍浓缩处理后的粒径分布图；图22是灵芝子实体悬浮液经稀释5倍并与乳化剂均勻混合后的浊度随时间变化曲线图；图23是灵芝子实体悬浮液经稀释5倍并与乳化剂均勻混合后的浊度随时间变化曲线图；图24是灵芝子实体悬浮液经稀释10倍并与乳化剂均勻混合后的浊度随时间变化曲线图；图25是灵芝子实体悬浮液经稀释10倍并与乳化剂均勻混合后的浊度随时间变化曲线图；图26是灵芝子实体悬浮液经稀释50倍并与乳化剂均勻混合后的浊度随时间变化曲线图；图27是灵芝子实体悬浮液经稀释50倍并与乳化剂均勻混合后的浊度随时间变化曲线图。具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明本发明灵芝子实体悬浮液的实施例，是由整株灵芝子实体经过机械式研磨处理制成，该灵芝子实体悬浮液包含经由机械式研磨灵芝子实体所得到的灵芝微粒，及与灵芝子实体一起进行研磨的可食性乳化剂。机械式研磨是利用机械能量、研磨介质(研磨珠)间的碰撞作用，及浆料-流体与流体_研磨珠间的剪切力，将大粒子破碎与分散，常用于涂料或纳米粉体制备。机械式研磨机配有冷却系统，可避免高温的产生，有利于对热敏感的有机材料的处理，例如食品材料与中草药等。以下便以一般热水萃取法获得的灵芝萃取物，与本发明直接将灵芝子实体以机械式研磨进行纳米/次微米化处理后的灵芝子实体悬浮液进行比较说明。对照组一般热水萃取将灵芝子实体清洗后置于70°C烘箱中，以热风干燥至水份残余约10%左右。利用粉碎机(RT-04，RongTsengIronCo.，Taiwan)细碎成粉末备用。取300g灵芝子实体粉末加入4500mL蒸馏水，于100°C加热2小时，趁热以60mesh筛网先行粗滤，所得滤液再以WhatmanNo.4滤纸(Whatman，SpringfieldMill,UK)过滤以除去细微残渣，可得黄色滤液，便为萃取液。残渣再加入4500mL蒸馏水，且如上进行萃取。每一种样品进行三次热水萃取，将所得滤液混合，在真空下浓缩至适量体积，计算浓缩率并纪录的。实验组机械式研磨整株灵芝子实体，包含以下步骤步骤(一)研磨前处理。秤取灵芝子实体，洗净切丁后加入250mL4°C去离子水，以搅碎器(Blender7012S，WaringCommercial,USA)搅打5分钟后倒入600mL的高型烧杯中，以去离子水(150mL、4°C)将残留在搅碎器中的子实体粗碎物洗出，在4°C下静置隔夜，使纤维组织松弛，再以高速均质机(PolytronPT3000,KinematicaAG,Switzerland)于20，OOOrpm下搅打10分钟(全程冰浴以避免温度上升)，使子实体颗粒小于300um，再进行机械式研磨。步骤(二)机械式研磨。使用纳米细磨机(MiniPur,NETZCH-FeinmahltechnikGmbH,German)研磨上述步骤(一)所得的子实体颗粒，研磨需分为二个阶段。第一阶段使用粒径0.8mm的钇锆珠为研磨介质，第二阶段是改用粒径0.3mm的钇锆珠为研磨介质，进料速度360mL/min。为探讨操作条件对产品的影响，选择不同的灵芝固形物浓度、研磨介质填充量及搅拌轴转速进行实验，在研磨过程中，每30分钟取样进行粒径分析。5完成上述灵芝子实体悬浮液的制备后，将针对对照组与实验组所得的灵芝液进行化性与物性分析比较，分别如下所述(一)化性分析Α.β-葡聚糖(β-D-glucans)含量测定利用荧光染剂Anilineblue定量β-葡聚糖。取研磨后的灵芝子实体悬浮液离心(2000Xg，IOmin)后，以WhatmanNo.4滤纸过滤，取适量样品溶液，加入0.3NNaOH使总体积为3mL，搅拌30分钟，以INHCl调整pH至11.5，加入50mM的pH11.5的Na2HP04_Na0Hbuffer(含0.5MNaCl)，并定容至10mL。取上述溶液2mL，加入0.2mLanilineblue(lmg/mL)，以Vortex震荡混合均勻后，静置2小时，以荧光检测器检测(激发波长395nm，放射波长495nm)。以不同浓度的Lentinan制备标准曲线，计算样品中的β-葡聚糖含量。B.总膳食纤维测定采用AOAC991.43(enzymatic-gravimetricmethod)禾口AOAC993.21(nonenzymatic-gravimetricmethod)两种方法。AOAC991.43是目前广为学者所接受的测定方法，AOAC993.21是一种不使用酵素的简便方法(此法只适用于总膳食纤维>10%，淀粉<2%的样品，包括灵芝的部分中草药均符合此规范)。C.几丁质(Chitin)含量测定取400mg灵芝子实体悬浮液，以6NHCl在100°C下回流水解5小时，冷却至室温后以WhatmanNo.4滤纸过滤，取ImL滤液于4550°C下减压干燥后备用。将干燥的水解产物回溶于蒸馏水中。取ImL上述水解产物的稀释溶液加入0.25mL4%acetylacetone,在90°C下加热1小时，冷却后加入2mLethanol并震荡使沉淀物溶解，随后加入0.25mLEhrlichreagent，呈色后，在波长530nm下测定其吸光值。利用不同浓度的glucosaminehydrochloride(5~50μg/mL)制作标准曲线，并以1,4-anhydro-N-acetyl-2_deoxy-D-glucopyranoseequivalent计算/L丁质含量。(二)物性分析A.粒径分布测定使用动态光散射粒径分析仪(dynamiclightscatteringparticlesizeanalyzer)(Nanotrac150，MicrotracInc.,USA)，测定所得的灵芝微粒的粒径分布，该仪器的测定范围0.8nm至6500nm。如超出该范围，便改用BeckmanCoulter(CA,USA)生产的LS230粒径分析仪进行量测，其粒径量测范围0.4μm至2000μm,光源经滤光处理后，侦测下限可达40nm。以去离子水作为空白测试，并在25°C下进行测定。将研磨后的灵芝子实体悬浮液经适当稀释后，直接以仪器测定的。利用分析软件(FLEXSoftware,MicrotracInc.，USA)分析散射讯号，计算粒子的Dopplershifts以求得粒径分布百分比、平均粒径(meanparticlesize)、中间粒径(medianparticlesize)等粒径分布参数。B.显微观察使用光学显微镜(Optiphot-Pol，Nikon,Japan)观察灵芝粗碎后的组织结构，及研磨初期灵芝颗粒的变化情形。以扫描式电子显微镜(SEM)观察所得灵芝微粒的显微结构。样品经稀释后，涂抹于载玻片上，置于室温下干燥，用银胶将样品黏着于铝台上，于真空状态下以离子覆膜器将样品表面镀上金膜后，以SEM观察样品的显微结构。另也使用穿透式电子显微镜(TEM)(JEM-1230,JEOLCo.Ltd,Japan)观察所得灵芝微粒的显微结构，确认粒径分布的测量结果。样品经适当稀释后，以TEM专用的200mesh镀碳铜网(01800-F，TedPella,Inc.，U.S.Α.)沾取样品悬浮液，置于干燥箱中干燥，干燥后的样品直接以TEM观察，并以CCD照相系统(DualVisionCCD，GatanInc.,USA)拮取所需的数字影像。TEM所用的电子源为热阴极电子枪(LaB6灯丝)，最大加速电压为120KV。(三)灵芝子实体悬浮液的稳定性处理与分析A.界面活性剂的添加选择适当的研磨操作条件(转速3600rpm，介质直径0.2mm；时间90分钟)，于研磨前加入不同种类、浓度和HLB(hydrophile-lipophiIebalance，亲水亲脂均衡)值的可食性乳化剂。选用的乳化剂有1.离子型界面活性剂(ionicsurfactant)，例如脂肪酸盐类(属阴离子型界面活性剂)。2.非离子型界面活性剂(nonionicsurfactant)，例如(1)蔗糖酯(sugarester)(选择HLB值分别为3、7、11和15的蔗糖酯)；(2)聚山梨醇酐脂肪酸酯(Span85、80、60、20和Tween65、20，HLB值分别为1.8,4.3,6.7,8.6,10.6,16.7)。上述所选用的乳化剂浓度，是以研磨的固形物含量为基础，加入5%、10%、20%和50%。B.储存性试验将研磨后及经稳定处理的灵芝子实体悬浮液分别放置在4°C与室温环境下，于储存期间(0、0.5、1、2、6、12、24、48、72、96小时)，取样进行浊度分析和粒径分析。于此试验中，将添加少许防腐剂，以避免微生物的生长。C.浊度测定浊度的高低与溶液中粒子的数量有关，若样品中的纳米/次微米粒子聚集成大粒子，甚至沉淀，悬浮粒子总数下降，致使上层溶液浊度下降。可由浊度初步判断灵芝子实体悬浮液的稳定性，进而淘汰不适用的乳化剂。使用携带型浊度计(portableturbidimeter，model21OOP,HACHcompany，U.S.Α.)测定储存期间浊度的变化，检测前先以标准品(GelexSecondaryStandards)(浊度分别为0-10NTU、0_100NTU和0-1000NTU)校正，取研磨及稳定处理后的灵芝子实体悬浮液，经适当稀释，取15mL置入水样检测瓶中，直接以浊度计测定的，单位为NTU。D.界面电位(Zetapotential)测定界面电位是粒子间吸引力或排斥力的指标，该值的增加，显示粒子越稳定，是测量粒子表面性质的有效工具。将稀溶液置于侦测仪上，赋予粒子固定值的电压，观察粒子的移动速率，由移动速率与时间的相关性，可导出粒子表面的相关性质。界面电位分析仪(Zetapotentialanalyzer)可分析界面电位对应pH值、乳化剂添加浓度及时间的变化曲线图及结果，由于界面电位的测定为纳米/次微米粒子稳定性的重要指针，借由该数据的分析，可推论出纳米/次微米级灵芝微粒再聚集的可能原因，进而探讨其基础理论。配合现有的浊度计及雷射粒径分析仪等，将可使产品稳定性的解析较加完备且具时效性，同时了解纳米/次微米级灵芝微粒的表面特性，是将来进一步修饰粒子表面性质的重要依据。E.显微观察使用光学显微镜(Optiphot-Pol，Nikon,Japan)观察纳米/次微米级灵芝微粒再聚集的变化情形。此外，以穿透式电子显微镜(TEM)(JEM-1230,JEOLCo.Ltd,Japan)观察储存期间纳米/次微米级灵芝微粒的显微结构，以确认粒径分布的测量及再聚集的结构，并以扫描式电子显微镜(Scanningelectronmicroscope,SEM)观察所得样品的显微结构。(四)28天亚急毒性试验在试验物质给予期间测量动物体重及食物消耗量的变化。剖检前收集血液样品，进行血液及血清生化分析。试验物质给予期间结束，进行剖检，以肉眼观察及记录动物的器官与组织的变化，并测量主要脏器重量。最高剂量组与对照组进行组织病理检验。A.动物处理动物是采用自台大医学院动物中心的5-6周ICR小鼠，每剂量组使用雄、雌各12只动物。在进行毒性测试前，动物首先在具温度、湿度及光照的动物房适应一周，并自由摄取正常饲料及水。一周后开始喂食实验，连续28天后，牺牲小鼠。B.灵芝剂量在本试验中，低剂量及中剂量组是分别采0.02及0.2g/kg/day，高剂量组采用2g/kg/day。此低剂量(0.02g/kg/day)、中剂量(0.2g/kg/day)、高剂量(2g/kg/day)分别为成人每日建议摄取量的同剂量、10倍及100倍。C.血清生化值的测定动物的血液样本取自颈动脉血放入血清分离管，经3000Xg15分钟离心后取的血清样本。分析项目如下高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL),低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)、麸氨酸氨基转化酶(glutamicoxaloacetictransaminase,GOT)、麸氨酸丙酮酸氨基转化酶(glutamicpyruvictransaminase,GPT)、血液尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)、肌氨酸酐(creatinine,CRE)、总胆固醇(cholesterol,CH0)、三酸甘油脂(triglyceride,TG)、钠离子(Na+)、钾离子(K+)、氯离子(Cl—)、葡萄糖(Glucose)等。D.血液分析动物的血液样本取自颈动脉血放入含EDTA抗凝剂试管采集ImL全血，分析项目如下白血球(whitebloodcell，WBC)、红血球(redbloodcell，RBC)、血红素(hemoglobin,Hb)、血球容禾只比(hematocrit,Hct)、平均红血球容禾只(meancorpuscular,MCV)、平均红血球血红素(meancorpuscularhemoglobin,MCH)、平均红血球血红球浓度(meancorpuscularhemoglobinconcentration,MCHC)、血小板(platelets,PLT)、淋巴球(lymphocytes,LYMPH)(redcelldistributionwidth-coefficientofvariation，RDW-CV)、血小板红血球(plateletdistributionwidth,PDW)、平均血小板容积(meanplateletvolume,MPV)、血小板大细胞范围(platelet-largecellrange,P-LCR)等。Ε.组织病理切片将所有动物的组织，肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏、罩丸、副罩及子宫卵巢等标的器官取下后，放入10%formalin固定一星期。切片后以hematoxylinandeosin染色后，以显微镜观察。组织病理切片判读委托台湾动物科技研究所进行。以下便针对本发明灵芝子实体悬浮液的制程与分析进行说明(一)、研磨制程与粒径的关系如表1所示研磨条件，在相同研磨时间(90min)下，探讨转速(23103570rpm)、进料浓度(0.52.0g/mL)和研磨珠填充量(80140mL)对灵芝纳米/次微米化制程的影响。如图1所示，转速提高会增加研磨珠间的碰撞次数和强度，致使温度快速上升并促使粒子再聚集，造成平均粒径的增加。提高进料浓度可降低粒子间的平均距离，并使研磨珠碰撞范围内存在较多的粒子而增加研磨效率。填充量过高，可能会限制研磨珠在研磨过程中的运动，降低碰撞速度，致使研磨效率降低。由上述实验结果可知，在纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液的研磨制程中，使用较高的固形物浓度，并降低研磨转速及研磨珠的填充量，应可降低产品的体积平均粒径。将前述前处理所得的灵芝细碎悬浮液于3600rpm的固定转速、360mL/min的固定进料速率和140mL的固定填充量，及不同固形物浓度与两种研磨珠大小(0.8mm、0.3mm钇锆珠)下研磨30、60、90、120、150、180和270分钟。发现经前处理后的灵芝细碎悬浮液，其粒径虽可小于300μm，但是绝大部分仍大于150μm，因此，欲将灵芝子实体纳米/次微米化需采用阶段性研磨，也就是先以0.8mm钇锆珠细磨，待粒径降至约50μm以下，再改以0.3mm钇锆珠继续研磨。如图2所示，研磨时间也影响粒径，随着研磨时间的增加，体积平均粒径减少，于研磨60分钟，体积平均粒径的减少速率较高，随后趋缓，研磨90分钟后，灵芝微粒的体积平均粒径约为1.2μm。继的改以0.3mm锆珠研磨90分钟后，体积平均粒径小于1.0μm。因所得悬浮液的粒径分布范围较宽，故粒子间易再聚集而沉淀，虽然数目平均粒径比体积平均粒径小很多，但是为要求较高的质量，本发明是以体积平均粒径为指针。由图3、4所示的粒径分析结果可知，将上述以0.3mm钇锆珠研磨180分钟所得灵芝子实体悬浮液以IOOOOg离心10分钟，除去较大的颗粒后，离心上清液的粒径分布范围为28578nm(图3)，体积平均粒径约105nm，其中67%的粒子小于lOOnm，就食品而言，小于1μm应足可增加其在体内的吸收，离心上清液的粒子都小于1μm，其固形物含量虽较低，但是因研磨而被萃提出的活性成分都仍存留下来。而离心沉降物的颗粒尺寸小于IOym(图4)，质地细致，可作为保养品(如面膜)或敷料、人工皮肤的基材，且因富含几丁质及纤维素，所以可作为一种良好的膳食纤维添加物。如图58所示，显微观察研磨后的灵芝微粒，新鲜灵芝子实体(如图5所示)经blender搅打后，以扫描式电子显微镜(SEM)观察，由图6中清楚可见灵芝子实体的树状分枝骨骼菌丝。经适当均质处理后，该骨骼菌丝变的较为细碎、松散(如图7所示)，且其大小约在数十至数百微米，而此一种状态将有利于后续的研磨处理。图8为经两段式研磨后，利用穿透式电子显微镜(TEM)观察的结果，图中圆形颗粒为灵芝子实体悬浮液中的纳米粒9子，由标尺可明显的看到，单一颗粒确可达0.Ιμπι以下的纳米级尺度，但是因颗粒间的再聚集使整体的粒径范围变大，可达数百纳米，也就是次微米级尺度。此一种结果也验证了上述粒径分析仪所测得的结果，并再次确认本发明使用的介质研磨制程，确实可使灵芝子实体研磨后的灵芝微粒降至纳米/次微米尺度。由于灵芝子实体富含纤维素及几丁质，质地粗糙且坚韧，将这些纤维物质的粒径下降，除提高比表面积外，也可改善产品进食的口感。膳食纤维的生理功效与其表面的吸附作用有关，因此，提高膳食纤维的比表面积，可增进其生理活性。将膳食纤维的粒径由0.Imm下降至1μm,比表面积可提高100倍，膳食纤维的建议摄取量可减为原建议量的百分的一，若粒径下降至IOOnm以下，建议摄取量可减至原建议量的千分的一。换言的，在500mL的饮用水中加入50500ppm的纳米/次微米级膳食纤维，便可达到膳食纤维的每日建议摄取量(25g)。基于这个观点，灵芝子实体悬浮液的离心上清液保有灵芝特有的生理活性成分，还额外提供高表面积的膳食纤维。(二)研磨制程与有效成分的关系如表2所示，经介质研磨后，β-葡聚糖的含量明显增加，以较大研磨介质(粒径0.8mm)进行研磨，产品中的β-葡聚糖含量与热水萃取产品(约0.01mg/mL)相近，随着介质粒径的降低及研磨时间的增加，β-葡聚糖含量增加为热水萃取产品的4倍，且高于市面上所收集到的商品(0.00230.0202mg/mL)。表2一般的市售商品，其声称的有效成分多以热水或有机溶剂来提取，虽可取得该有效成分，但是提取量有限，且尚有加工后的废水、有机溶剂及残渣处理问题。以机械式研磨的制程方式，除了可使灵芝子实体悬浮液中具有纤维素、几丁质等膳食纤维，也可借由细磨过程中灵芝子实体细胞壁的破碎，促使有效成份的释出。如表3所示，几丁质含量也有类似的现象，以0.3mm介质研磨所得的产品中几丁质含量高于0.8mm介质研磨所获得的产品，但是若以离心方式将所得产品中的较大的颗粒移除后，上清液的几丁质含量会大幅下降，但是仍约为一般热水萃取所得产品的5倍，可见该被移除的颗粒含有丰富的几丁质。由于热水提取几乎只可抽得水溶性物质，故提取液中的几丁质含量甚低，绝大部分都残存在药渣中。药渣约含有3540%几丁质，4050%β-葡聚糖，其余为以黑色素(melanines)为主的含氮物，为良好的膳食纤维来源，如将子实体粉碎并细磨至纳米/次微米尺寸，不只可取代萃取，产品中也将保存子实体的所有成分(富含几丁质、纤维素等膳食纤维)，且因粒子小，有助于人体的吸收，所以此纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液或其浓缩产品将适于作为保健食品的添加物。表3(三)灵芝子实体悬浮液的稳定性如图911所示，灵芝子实体经研磨后，高浓度的灵芝微粒及宽广的粒径分布，促使灵芝微粒间相互碰撞并迅速聚集成较大的微粒团簇，粒径的增加致使重力效应远大于布朗运动效应，进而产生明显的沉降现象。于4°C下静置24小时后分析其粒径，微粒已聚集并构成数十微米的团簇，体积平均粒径增至9.35μm(如图9所示)，考虑研磨产品于后续加工，如冷冻贮藏、冷冻干燥或高温灭菌加工等的安定性，针对冷冻(-20°C，24小时)及高压蒸汽灭菌(121°C，15分钟)后的子实体悬浮液进行粒径分析，以探讨加工前后的粒径分布差异。灵芝子实体悬浮液的灵芝微粒在冷冻过程中会再聚集，解冻后似有离水的相分离现象，聚集构成的微粒团簇呈棉絮状并难以物理或机械力(如震荡、均质、超音波震荡处理)将的分散，冷冻后子实体悬浮液的粒径分布如图10，体积平均粒径为109μπι。高压蒸汽灭菌处理也会造成微粒间严重的再聚集作用，构成呈团块状的微粒团簇，并如同冷冻处理般难以物理或机械力将的分散，其粒径分布范围5.9824.5μm，体积平均粒径为132μπι(如图11所示)。机械式研磨所得的灵芝子实体悬浮液，粒径分布范围宽广，易再聚集沉淀，但是固形物含量高，富含几丁质、纤维素，此灵芝子实体悬浮液或其浓缩产品将适于作为保健食品的添加物。(四)灵芝子实体悬浮液的离心上清液的稳定性如表4所示，研磨时间的改变，除了会影响灵芝微粒平均粒径外，也间接影响储存安定性，研磨时间越长者，产品的稳定性越高。研磨30分钟的灵芝子实体悬浮液的离心上清液产品(IOOOOg离心10分钟)，经21天的存储器积平均粒径由0.195增加为1.199μm,但是研磨180分钟的灵芝子实体悬浮液的上清液产品(IOOOOg离心10分钟)，体积平均粒径由0.126增为0.137μm，增加率低于10%，显示增加研磨时间有助于粒子的稳定性。接着，就冻干、高压蒸汽灭菌及浓缩处理对灵芝子实体悬浮液的离心上清液的影响做探讨。表4研磨30~90併中以0.8mm钇锆麵行的第一阶段研磨结果。研磨120-180中以0.3mm钇锆珠进行的第二阶段研磨结果。如图12所示，先将灵芝上清液经冻干后，再分散于水溶液中，并以Nanotrac150粒径分析仪测定粒径分布(粒径量测上限为6.54μm)，由结果可知，冻干处理会促使灵芝微粒间再聚集。冻干后，粒径分布范围宽广，有相当比例微粒的粒径大于6.54μm(碍于仪器量测上限而无法测得)，其体积平均粒径为1.177μm。如图1315所示，离心上清液经高压蒸汽灭菌处理后仍保有相当好的安定性，灭菌处理后，待温度下降至室温便量测其粒径，所有粒子都小于1μm，粒径分布范围36800nm，体积平均粒径为140nm，且仍有56%的微粒维持在IOOnm以下。观察其于室温下贮存28天(如图14所示)及1年(如图15所示)的粒径变化，粒径分布虽有往大粒径偏移，但是偏移幅度甚小，而其体积平均粒径也只分别增至165nm和373nm，显示离心上清液经高温作用后仍十分稳定，粒子在贮存期间的再聚集现象并不显著。借由离心虽可将离心上清液的粒径分布降至Iym以下，并使其具有的稳定性，但是相对的，离心上清液的固形物含量及灵芝微粒数会大幅减少。为提高固形物浓度，以减压浓缩方式降低离心上清液的水分含量，并在不同浓缩倍率(concentrationratio)下取样，量测其粒径变化。浓缩倍率的计算是以原液体积除上最终浓缩液体积。图1621与表5分别为离心上清液经2、4、8、12及20倍浓缩后的粒径分析结果，低于4倍浓缩的离心上清液，其粒径变化不大，体积平均粒径只增加33%，且微粒都小于1μm。浓缩8倍以上时，粒子间开始有聚集现象产生，并使粒径分布往大粒径偏移，粒径分布大于1μm。就本实施例而言，为提高产品固形物浓度并兼顾安定性，将离心上清液浓缩46倍应可符合所需。表512(五)乳化剂对灵芝子实体悬浮液稳定性的影响浊度是一种量测简易的物理参数，对稳定分散的悬浮溶液而言，其浊度不应随时间而呈现显著差异。因此，本发明针对所欲探讨的各种变因，进行浊度分析，以筛选的乳化剂。如表6所示，未添加乳化剂的灵芝子实体经研磨后，灵芝子实体悬浮液浊度高于1000NTU,稀释2、5、10和50倍后的试样的浊度均随时间而逐渐下降，稀释倍率愈高，浊度的变化率愈小。低浓度(高稀释倍率)悬浮液的浊度稳定性较高浓度(低稀释倍率)佳，显示微粒浓度是影响悬浮液稳定性的重要参数，浓度愈高微粒间碰撞机率愈高，聚集现象也相对明显。整体而言，微粒间的聚集相当明显，致使灵芝子实体悬浮液的聚集沉降行为明显。表6在本发明中，选择以不同HLB(hydrophile-lipophiIebalance，亲水亲脂均衡)值的蔗糖酯(sugarester,HLB分别为3、7、11和15)、聚山梨醇酐脂肪酸酯(Span85(司盘85),Span80(司盘85),Span60(司盘85),Span20(司盘85)和Tween65(吐温65)、Tween20(吐温20)，HLB分别为1.8,4.3,6.7,8.6、10.6和16.7)及脂肪酸甘油脂(HLB为3.8)作为初步筛选的乳化剂，添加量先固定为相对于灵芝子实体重量的5%。图2227分别为灵芝子实体悬浮液经稀释5倍(图22、23)、10倍(图24、25)和50倍(图26、27)，并分别加入各种乳化剂均勻混合后，浊度变化率随时间的关系。浊度变化率为负值表示浊度下降，正值表示上升。除了少数的正值外，几乎所有试验的浊度变化趋势均为下降。整体而言，稀释倍率愈高，微粒间碰撞机率降低，聚集作用减缓，浊度随时间的变化率趋缓，各稀释倍率的浊度均随时间的增加而下降。在最高稀释倍率50的情况下(灵芝微粒浓度约100ppm(0.001mg/mL))，浊度变化率最小，且以聚山梨醇酐脂肪酸酯类乳化剂的稳定性，于96小时后浊度变化率绝对值均小于30%。于低稀释倍率(5倍及10倍)下，浊度变化率与乳化剂种类、HLB值似无关联性，96小时后浊度变化率绝对值均大于80%，也就是无显著稳定效果。因此，如以浊度作为判断基准，就灵芝子实体悬浮液而言，以5%添加量的聚山梨醇酐脂肪酸酯作为分散剂，对浓度IOOppm(最高稀释倍率50倍)的灵芝子实体悬浮液有的稳定性。由表7的粒径(灵芝微粒浓度为IOOppm)分析结果可知，未添加乳化剂的灵芝子实体悬浮液经静置存放96小时后，灵芝微粒再聚集后的体积平均粒径(MV)为3.24μm，其中，粒径小于1μm的微粒(纳米/次微米级)占灵芝子实体总质量的24.9%，粒径属纳米尺度(小于IOOnm)者占灵芝子实体总质量的2.04%。在研磨时添加5%乳化剂时，添加脂肪酸甘油脂、Span85及Span80者的体积平均粒径变化幅度较小，分别变为3.86,2.90、3.68μm0另外，提高界面电位值将有助于微粒的稳定性，灵芝子实体悬浮液未添加乳化剂的界面电位值约-11.7mV，本实施例所使用乳化剂中，以Span85,Span80及Span20对于微粒界面电位的增加较为显著，界面电位值分别为-16.7、-13.8及-13.7mV。综合上述浊度分析、粒径分析和界面电位分析结果，于乳化剂添加量5%的情况下，HLB值小的乳化剂有助于稳定灵芝子实体悬浮液系统，因此，以下便选择蔗糖酯(HLB3)、脂肪酸甘油脂(HLB3.8),Span85(HLB1.8)及Span80(HLB4.3)等，与灵芝子实体实际进行两段式机械研磨，进行乳化剂添加量对灵芝子实体悬浮液系统稳定性影响的测试。表7如表8、9所示，灵芝子实体悬浮液于不同乳化剂添加量(相对于灵芝子实体重量的5%、10%、20%和50%)时的粒径分析、界面电位量测结果。由粒径分布结果可知，四种乳化剂中以Span80的稳定效果，其添加量10%时，可将微粒的体积平均粒径降至2.29μm，并提高纳米和次微米粒子所占的比例。观察界面电位的变化情形可发现，提高四种乳化剂的添加量都可增加灵芝子实体悬浮液的界面电位值，但是高于20%稳定效果有限。表8表9在28天亚急毒性试验期间，雄、雌性小鼠对照组及处理组的平均每日体重变化、平均每日食物消耗量与平均每日水消耗量都无显著差异，雄、雌性小鼠处理组和对照组血液分析也无明显差异，其检测值都在正常值范围内，主要器官的组织切片检查也正常，所以在试验期间并未造成死亡现象及引发不良临床s征兆。综观上述，灵芝子实体含有大量粗纤维及木质素成分，且一般真菌细胞壁的成分除了纤维素外尚有几丁质，如灵芝多醣等活性成分也多存在于细胞壁中，本发明透过机械式研磨来制造灵芝子实体悬浮液的方式，除了无须萃取便可获得完整的活性成分外，还可大幅提高纤维质比表面积，且纤维质的后续利用无须再粉碎，可作为一种良好的膳食纤维添加物。其中，研磨所得的灵芝子实体悬浮液再经后续离心处理后，离心沉降物中富含几丁质及纤维素，其颗粒尺寸小于10μm，质地细致，可作为保养品(如面膜)或敷料、人工皮肤的基材，而离心上清液中，灵芝微粒粒径都属纳米/次微米级，并保有完整的活性成份，其几丁质等有效成分为一般热水萃取的5倍以上，且含有部分粒径较小的纤维素，同样可用以作为保健食品的添加物。权利要求一种灵芝子实体悬浮液，其特征在于，是由灵芝子实体经由机械式研磨制成，并含有灵芝微粒、纤维质、几丁质及β葡聚糖，且灵芝微粒的体积平均粒径小于10μm。2.如权利要求1所述的灵芝子实体悬浮液，其特征在于，粒径小于1μm的灵芝微粒占灵芝总质量的10%以上。3.如权利要求2所述的灵芝子实体悬浮液，其特征在于，几丁质含量高于0.lmg/mL，纤维质含量高于0.lmg/mL,β-葡聚糖含量高于0.01mg/mL。4.如权利要求1、2或3所述的灵芝子实体悬浮液，其特征在于，还包含与灵芝子实体一起进行机械式研磨的可食性乳化剂。5.如权利要求4所述的灵芝子实体悬浮液，其特征在于，该可食性乳化剂是选自于非离子型界面活性剂，且该可食性乳化剂含量是灵芝子实体重量的0.125%。6.如权利要求5所述的灵芝子实体悬浮液，其特征在于，可食性乳化剂的亲水亲脂均衡值介于15。7.如权利要求6所述的灵芝子实体悬浮液，其特征在于，该可食性乳化剂是选自于由聚山梨醇酐脂肪酸脂、脂肪酸甘油脂，及聚山梨醇酐脂肪酸脂与脂肪酸甘油脂的混合所组成的群体。8.如权利要求7所述的灵芝子实体悬浮液，其特征在于，聚山梨醇酐脂肪酸酯是选自于司盘80、司盘85及司盘80与司盘85的混合所组成的群体。9.一种纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，其特征在于，是将灵芝子实体经由机械式研磨后，再经离心所得到的离心上清液，该纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液含有灵芝微粒、纤维质、几丁质及β-葡聚糖，且灵芝微粒的体积平均粒径小于2μm。10.如权利要求9所述的纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，其特征在于，粒径小于1μm的灵芝微粒占总灵芝微粒含量的60%以上。11.如权利要求9或10所述的纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，其特征在于，灵芝微粒的浓度范围介于3mg/mL100mg/mL。12.如权利要求10所述的纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，其特征在于，灵芝微粒的体积平均粒径小于250nm，且灵芝微粒的粒径小于1μm。13.如权利要求12所述的纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，其特征在于，50%以上的灵芝微粒的粒径小于lOOnm。14.如权利要求13所述的纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，其特征在于，灵芝微粒的浓度范围介于3mg/mL20mg/mL。15.如权利要求9、10、12或13所述的纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，其特征在于，几丁质浓度大于0.lmg/mL。全文摘要一种灵芝子实体悬浮液与纳米/次微米级灵芝子实体悬浮液，该灵芝子实体悬浮液为灵芝子实体经由机械式研磨后所得到含有灵芝微粒的液体，并含有纤维质、几丁质及β-葡聚糖，且灵芝微粒的体积平均粒径小于10μm。透过机械式研磨制成的灵芝子实体悬浮液，除了无须萃取便可获得完整的活性成分外，还可大幅提高纤维质比表面积，且纤维质的后续利用无须再粉碎，可作为一种良好的膳食纤维添加物。文档编号B82B1/00GK101897430SQ20091014378公开日2010年12月1日申请日期2009年5月26日优先权日2009年5月26日发明者吴尚霖,林俊州,林颖圣,江怡娴,郑育修,黄安义,黄雅翌申请人:生春堂制药工业股份有限公司