专利名称：：一种紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本实用新型属生物
技术领域：
，涉及一种紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒，是通过利用SYBRGREENI荧光定量PCR，检测肿瘤组织中紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因，微管不稳定蛋白(Stathmin)基因mRNA表达水平的试剂盒。技术背景紫杉醇己成为卵巢癌术后常规一线化疗药物，紫杉醇联合铂类化合物已成为晚期卵巢癌的标准化疗方案。尽管在临床上紫杉醇显示了一定的疗效，但大多数患者最终还是死于复发和耐药，药物的毒副作用大于治疗作用，严重影响病人的生存质量。因此，治疗前药物敏感性预测，合理选择治疗方案将有利于提高疗效和生存质量，减少不必要的不良反应。随着基因组学的发展，临床治疗模式开始由过去的诊断导向治疗逐渐向基因导向性治疗的新模式转换，为从分子水平预测药物敏感性提供了新的理论依据。紫杉醇作为抗微管类药物，可使微管和微管蛋白二聚体之间失去动态平衡，诱导和促进微管蛋白聚合防止解聚，稳定微管，导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用。有研究表明，微管蛋白结合和微管动力的改变均能影响机体对紫杉醇的敏感性，从而影响疗效。Stathmin蛋白是微管辅助蛋白中最保守的可溶性蛋白。它具有解聚微管的作用，主要作用于微管蛋白、微管及纺锤体等对细胞分裂起关键作用的细胞器，通过调节微管系统的动力学平衡达到控制细胞周期的作用。它可以通过与微管蛋白二聚体结合和诱发突变促使微管不稳定，也可以通过改变其磷酸化状态来调节微管解聚的活性。Stathmin蛋白的磷酸化是细胞由G2期向M期转变，纺锤体形成的必要条件。Stathmin蛋白表达增加，微管的聚合减少，纺锤体无法形成；Stathmin蛋白表达表达减少时，微管聚合。除参与微管解聚功能外，许多研究表明Stathmin与肿瘤密切相关。Stathmin蛋白在许多恶性肿瘤中均有高表达。虽然目前没有直接证据表明其与恶性转变过程直接相关，但有实验证明高表达Stathmin蛋白的组织有更高的增殖活性，而且参与了肿瘤的浸润和转移。除此之外，Stathmin的高表达影响了微管结合类抗癌药物的敏感性。如Stathmin可以干扰紫杉醇与微管的结合，影响其疗效。荧光激活细胞分类和分裂指数计数实验发现过表达stathmin的细胞大多进入了G2期后不能进入M期，Stathmin蛋白通过改变紫杉醇与微管的结合和减少进入有丝分裂的细胞数降低了紫杉醇的细胞毒作用。紫杉醇耐药细胞株1A9/Ptx-10和1A9/Ptx-22中Stathmin的表达水平明显高于与母系1A9中的表达；人乳腺癌，高表达Stathmin蛋白的细胞对紫杉醇敏感性下降；抑制Stathmin蛋白表达能够增加癌细胞对紫杉醇的敏感性；Stathmin反义核酸与紫杉醇合用有协同抗肿瘤效应。本发明用SYBRGreenI荧光染料适时定量方法检测了76例卵巢上皮癌组织中Stathmin基因的表达，这些患者均进行了术后铂类加紫杉醇的辅助化疗。研究结果发现Stathmin表达高的患者疾病进展生存时间和总生存时间均比Stathmin表达低的患者短，死亡危险比是Stathmin表达低的患者的4.45倍，Stathmin基因表达的差异与紫杉醇疗效和卵巢癌预后密切相关。目前荧光实时定量PCR所使用的荧光化学方法主要有染料法(SYBRGreenI染料)和探针法。其中SYBRGreenI荧光染料定量PCR法不需要设计合成序列特异性探针，而且熔点曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析和识别扩增产物和引物二聚体，是一种简便，性价比较高的实时监测方法。
发明内容本实用新型的目的是为克服定量PCR探针法技术需要设计合成序列特异性探针，检测成本高的不足之处，采用SYBRGreenI染料定量PCR技术，提供一种紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒。本实用新型由盒体、衬垫，染料法(SYBRGreenI染料)PCR反应液、Taq酶、标准品、阴性对照、阳性对照组成，衬垫上设有容器孔，分别放置染料法(SYBRGreenI染料)PCR反应液、Taq酶、标准品、阴性对照、阳性对照。其中染料法(SYBRGreenI染料)PCR反应液的成份主要包含PCR缓冲液、SYBRGreenI染料、MgCl2、dNTPs、检测用引物。检测用引物有两对检测基因，Stathmin;管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。其中Stathmin引物Stathmin陽FAAATGGCTGCCAAACTGGAACGTStathmin-RGCTTCAGTCTCGTCAGCAGGGTCGAPDH引物GAPDH-FGAAGGTGAAGGTCGGAGTCGAPDH-RGAAGATGGTGATGGGATTTCStathmin标准品序列为aaatggctgccaaactggaacgtttgcgagagaaggataagcaicattgaagaagtgcggaagaacaaagaatccaaagaccctgctgacgagactgaagcGAPDH标准品序列为g犯ggtgaaggtcggagtc犯cggatttggtcgtattgggcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatgaccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggc幼attcc已tggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcaccatcttc对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无Stathmin表达的cDNA样本，阳性对照为有Stathmin表达的cDNA样本。本试剂盒保存于-4。C，尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法每次检测均应设立阳性和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为1X108—1X10'2拷贝/ml。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，总体积50ul，其中47.5ulPCR反应液，2.0ul检测样品(逆转录产物、标准品、阳性和阴性对照)，0.5ulTaqDNA聚合酶。反应条件50°C2分钟，95°CIO分钟，95°C15秒、60°C1分钟共40个循环，72。C10分钟。溶解曲线分析扩增产物确定无非特异性扩增，根据所获得的标准曲线，分别计算标本中Stathmin和GAPDH的量(拷贝/ul)。Stathmin与GAPDH的比值即为Stathmin表达指数。本实用新型提供的该试剂盒可在检测紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因中的应用，主要用于在化疗前通过检测肿瘤组织中tathmin表达的水平来预测患者对紫杉醇类抗癌药的敏感性，从而指导临床化疗方案的选择，有利于患者进行个体化治疗。本实用新型建立了利用SYBRGreenI荧光染料PCR技术检测Stathmin表达的方法，并经检测患者标本证实该方法切实可行。SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，检测灵敏度很高。但是，由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。本实用新型具有的特点是探针法和SYBRGreenI荧光染料法是实时定量PCR中的常用方法，本实用新型通过优化PCR的引物、SYBRGreenI荧光染料的浓度和PCR的条件，避免了SYBRGreenI荧光染料的缺陷，非特异性的扩增，通过溶解曲线分析该试剂盒不仅保持了PCR的高灵敏性，而且使得被检测基因的特异性大大提高。本实用新型与现有探针法相比较，设计合理，不需要设计荧光探针，使用方便而且成本低。图1为本实用新型试剂盒结构示意图。图2为GAPDH标准品(浓度为1X1012-1X108拷贝/ul)扩增曲线。图3为GAPDH标准曲线。图4为GAPDH标准品溶解曲线。图5为Stathmin标准品(浓度为1X1012-1X1()S拷贝/ul)扩增曲线。图6为Stathmin标准曲线。图7为Stathmin标准品溶解曲线。具体实施方式本发明结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例l参见图l，本实用新型试剂盒由盒体l、衬垫2，染料法(SYBRGreenI染料)PCR反应液3、Taq酶4、标准品5、阴性对照6、阳性对照7组成，衬垫2上设有容器孔，分别放置染料法(SYBRGreenI染料)PCR反应液3、Taq酶4、标准品5、阴性对照6、阳性对照7。其中染料法(SYBRGreenI染料)PCR反应液的成份主要包含PCR缓冲液、SYBRGreenI染料、MgCl2、dNTPs、检测用引物。检测用引物有两对检测基因，Stathmin;管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。其中Stathmin引物Stathmin-FAAATGGCTGCCAAACTGGAACGTStathmin-RGCTTCAGTCTCGTCAGCAGGGTCGAPDH弓1物GAPDH-FGAAGGTGAAGGTCGGAGTCGAPDH-RGAAGATGGTGATGGGATTTCStathmin标准品序列为atggctgccaaactggaacgtttgcgagaga鄉ataagcacattgaagaagtgcggaagaacaaagaatcc￡ia^gaccctgctgacgagactgaagcGAPDH标准品序列为gaaggtgaaggtcggagtcaacggatttggtcgtattgggcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatgaccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaaattcc已tggcaccgtcaaggctg已gaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcaccatcttc对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无Stathmin表达的cDNA样本，阳性对照为有Stathmin表达的cDNA样本。实施例2SYBRGreenI荧光染料PCR技术检测Stathmin表达及应用1.材料组织总RNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，逆转录试剂盒,SYBRGreenI荧光染料购于美国Invitrogen公司，pGEM-TEasy克隆系统,TaqDNA聚合酶购于美国Promega公司。7500型定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针设计与合成分别以Stathmin和GAPDH全长cDNA序列(GeneBank登录号分别为BC014353和NM-002046)为模板，在www.idtdna.com网上设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合。标准品PCR和检测用PCR引物序列相同，Stathmin-FAAATGGCTGCCAAACTGGAACGTStathmin-RGCTTCAGTCTCGTCAGCAGGGTCGAPDH-FGAAGGTGAAGGTCGGAGTCGAPDH-RGAAGATGGTGATGGGATTTC3.检测准备品制备取卵巢癌组织，用组织提取试剂盒提取总RNA，逆转录试剂盒逆转成cDNA,取0.5ulcDNA在普通PCR仪上扩增Stathmin和GAPDH基因片段，凝胶电泳分离纯化PCR产物，PCR产物插入pGEM-TEasy克隆系统,取阳性克隆，EcoRI酶切鉴定，Stathmin100bp,GAPDH226bp。测定浓度并换算成(拷贝数/ul)。4.标本检测76例经病理确诊的上皮性卵巢癌组织标本，患者均接受了减瘤术和术后铂类加紫杉醇的辅助化疗。标本用组织提取试剂盒提取总RNA，逆转录试剂盒逆转成cDNA。标本cDNA、标准品(1X108—1X1012拷贝/ul)、阳性和阴性对照各取2.0ul，总体积50ul，在荧光定量PCR仪ABI7500上分别进行Stathmin和GAPDH扩增。反应条件50°C2分钟，95°C10分钟，95°C15秒、60°Cl分钟共40个循环，72'C10分钟。溶解曲线分析扩增产物确定无非特异性扩7增，根据所获得的标准曲线，得出标本中Stathmin和GAPDH的量(拷贝/ul)。Stathmin与GAPDH的比值即为Stathmin表达指数。5.结果GAPDH标准品扩增结果参见图2。标准曲线见参图3，图中标准曲线的斜率为-3.19;相关系数为0.998。溶解曲线参见图4，图中溶解曲线表明GAPDH扩增无非特异性产物，特异性产物溶解温度为81.0。C。Stathmin标准品扩增结果参见图5。标准曲线参见图6，图中标准曲线的斜率为-3.40;相关系数为0.998。溶解曲线参见图7，图中溶解曲线表明Stathmin扩增无非特异性产物，特异性产物溶解温度为78.4°C。(1)76例患者组织检测结果如下:IDStathminQtyGADPHQtyratioAgeOverallDisfree41.04E+092.10E+0749.5264595962.37E+091.72E+100.1466434371.69E+092.07E+090.82489090201.16E+083.08E+080.38452525304.53E+073.21E+080,1461311.26E+101.13E+0911.15724839381.64E+101.50E+08109.3359317401.90E+092.12E+090.90462727523.46E+079,02E+063.8361119583.54E+101.01E+103.50603928639.61E+083.21E+082.99543030662.30E+099.67E+082.38571512744.66E+098.09E+090.58392828845.89E+082.30E+090.26665021851.90E+085.03E+073.78653232906.48E+083.30E+090.20695555949.06E+084.22E+082.15671411969.45E+081.57E+086.0249129987.5犯+087.77E+080.985749491022.49E+096.62E+090.385523231033.43E+074.16E+080.087323231046.28E+078.0犯+070.785027181141.45E+088.95E+071.625515151155.01E+092.55E+0819.657021121169.73E+081.66E+090.595323231171.01E+081.24E+080.814613131187,44E+076.30E+071.18582312<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2632.54E+103.27E+100.783527272664.29E+103.39E+101.277133142675.81E+101.64E+103.54731132707.86E+094.49E+110.02521515(2)Stathmin表达在卵巢癌中的临床意义研究结果发现表达高Stathmin表达的患者疾病进展生存时间和总生存时间均比Stathmin表达低的患者短，复发危险比与死亡危险比分别是Stathmin表达低的患者的3.92倍和4.45倍，结果参见表1。表1.Sta他min表达与患者预后分析<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒，由盒体(1)、衬垫(2)，染料法PCR反应液(3)、Taq酶(4)、标准品(5)、阴性对照(6)、阳性对照(7)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置染料法PCR反应液(3)、Taq酶(4)、标准品(5)、阴性对照(6)、阳性对照(7)。专利摘要一种紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因检测试剂盒，由盒体1、衬垫2，染料法(SYBRGreenI染料)PCR反应液3、Taq酶4、标准品5、阴性对照6、阳性对照7组成，衬垫2上设有容器孔，分别放置染料法(SYBRGreenI染料)PCR反应液3、Taq酶4、标准品5、阴性对照6、阳性对照7。本实用新型通过优化PCR的引物、SYBRGreenI荧光染料的浓度和PCR的条件，避免了SYBRGreenI荧光染料的缺陷，不仅保持了PCR的高灵敏性，而且使得被检测基因的特异性大大提高。本实用新型设计合理，提供的试剂盒可在检测紫杉醇类抗癌药敏感性相关基因中的应用，使用方便而且成本低。文档编号G01N21/00GK201107260SQ200720183950公开日2008年8月27日申请日期2007年9月30日优先权日2007年9月30日发明者丹苏,马胜林申请人:浙江省肿瘤医院