本发明涉及叶酸定量检测，液相色谱串联质谱联用检测人血清中叶酸及其代谢物的方法，血清叶酸检测成品试剂盒。
背景技术：
叶酸(FA)又名维生素M，维生素B9，属于维生素B族中的重要一种，其化学名为蝶酰谷氨酸，由对氨基苯甲酸，蝶啶，谷氨酸残基结合而成，天然叶酸主要以聚谷氨酸形式存在。人体自身不能直接合成叶酸，主要通过食物摄取，吸收的叶酸主要以四氢叶酸的形式储存在肝脏，也存在于肠壁、骨髓等其他组织中。叶酸通过还原型辅酶II(NADPH)，叶酸还原酶以及维生素C的作用下，还原成具有生理活性的四氢叶酸，随之代谢为其活性成分5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)等，通过血液被带到红细胞或其他细胞中参与DNA的合成。叶酸是人体细胞生长和分裂的必须物质，主要体现在其作为体内最主要的甲基供体，与其他辅酶协同参与DNA的合成和代谢，以及体内氨基酸、蛋白质、神经递质等的再甲基化。叶酸是机体细胞生长和繁殖所必需的物质，是进行DNA合成不可或缺的，是正常红细胞发育成熟所必需的，如果缺乏会导致骨髓中幼红细胞发育异常，会引发巨红细胞性贫血；也是神经管缺陷的其中一个重要影响因素；还与心血管疾病、痴呆症、认知缺陷等发生有关。
血清叶酸测定可以提供体内叶酸状态的早期指标，结合叶酸及其代谢物的检测可及时反应当前人体叶酸代谢情况。在人血清中，5-甲基四氢叶酸作为叶酸最主要的活性代谢物，其可占叶酸类物质的90％，同时检测血清中叶酸，5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸能较全面的反应当前人体叶酸状态。
叶酸类物质传统的临床检测主要有微生物测定法，同位素放射免疫法，离子捕获法，时间分辨荧光法、化学发光法等传统方法及相关试剂盒，但其问题主要如下：一、这些方法都为间接检测法，因此都不能排除基质效应和忽略了化合物不稳定性，且不同平台间的差异较大，容易造成不同平台结果的不一；二、该类方法没有分别准确检测多个指标，考察叶酸及具有活性的叶酸代谢物成分，从而不能更好去诠释叶酸在人体内的代谢情况，以及与身体健康状况之间的关系。另外，目前还有能够检测叶酸代谢相关基因的技术方法，但是该方法所检测的是相关基因位点，可以用作叶酸代谢能力的病因分析，但是不能用作临床鉴定病人叶酸是否缺乏。
因此，临床检测亟需一种不仅具备高灵敏度，高特异性，高准确度检测结果，还可同时检测叶酸及其代谢物质，并拥有操作简单方便，容易推广的叶酸直接检测方法及试剂盒，以祛除基质效应和化合物不稳定性对实验结果的影响，从而提高临床检测质量。
技术实现要素：
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本发明所要解决的问题是提供一种可以全面检测人体血清叶酸状态的试剂盒，并且能够有效祛除基质干扰，提高检测准确性，操作简便，可同时检测叶酸及其代谢物。
为解决上述问题，本发明公开了一种人体血清叶酸及其代谢物串联质谱检测试剂盒及其应用方法，其中：
一、试剂盒组成和配制方法如下：
1、校准品：使用2％～8％BSA稀释液，优选4％BSA稀释液(DTT、抗坏血酸和柠檬酸一水合物含量均为0.01％)，同时加入适量的叶酸(FA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)原料，配制成包括6个浓度剂量点的校准品，冻干后使用。优选的6个浓度剂量点校准品均按照(0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27.0ng/mL)设置，并且可溯源至WHO International Standard Vitamin B12，Serum Folate and Holo TC。
2、质控品：使用2％～8％BSA稀释液，优选4％BSA稀释液(DTT、抗坏血酸和柠檬酸一水合物含量均为0.01％)，同时加入适量叶酸(FA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)原料，配制成包括高、低2个浓度的质控品，冻干后使用。优选的2个浓度的质控品分别按照2.0ng/mL、10.0ng/mL设置。
3、内标准品：使用2％～8％BSA稀释液作为稀释液，优选2％BSA稀释液(DTT、抗坏血酸和柠檬酸一水合物含量均为0.01％)，同时将13C5叶酸和d3 5-甲基四氢叶酸稀释至终浓度为300ng/mL～600ng/mL，优选400ng/mL。
4、解离剂：1M DTT水溶液。
5、解离剂稀释液：0.1MPBS缓冲液。
6、流动相A：由甲酸与水配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％，优选0.1％。
7、流动相B：由甲酸与乙腈配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％，优选0.1％。
8、复溶液：由乙腈与水配制而成，乙腈的含量为0.5％～2％，优选1％。
9、96孔微孔板：使用耐腐蚀的聚丙乙烯材料的96孔微孔板；优选U型底的无包被的96 孔深孔微孔板作为反应板；V型底的无包被的96孔微孔板作为进样板。
10、操作说明书；
11、分隔并集中包装上述1～10的包装盒。
二、试剂盒使用方法如下：
1、准备工作液：通过以一定的比例稀释试剂盒中的校准品、质控品、内标准品、解离剂和解离稀释液，以满足样品处理所需；其中，将冻干的校准品和质控品用纯化水溶解成工作液；优选的，按照解离剂∶解离剂稀释液＝1∶4的比例配制成解离工作液，按照按内标准品∶乙腈＝1∶199配制成内标工作液。
2、样品前处理：优选的，取200μL的血清样品与50μL解离工作液于96孔深孔微孔板中混合，37℃温育5min；加入600μL内标准品工作液，离心分离上清700μL氮气室温彻底吹干，加入70μL复溶液至溶解完全。
3、移液：从每个板孔中将适量的溶液转移到96孔微孔板进样板孔内，优选50μL/孔。
4、色谱条件准备(设置)：优选的，Poroshell 120EC-C18(4.6*50mm)色谱柱，0.6mL/min(0.0～2min：流动相A：99％；3～4.5min：流动相A：99％→90％；4.5.5～6.0min：流动相A：90％→85％；6.0～6.1min：流动相A：85％→10％；6.1～8.5min：流动相A：10％；8.5～12min：流动相A：10％→99％)，40℃柱温。
5、质谱条件准备(设置)：优选的，ESI正离子MRM扫描模式，Q1/Q3离子通道分别选择为FA：442.2→295.2amu，FA-13C5：447.2→295.2amu；5-MTHF：460.3→313.3amu；5-MTHF-13C，d3：464.3→317.3amu和5-FTHF：474.3→327.3amu。
6、上机检测：将适量液体进入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析，优选20μL，并记录色谱图与检测样品中叶酸(FA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)的峰面积与内标峰面积。
7、结果分析：以6个校准品的标示浓度为横坐标(x)，实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线和计算曲线回归方程，将血清样品中相应物质的实际检测峰面积与内标峰面积的比值代入标准曲线回归方程，即可计算出样品中叶酸(FA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)的浓度。
本发明具有以下特点：
1.本试剂盒已经含有人体血清叶酸及其代谢物检测串联质谱法所需的主要配套试剂和耗材，并且简化了实验操作步骤，从而能使临床检测更加简便快捷，大大减少试剂耗材的单独购买和自行配制试剂带来的操作误差。
2.本试剂盒使用的检测方法为液相质谱串联质谱法，根据分析物固有的理化性质进行直接检测血清中的叶酸及其代谢物，能够消除临床血样的基质效应，并且能够准确的定量出各个分析物质在体内的情况。
3.本试剂盒使用液相色谱串联质谱仪进行检测，与背景技术介绍的传统检测方法相比，本试剂盒可同时分别准确定量检测出人体血清中叶酸，5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和5-甲酰四氢叶酸(5-FTHF)三种叶酸类物质，从而更加清楚的反映体内叶酸状态。
附图说明
图1.样品处理操作流程。
具体实施方式
本发明为一种人体血清叶酸及其代谢物串联质谱检测试剂盒，为临床检测提供了配套成熟的试剂盒以及所包含对应的操作方法。为了使本发明实施的上述目的、特征和有点能够更加清晰易懂，具体包括试剂盒组分和操作方法，具体如下：
实施例1：试剂盒组分
实施例2、试剂盒配套操作方法
1.试剂组分配制：
(1)校准品(A、B、C、D、E、F)和质控品(C1、C2)：室温条件下，准确量取1000μL纯化水至每瓶校准品或质控品中，至冻干粉完全溶解(不少于15分钟)，备用。
(2)内标准品：室温条件下，准确量取1000μL纯化水至1瓶内标中，至冻干粉完全溶解(不小于15分钟)，备用。本发明实施例中内标准品已包含13C5叶酸和d3 5-甲基四氢叶酸，为混合内标，无需单独配制。
(3)工作液
a)内标准品工作液：按内标准品∶流动相B液＝1∶199把内标储液稀释200倍；
b)解离工作液：按照解离液(5×)∶解离稀释液＝1∶4的比例配制。
2.检测样品处理：参见图1
a)样品解离：分别精密吸取200μL校准品、质控品、血清样品溶液于对应的1.5mL离心管中，然后准确各加入50μL解离工作液，涡旋2分钟后置于37℃温育5min；
b)混合内标：在步骤①各混合液中分别加入600μL内标准品工作液，充分涡旋2分钟，然后13000rpm离心15min；
c)氮气吹干：离心后各吸取700μL上清液至96孔深孔板，氮气室温彻底吹干；
d)复溶：然后各加入70μL样品复溶液，用封片封好，振荡孵育5分钟；
e)转移：复溶后各孔转移50μL至96孔锥型板，用封片封好上样板准备上机进样分析。
3.色谱条件：
a)色谱柱：Poroshell 120EC-C18(4.6*50mm)或相当者；
b)流动相：流动相A液，流动相B液；
c)流速：0.6mL/min；
d)梯度洗脱条件：
e)柱温：40℃；
f)进样量：20μL。
4.质谱条件：
a)离子源：电喷雾电离(ESI)；
b)扫描模式：正离子MRM扫描分析，Q1/Q3离子通道分别选择为FA：442.2→295.2amu，FA-13C5：447.2→295.2amu；5-MTHF：460.3→313.3amu；5-MTHF-13C，d3：464.3→317.3amu和5-FTHF：474.3→327.3amu。
c)本发明实施例的一个优选示例中，离子源参数如下：
离子源参数可根据实际仪器型号不同而有所不同。
a)本发明实施例的一个优选示例中，质谱参数如下：
质谱电压参数可根据实际仪器型号不同而有所不同。
5.样品检测：
选取处理好的校准品、质控品和血清样品各20μL注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析，并记录色谱图与检测样品中FA、5-MTHF和5-FTHF的峰面积与内标峰面积。
6.检测结果的计算：
(1)标准曲线的绘制方法：以6个校准品的标示浓度(FA：0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27ng/mL；5-MTHF：0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27ng/mL；5-FTHF：0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27ng/mL)为横坐标(x)，以6个校准品的实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。
(2)标准曲线方程的拟合：以6个校准品的峰面积比值(y)对标示浓度(x)进行线性回归。可获得回归方程：y＝a+bx，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为截距，b为斜率，并计算相关系数(r)，要求r不小于0.9900。
(3)血清样品结果的计算：将血清样品中叶酸的实际检测峰面积与内标峰面积的比值代入标准曲线方程，计算血清样品中叶酸及其代谢物的浓度。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的人和附图标记视为限制所涉及的权利要求。