基于MANF作为标记物的肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌鉴别产品及方法与流程

本发明涉及生物技术领域中基于MANF作为标记物的肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌鉴别产品及方法。

背景技术：

肝脏占位性病变可以是良性或恶性的肿瘤，恶性肿瘤可以是转移的或原发的。原发性肝癌(primary carcinoma of the liver)是我国常见恶性肿瘤之一。原发性肝癌主要类型为肝细胞肝癌(hepatocelluler carcinoma,HCC)和肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)。目前对于原发性肝癌手术后患者进行病理学诊断的原则主要根据手术切除肿瘤组织的组织学检查和患者临床检查等做出。由于肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌组织形态相近、免疫表型交叉，在临床病理诊断中常常出现困难；另一方面，两者的治疗方式和预后均不同，肝内胆管细胞癌发展更快，预后更差，需要更好地区别两类肿瘤，对患者进行针对性治疗，从而提高病人生活质量和减轻患者经济负担。

现有鉴别肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌的标记物有AFP/CA199/Hep Par1/CK19等，但是由于其敏感性和特异性不高，目前在临床诊疗中应用价值有限，往往难以解决病理诊断问题。

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是分泌性蛋白在细胞内进行折叠、修饰和组装的场所，这些加工过程是分泌性蛋白在分泌前进行功能成熟所必需的。在进化过程中，真核细胞形成了一个严格的质控系统，以确保内质网输出的蛋白具有正常的功能。而那些非折叠或错误折叠的多肽及没有组装好的蛋白将滞留在内质网，然后通过泛素-蛋白酶体通路被清除，这就是所谓的内质网相关的蛋白降解。一旦聚集在内质网的非折叠蛋白超过内质网的负荷能力，将会引起内质网平衡失调，从而导致内质网应激(ER stress)。最近研究发现，内质网应激与很多疾病密切相关，如神经退行性疾病、动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤及阮病毒病等。

中脑星形胶质细胞来源神经营养因子(Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic Factor,MANF)基因是沈玉先等通过微阵列技术从30000个基因中筛选出来的对内质网应激最显著的基因。该基因最初发现时被认为与肿瘤的发生有关，但后来的研究发现，MANF基因的这种突变属于正常基因的多态性，而非肿瘤所特有。但Petrova等在体外传代的大鼠中脑星形胶质细胞的培养液中分离得到了MANF，且MANF对多巴胺能神经元有选择性的促生长作用。重组人MANF可选择性地作用于体外培养的多巴胺能神经元，促进其存活，在低剂量时作用优于神经营养因子GDNF。研究发现MANF蛋白广泛存在于哺乳动物组织内，正常情况下组织细胞内MANF含量很低，当细胞遭受应激刺激时，细胞内MANF表达显著升高。MANF作为一种被内质网应激诱导表达的分泌性蛋白，它的水平增加可能是机体在遭受各种应激包括炎症刺激时所做出的一种防御机制，它的功能不仅仅局限于神经细胞，在内质网应激相关的生理和病理过程中可能具有更广泛的作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何有效地鉴别诊断肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌。

为了解决以上技术问题，本发明提供了检测MANF表达量的系统在制备鉴别或辅助鉴别肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者产品中的应用。

在上述应用中，所述检测MANF表达量的系统可包括通过免疫组织化学染色方法检测MANF表达量所需的试剂和/或仪器。

在上述应用中，所述通过免疫组织化学染色方法检测MANF表达量所需的试剂可包括针对MANF的抗体，还可包括免疫组织化学染色方法检测MANF表达量所需要的其它试剂。

在上述应用中，所述检测MANF表达量为检测原发性肝癌患者的肿瘤组织中的MANF表达量，所述鉴别或辅助鉴别肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者为鉴别原发性肝癌患者中的肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者。

以MANF作为标记物的系统在制备鉴别或辅助鉴别肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者产品中的应用也属于本发明的保护范围。

在上述应用中，所述鉴别或辅助鉴别肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者为鉴别原发性肝癌患者中的肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者。

本发明还提供了鉴别原发性肝癌患者中的肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者的方法。

本发明所提供的鉴别原发性肝癌患者中的肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者的方法，包括检测来自待诊断原发性肝癌患者的离体原发性肝癌肿瘤组织中的MANF表达量，根据所述MANF表达量诊断待诊断原发性肝癌患者是肝细胞肝癌患者还是肝内胆管细胞癌患者。

本发明中，所述产品可为系统，所述系统可包括试剂和/或仪器。所述MANF可为人MANF。

本发明通过将MANF作为标记物，通过检测MANF在原发性肝癌肿瘤组织中的表达水平，鉴别肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌，建立有效的鉴别肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌的手段和指标，其灵敏度为92.5％，特异度为74.7％，为进行针对性合理治疗，改善患者的预后，从而提高患者生活质量和减轻患者经济负担奠定了基础。

附图说明

图1是鉴别原发性肝癌患者中的肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、鉴别原发性肝癌患者中的肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者

如图1所示，鉴别原发性肝癌患者中的肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌患者的具体方法如下：

步骤S1，分别收集中国某医院近年来临床和病理资料齐全的230例原发性肝癌患者的原发性肝癌肿瘤组织石蜡标本，其中，150例为肝细胞肝癌肿瘤组织石蜡标本，80例为肝内胆管细胞癌肿瘤组织石蜡标本。

其中，原发性肝癌、肝细胞肝癌、肝内胆管细胞癌的诊断均结合临床、组织病理学和免疫组织化学染色等进行的综合诊断。

步骤S2，对石蜡标本进行4μm厚连续切片，对切片采用HE染色，便于全面观察其组织构造；

步骤S3，采用免疫组织化学法检测肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌肿瘤组织中MANF的蛋白表达，其具体步骤如下：

步骤S301，将石蜡切片放入60℃恒温烤箱，烘烤时间为2小时以上；

步骤S302，将切片脱蜡与水化：将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；置于无水乙醇中浸泡5分钟；置入95％乙醇中浸泡5分钟；置入70％乙醇中浸泡5分钟；置入蒸馏水中浸泡5分钟；

步骤S303，采用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复法进行抗原修复：将脱蜡水化的组织切片置于耐高温切片架上，同时将pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液在高压锅中加热至沸腾，再将切片架放入已沸腾的缓冲液中，关闭高压锅直至开始喷气时，盖上压力阀，2分钟后，将高压锅置入凉水中冷却直至室温，将切片取出；

步骤S304，用PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)冲洗3次，每次冲洗5分钟；

步骤S305，切片分别滴加50μl的MANF一抗试剂(将MANF抗血清用PBS缓冲液pH 7.2-7.4稀释100倍，得到MANF一抗试剂)，置于4℃环境下过夜；

步骤S306，次日复温30分钟后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；

步骤S307，滴加二抗试剂，二抗试剂采用快捷型酶标羊抗鼠IgG聚合物(福州迈新生物技术开发有限公司KIT-5002)，在37℃环境下孵育20分钟；

步骤S308，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；

步骤S309，每张切片滴加50μl DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色；

步骤S310，置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝；

步骤S311，将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片；

步骤S4，使用显微镜观察经过免疫组织化学法检测的患者肿瘤组织切片，MANF蛋白定位于细胞质,呈黄色或棕黄色颗粒状，MANF染色结果的评分根据光学显微镜下观察阳性细胞比例及阳性着色强度综合进行半定量分析。MANF染色结果的评分体现MANF的表达量。其中，每张切片的阳性细胞数按无着色、阳性细胞数小于1/3、1/3-2/3和大于2/3分别判为0、1、2、3分，每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、黄色、棕黄色和棕褐色分别判为0、1、2、3分，根据每张切片的阳性细胞数和每张切片阳性细胞的着色强度这两项积分之和(MANF染色结果的评分)判断其结果，两项积分之和≥3分为MANF表达呈阳性，两项积分之和<3分为MANF表达呈阴性。若患者肿瘤组织中MANF表达呈阳性，则提示患者的原发性肝癌肿瘤为肝内胆管细胞癌，若患者肿瘤组织中MANF表达呈阴性，则提示患者的原发性肝癌肿瘤为肝细胞肝癌。

80例肝内胆管细胞癌肿瘤组织石蜡标本的检测结果如表1，150例肝细胞肝癌肿瘤组织石蜡标本的检测结果如表2。

表1.80例肝内胆管细胞癌肿瘤组织石蜡标本的检测结果

表2.150例肝细胞肝癌肿瘤组织石蜡标本的检测结果

按照该标准，80例肝内胆管细胞癌石蜡标本中，有74例为阳性，即在80例肝内胆管细胞癌患者中鉴别出74例肝内胆管细胞癌患者，灵敏度(真阳性率)为74/80×100％＝92.5％；在150例肝细胞肝癌石蜡标本中，有112例为阴性，即在150例肝细胞肝癌患者中鉴别出112例肝细胞肝癌患者，特异度(真阴性率)为112/150×100％＝74.7％。说明MANF可成为鉴别肝细胞肝癌患者和肝内胆管细胞癌有效的标记物。

其中，上述MANF抗血清是以重组人MANF蛋白为免疫原免疫大鼠得到的抗血清。重组人MANF蛋白按照如下方法表达纯化得到：

用SEQ ID No.1所示的人MANF蛋白的cDNA序列替换pET28a(+)的限制性内切酶NcoI和XhoI识别位点间的DNA序列，得到表达SEQ ID No.2所示的重组人MANF蛋白的重组表达载体pET28a(+)-MANF。将pET28a(+)-MANF质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，置37℃培养箱过夜，以体积比1:100的比例，接种于新鲜的含卡那霉素的LB培养基中扩大培养，37℃振荡培养至菌液A₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG诱导表达2-4小时。SDS-PAGE电泳结果显示，经IPTG诱导后，在转化了pET28a-MANF的细菌表达的蛋白中有一明显的条带，蛋白分子量的大小与预期的相符(20.2kDa)。说明IPTG诱导表达的蛋白是目的蛋白重组人MANF蛋白。收集菌体并裂解，取上清，加入到已预装好的Ni-beads柱中，用含50mmoL/L咪唑的缓冲液洗去非特异结合的蛋白，再用洗脱缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄pH 8.0、300mmol/L NaCl、250mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白，并将洗脱的蛋白分装保存在－80℃冰箱。重组人MANF蛋白经Ni-beads柱纯化后的纯度及表达量，经Bandscan软件分析，纯度为95％。超滤浓缩后用BCA法进行蛋白定量，-80℃冻存备用。

<110> 安徽医科大学

<120> 基于MANF作为标记物的肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌鉴别产品及方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 474

<212> DNA

<213> 人属人（Homo sapiens）

<400> 1

ctgcggccgg gcgactgcga agtttgtatt tcttatctgg gaagatttta ccaggacctc 60

aaagacagag atgtcacatt ctcaccagcc actattgaaa acgaacttat aaagttctgc 120

cgggaagcaa gaggcaaaga gaatcggttg tgctactata tcggggccac agatgatgca 180

gccaccaaaa tcatcaatga ggtatcaaag cctctggccc accacatccc tgtggagaag 240

atctgtgaga agcttaagaa gaaggacagc cagatatgtg agcttaagta tgacaagcag 300

atcgacctga gcacagtgga cctgaagaag ctccgagtta aagagctgaa gaagattctg 360

gatgactggg gggagacatg caaaggctgt gcagaaaagt ctgactacat ccggaagata 420

aatgaactga tgcctaaata tgcccccaag gcagccagtg cacggaccga tttg 474

<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213>人属人（Homo sapiens）

<400> 2

Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe

1 5 10 15

Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile

20 25 30

Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn

35 40 45

Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile

50 55 60

Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu Ala His His Ile Pro Val Glu Lys

65 70 75 80

Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys

85 90 95

Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg

100 105 110

Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys

115 120 125

Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met

130 135 140

Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu

145 150 155