氧化铁‑介孔碳纳米复合材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种适体传感器，特别涉及一种氧化铁-介孔碳(fe3o4@c)纳米复合材料及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术：

现在大量的自然生成的抗生素经常被用于治疗生病的动物、促进动物的生长。其中，土霉素(otc)作为一种使用频率很高的抗生素，被广泛应用于治疗农业和水产养殖动物的传染性疾病。然而，由于其较低的生物利用度，只有一部分otc可以在动物身体中代谢吸收，残留的otc将被排泄并释放到土壤、地表水和地下水中，这导致严重的环境问题和潜在的人类健康风险。因此，为了使人类免受残留药物的危害，世界卫生组织、欧盟和中国农业部规定土霉素在牛奶中的最大残留限量为0.1mg·kg^-1。迄今为止，对残留土霉素的痕量检测吸引了很多人的注意。传统的检测土霉素的方法有液相色谱、电泳、酶联免疫吸附法和高效液相色谱法。即使这些传统的方法可靠、灵敏和稳定，但是它们的应用因为一些缺陷如：昂贵的设施、高成本和样品准备时间长而受到限制。为了满足经济快速发展和食品安全保障的要求，迫切需要制定新的传感策略，为食品安全领域的otc残留提供简单、灵敏度高、便捷的检测工具。

最近，因为与适配体的靶向结合位点互补的寡核苷酸的顺序可以设计，适体基生物传感器检测小分子靶标(适体传感器)越来越引起关注。与抗体生物传感器相比，适体传感器具有更高的亲和力、合成方法简单、方便标记和更好的稳定性等优点。适体传感器综合了电化学技术的优点和适体传感器的卓越的性能，所以它的发展引起很多人的兴趣。为了寻求更好地固定平台，已经探索不同修饰电极的材料包括碳纳米材料、金属纳米粒子、导电聚合物等等，用于提高装载量以及探针分子的生物活性。

近年来，作为一个新兴的纳米多孔材料，金属有机框架材料(mofs)由有机配体连接金属节点合成，由于其具有独特的性能，例如高表面积，以及结构和功能的可调性，已经显示出很好的应用前景。而以mofs为模板制备的相关纳米材料已经广泛应用于超级电容器，电极材料和催化剂。在这些mofs材料中，fe基mofs(fe-mofs)表现出卓越的化学稳定性，因为它们的毒性低且含量丰富，最重要的是它们的路易斯强酸性，这使它可以与羧酸盐更好地配位，使骨架更稳定。此外，fe-mofs用作电极材料时具有优异的生物相容性和氧化还原活性。然而，在实际应用中fe-mofs的导电性差从而导致循环性能差。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种氧化铁-介孔碳纳米复合材料及其制备方法和应用，以克服现有技术的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明提供了一种氧化铁-介孔碳纳米复合材料，包括多孔碳基质以及至少均匀分布于所述多孔碳基质内的复数个fe3o4纳米颗粒。

进一步的，所述多孔碳基质为多孔碳纳米片，并且至少所述多孔碳纳米片内嵌入有复数个fe3o4纳米颗粒；

优选的，所述多孔碳纳米片的表面也分布有fe3o4纳米颗粒；

优选的，所述fe3o4纳米颗粒的粒径为8-70nm，优选为40-70nm，尤其优选为60-70nm；

优选的，所述多孔碳基质所含孔洞的孔径为18.5-29.7nm；

优选的，所述多孔碳基质为无定型碳基质；

优选的，所述多孔碳纳米片的厚度为3-8nm，所述多孔碳纳米片的孔径为18.5-29.7nm；

优选的，所述多孔碳基质与所述fe3o4颗粒的质量比为10.64∶1-26.08∶1；

优选的，所述氧化铁-介孔碳纳米复合材料的比表面积为27.24-315.12m².g^-1。

本发明还提供了一种氧化铁-介孔碳纳米复合材料的制备方法，包括：

提供fe-mofs，

以及，将fe-mofs于350-900℃温度下煅烧4-6h，然后冷却至室温，获得氧化铁-介孔碳纳米复合材料。

进一步的，所述方法包括：将fe-mofs以5-7℃·min^-1的升温速率加热至350-900℃，并保温煅烧4-6h，然后自然冷却至室温，获得氧化铁-介孔碳纳米复合材料。

进一步的，所述方法包括：将feso4·7h2o，4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，n-甲基甲酰胺(nmf)和n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)混合后，于140-160℃加热3-5d，制得所述fe-mofs；

优选的，所述h3ntb与feso4·7h2o的摩尔比为(1-3)∶(8-10)；

优选的，所述nmf与nmp的体积比为(1-3)∶(1-3)。

本发明还提供了一种土霉素电化学适体传感器，包括：

所述氧化铁-介孔碳纳米复合材料；

修饰于所述氧化铁-介孔碳纳米复合材料上的土霉素适体链。

进一步的，所述土霉素电化学适体传感器还包括：电极基体，所述fe3o4@c纳米复合材料固定于所述电极基体表面；

优选的，所述电极基体包括金电极；

优选的，所述土霉素适体链的序列为：5‘-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3’。

本发明还提供了一种土霉素电化学适体传感器的制备方法，包括：

采用前述的方法制备氧化铁-介孔碳纳米复合材料；

将所述氧化铁-介孔碳纳米复合材料分散于溶剂形成均匀悬浮液，将所述均匀悬浮液施加于电极基体上并干燥；

以土霉素适体链的溶液浸润固定于所述电极基体上的氧化铁-介孔碳纳米复合材料，使土霉素适体链修饰于氧化铁-介孔碳纳米复合材料上，形成所述电化学适体传感器。

本发明另一方面还提供了一种土霉素的检测方法，包括：

提供所述土霉素电化学适体传感器；

将所述土霉素电化学适体传感器浸渍于可能含有土霉素的待测液体样品中，之后以所述土霉素电化学适体传感器作为工作电极进行电化学测试，实现对待测液体样品中土霉素的检测。

进一步的，所述电化学测试方法包括电化学阻抗谱或循环伏安法。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

本发明提供的fe3o4@c纳米复合材料的纳米结构具有低毒性、高稳定性和电化学活性；

本发明提供的基于fe3o4@c纳米复合材料的适体传感器制备方法简单，检测流程简单；并且所述适体传感器的比表面积高、生物亲和力强、检测灵敏度高、检测限低，可用于快速、精确地检测otc。

附图说明

图1a是本发明实施例1中fe-mofs的ntb配体的配位模式结构示意图；

图1b是本发明实施例1中fe-mofs的1-d棒状阵列的视图；

图1c是本发明实施例1中fe-mofs的3-d框架结构示意图；

图2是本发明实施例1中fe-mofs的晶体结构数据示意图；

图3a、图3b、图3c分别是本发明实施例2中fe-mofs、fe3o4@c纳米复合材料的xrd与tga图；

图4a1、图4a2、图4b1、图4b2、图4c1、图4c2、图4d1、图4d2、图4e1、图4e2分别是本发明实施例2中fe-mofs、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900纳米复合材料的xps分解谱；

图5是本发明实施例2中fe-mofs、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900复合材料的xps全谱图；

图6a、图6b是本发明实施例2中fe-mofs在3000倍和1800倍的sem图，图c、图d是tem图；

图7a、图7b、图7c、图7d、图7e、图7f、图7g、图7h分别是本发明实施例2中fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的纳米复合材料的低倍和高倍tem图像，插图是相应的saed图；

图8是本发明实施例2中fe-mofs和不同fe3o4@c纳米复合材料的氮气吸附-解吸附等温线；

图9a中的cv曲线和图9b中的eis曲线是本发明实施例2中使用基于fe-mof开发的适体传感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-的溶液中检测otc；

图10a1、图10b1、图10c1、图10d1、图10a2、图10b2、图10c2、图10d2分别是本发明实施例2中使用基于fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900开发的适体传感器在含有0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-的溶液中检测otc的cv和eis曲线图；

图11是本发明实施例2中使用基于fe-mof、fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900开发的适体传感器检测otc的每个阶段的δrct值；

图12a是本发明实施例2中apt/fe3o4@c900/ae检测不同浓度的otc(0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1ng·ml^-1)的eis响应曲线；

图12b是本发明实施例2中δrct与otc浓度的曲线，其中插图为校准曲线的线性部分；

图13a、图13b分别是本发明实施例2中用于检测otc的fe3o4@c900基适体传感器的选择性和重现性图谱；

图14a、图14b分别是本发明实施例2中用于检测浓度为0.005ng·ml^-1的otc的fe3o4@c900基适体传感器的的稳定性和再生性图谱。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明实施例提供了一种氧化铁-介孔碳纳米复合材料，包括多孔碳基质以及至少均匀分布于所述多孔碳基质内的复数个fe3o4纳米颗粒。

进一步的，所述多孔碳基质为多孔碳纳米片，并且至少所述多孔碳纳米片内嵌入有复数个fe3o4纳米颗粒；

优选的，所述多孔碳纳米片的表面也分布有fe3o4纳米颗粒；

优选的，所述fe3o4纳米颗粒的粒径为8-70nm，优选为40-70nm，尤其优选为60-70nm；

优选的，所述多孔碳基质所含孔洞的孔径为18.5-29.7nm；

优选的，所述多孔碳基质为无定型碳基质；

优选的，所述多孔碳纳米片的厚度为3-8nm，所述多孔碳纳米片的孔径为18.5-29.7nm；

优选的，所述多孔碳基质与所述fe3o4颗粒的质量比为10.64∶1-26.08∶1；

优选的，所述氧化铁-介孔碳纳米复合材料的比表面积为27.24-315.12m²·g^-1。

本发明还提供了一种氧化铁-介孔碳纳米复合材料的制备方法，包括：

提供fe-mofs，

以及，将fe-mofs于350-900℃温度下煅烧4-6h，然后冷却至室温，获得氧化铁-介孔碳纳米复合材料。

进一步的，所述方法包括：将fe-mofs以5-7℃·min^-1的升温速率加热至350-900℃，并保温煅烧4-6h，然后自然冷却至室温，获得氧化铁-介孔碳纳米复合材料。

进一步的，所述方法包括：将feso4·7h2o，4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，n-甲基甲酰胺(nmf)和n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)混合后，于140-160℃加热3-5d，制得所述fe-mofs；

优选的，所述h3ntb与feso4·7h2o的摩尔比为(1-3)∶(8-10)；

优选的，所述nmf与nmp的体积比为(1-3)∶(1-3)。

本发明还提供了一种土霉素电化学适体传感器，包括：

所述氧化铁-介孔碳纳米复合材料；

修饰于所述氧化铁-介孔碳纳米复合材料上的土霉素适体链。

进一步的，所述土霉素电化学适体传感器还包括：电极基体，所述fe3o4@c纳米复合材料固定于所述电极基体表面；

优选的，所述电极基体包括金电极；

优选的，所述土霉素适体链的序列为：5‘-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3’。

本发明还提供了一种土霉素电化学适体传感器的制备方法，包括：

采用前述的方法制备氧化铁-介孔碳纳米复合材料；

将所述氧化铁-介孔碳纳米复合材料分散于溶剂形成均匀悬浮液，将所述均匀悬浮液施加于电极基体上并干燥；

以土霉素适体链的溶液浸润固定于所述电极基体上的氧化铁-介孔碳纳米复合材料，使土霉素适体链修饰于氧化铁-介孔碳纳米复合材料上，形成所述电化学适体传感器。

本发明另一方面还提供了一种土霉素的检测方法，包括：

提供所述土霉素电化学适体传感器；

将所述土霉素电化学适体传感器浸渍于可能含有土霉素的待测液体样品中，之后以所述土霉素电化学适体传感器作为工作电极进行电化学测试，实现对待测液体样品中土霉素的检测。

进一步的，所述电化学测试方法包括电化学阻抗谱或循环伏安法。

如下将结合具体实施例对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明如下实施例中采用的fe(no3)3·9h2o，4，4′，4″-亚硝基二苯甲酸(h3ntb)，n-甲基吡咯烷酮(nmp)和甲酸可以从上海晶纯生化科技股份有限公司购买；土霉素(otc)、四环素、强力霉素和金霉素可以从索莱宝公司购买。如下实施例中采用的水均是超纯水(18.2ωcm^-1)。所有试剂均为分析纯级别。本发明实施例中采用的otc适体序列是：5‘-cgtacggaattcgctagccgaggcacagtcgctggtgcctacctggttgccgttgtgtggatccgagctccacgtg-3’。因为适体是具有独特3d结构的功能性ssdna或rna，可以以高特异性和亲和力识别并结合其同源靶标，这些功能链主要针对目标检测。

如下实施例中采用的表征设备及方式如下：

在perkin-elmer240chn元素分析仪上进行c，h和n的分析，使用nicolet850光谱仪(thermoelectroncorporation，massachusetts，usa)通过傅里叶变换红外光谱(ftir)分析纳米复合材料的化学结构；使用cukα辐射在rigakud/max-2500x射线衍射仪上记录x射线衍射测量(xrd)；用labsysnetzschtg209setaram仪器在n2气氛中加热速率为10℃·min^-1时测量热重(tga)；使用axishis165光谱仪(kratosanalytical，manchester，uk)采用单色铬化alkαx射线源(1486.71ev光子)测量x射线光电子能谱(xps)；采用日本jeoljem-2100高分辨透射电子显微镜测试高分辨率透射电子显微镜图像(hr-tem)，在超高度真空下，在带有隔膜和涡轮泵系统的belsorpmax体积吸附设备上，测量n2吸附-脱附数据。

x射线单晶分析：用安装石墨单色mokα或cukα(λ＝0.71073或)安捷伦科技公司的supernova单晶晶体计在不同温度下测量数据，用shelxs(直接方法)解析结构，并在olex2包中用shelxl(全矩阵最小二乘法)进行修正。所有非氢原子都用各向异性位移参数重新定义，将连接到碳上的氢原子置于几何理想的位置，并使用模型进行修复；由于框架中的溶剂分子性质高度无序，不能直接确定，因此采用platon软件中的squeeze程序进行处理。晶体数据、tga和元素分析的组合可以确定化学式，c372h493na31n66o164的晶体数据(m＝5973.07g.mol^-1)：立方体，空间群f-43c(编号219)，a＝48.1642(8)，v＝111731(5)z＝8，t＝293(2)k，μ(cukα)＝0.640mm-1，dcalc＝0.710g·cm-3，15687测量的反射(6.356°≤2θ≤144.072°)，7387独特(rint＝0.0604，rsigma＝0.0594)，最终的r1为0.0954(i＞2σ(i))，wr2为0.2877。

如下实施例中涉及的电化学测量方案，包括电化学阻抗谱(eis)和循环伏安法(cv)可以采用chi660d电化学工作站(上海辰华)测量。测试使用常规的三电极系统，其中包括作为工作电极的直径为3mm的金电极，作为参比电极的ag/agcl(饱和kcl)电极和作为对电极的铂片；在含有0.1mkcl的0.5mm[fe(cn)6]^3-/4-(eis参数：电位：0.21v；频率范围：100khz至0.1hz；振幅：5mv)中测得eis曲线；使用zview2软件分析谱图，使用非线性最小二乘拟合来确定等效电路中的元件参数。

实施例1：

通过混合0.242gkh2po4，1.445gna2hpo4·12h2o，0.200gkcl和8.003gnacl，并加入0.1mhcl溶液调节混合物的ph＝7.4，获得磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph7.4)。用pbs配制适体和otc溶液，通过将1.650gk3fe(cn)6和2.111gk4fe(cn)6溶于1lpbs中即可制备电解质溶液。

在特氟隆衬里的不锈钢容器中加入22.2mg的feso4·7h2o，3.0mg的4，4′4″-三甲酸三苯胺(h3ntb)，2ml的n-甲基甲酰胺(nmf)和2ml的n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)的混合物，在160℃的烘箱中下加热3d。用dmf洗涤之后得到棕色片状晶体，即为fe-mofs。产率：45％，基于h3ntb配体。ir(kbr，cm^-1)：3414w(br)，1682m，1654m，1592vs，1555m，1505m，1398vs，1354m，1318m，1266m，1173m，1102w，1013w，840w，784m，713w，671w，629w，583w，532w，513w，436w；元素分析(计算值)：c56h50fe3n6o16：c，51.6(52.5)；h，4.43(5.05)；n，7.40(6.93)，所述fe-mofs的晶体结构数据如图1、2所示。

将所制备的fe-mofs置于管式炉中并以5℃·min^-1～7℃.min^-1的升温速率升至350℃、550℃、700℃和900℃，分别在350℃、550℃、700℃和900℃煅烧4h～6h；然后将样品自然冷却至室温，获得一系列氧化铁-介孔碳纳米复合材料，其可以被分别命名为：fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900。

fe-mofs和fe3o4@c纳米复合材料的化学结构和组分分析：

采用xps测量fe-mofs和fe3o4@c纳米复合材料的化学成分和所处环境。五个样品的xps光谱都表明它们有与c、o和fe相关的特征峰以及较弱的n峰；c1s和o1s的特征峰来自于有机配体，fe2p的峰源自于配位中心fe。图3a、3b、3c分别是fe-mofs和fe3o4@c纳米复合材料的xrd和tga图；

表1为各个原子的百分含量，从表1中可以看出对于在不同温度下fe-mofs热解后的材料，例如fe3o4@c350，c1s含量首先降低到一定程度，这是由于含碳有机溶剂(nmf)的挥发和甲酸的分解。随着煅烧温度升高到550℃、700℃和900℃，c1s含量不断增加，表明有机连接体配体热分解产生多孔碳。对于fe2p和o1s含量，fe3o4@c350首先增加到一定程度，然后随着煅烧温度的升高而连续下降，变化趋势与c1s含量相反。

表1fe-mofs和热裂解后不同fe3o4@c纳米复合材料的原子百分比

为了进一步了解热分解前后fe-mofs和fe3o4@c纳米复合材料的化学成分c1s和fe2p，还分析了它们的xps图(如图4(a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1、d2、e1、e2)所示)。原始的fe-mofs(图4a1)的c1s分解谱可以分为5个主峰，在～283.7、～284.8、～285.6和～287.9ev，分别对应c-c/c-h、c-n、c-o、coo^-和π-π*的基团，这些峰都源自于有机连接配体。至于在不同温度下热裂解的材料，例如fe3o4@c350(图4b1)，在c1s高分辨率xps光谱中有与c＝o基团对应的～286.8ev附加峰；对于fe3o4@c550和fe3o4@c700(图4c1和d1)，c1s高分辨率xps光谱中的结合能的位置与fe-mofs的结合能一致，但强度是不同的，至于fe3o4@c900，在c1s高分辨率xps光谱(图4e1)中也观察到分配给c＝o基团的～286.8ev处的附加峰。

从五个样品(图4a2，图4b2，图4c2，图4d2和图4e2)的fe2p核心光谱可以观察到明显的差异。原始的fe-mofs(图4a2)的fe2p光谱中的～711.1和～724.9ev，分别对应于fe2p3/2和fe2p1/2。fe-mofs热解后，fe3o4@c350(图4b2)的fe2p光谱有～711.0和～724.8ev两个峰，与fe-mofs一致。随着煅烧温度的升高，fe3o4@c550(图4c2)的fe2p光谱分为5个峰，分别为～709.3、～711.4、～717.7、～722.3和～724.1ev，结合能为711.4和724.1ev的峰是fe³⁺的特征峰，而结合能为709.3和722.3ev的峰值是由于fe²⁺。此外，结合能为717.7ev的峰是由于fe²⁺和fe³⁺共同作用产生的伴峰。当温度升至700℃和900℃时，fe3o4@c700和fe3o4@c900的fe2p光谱观察到类似的情况(图4d2和图4e2)；fe³⁺、fe²⁺的特征峰和伴峰的结合能分别位于712.5、725.3、710.0、723.0、717.5ev和711.3、724.0、709.2、722.1、717.6ev，样品中fe²⁺和fe³⁺的存在进一步证实了fe3o4的形成。

图6为fe-mofs的sem和tem图像，从图像中可以看出，fe-mofs是块状结构，大多数晶体超过几十甚至几百微米，尺寸不均匀分布，说明制备的fe-mofs更像多晶或粉末材料；fe-mofs的不连续性导致它们的导电性差，因此电化学活性不好。如图7所示，从tem图中可以看出在不同热解温度下的fe3o4@c纳米复合材料的形态变化；在第一个温度350℃下，保留了fe-mofs的块状形貌，在复合材料的边缘可以观察到fe2o3，如图7a和图7b所示大部分fe3o4@c350纳米复合材料有均匀分布的球状结构，所述球状结构为fe3o4纳米颗粒，平均尺寸约为8-10nm。此外，所选区域电子衍射(saed，图7b，插图)中的电子衍射图是几个晶格组成的同心圆形，表明fe3o4@c350纳米复合材料是多晶，并且0.247和0.283nm的晶格空间为对应于(311)和(220)晶面，证明了fe3o4@c的形成。

如图7c和图7d所示，在第二阶段(550℃)中，发现更大的球形颗粒形成并嵌入到多孔碳纳米片中，而大多数颗粒团聚得到尺寸在100-150nm之间的纳米球(所述纳米球为fe3o4颗粒形成的团聚体)。这可能是因为有机残余物作为还原剂使fe2o3转化为fe3o4，并且在制备用于tem的样品时可能分散的不完全。此外，如图7d，插图中的saed图案显示了fe2o3和fe3o4的晶格，其中所述fe3o4纳米颗粒呈现为单分散状态。如图7e图，图7f，图7g和图7h所示，当煅烧温度进一步提高至700℃和900℃，由于晶体聚集会引起的氧化铁颗粒增大。如图7e和7f所示，从700℃下煅烧的fe-mofs的tem图像可以看出纳米复合材料是复合结构，从中可以看到平均直径为40nm的由薄碳边界单独包裹的fe3o4纳米颗粒，并且这些颗粒分散在多孔碳的基质内部和/或表面，如图7g和图7h所示，在fe3o4@c900纳米复合材料中观察到类似的情况，fe3o4颗粒的平均尺寸(粒径)增加到60-70nm，多孔碳作为fe3o4颗粒聚集的缓冲区使晶体分布的更均匀，图7f和7h中的插图saed说明已经形成典型的fe3o4晶格，进一步证明了fe3o4的形成。

fe-mofs和不同fe3o4@c纳米复合材料的n2吸附-脱附等温线如图8所示，fe-mofs和煅烧产物的比表面积分别为846.19，27.24，119.45，315.12和258.03m².g^-1。

实施例2：

将适体在90℃下孵育5min，然后缓慢冷却至室温，将实施例1所制备的fe3o4@c350粉末(0.5mg)加入到乙醇中并彻底超声直至获得均匀的fe3o4@c350悬浮液；然后，将10μl的fe3o4@c350悬浮液(0.5mg·ml^-1)铺展到金电极(ae)的表面上，然后在室温下干燥5h；随后，将修饰的电极浸入适体溶液(100nm)中2h，保证适体链固定在电极表面上直至达到饱和状态；在该过程中，适体与fe3o4@c纳米复合材料通过适体链与靶特异性部分形成酰胺键结合，这将导致氧化还原探针对修饰的ae的表面接近程度降低，因此电化学活性将减小。最后，将适体固定的fe3o4@c350/ae浸入otc溶液中进行电化学测试。在电化学检测中，配体可以形成与otc具有高亲和力的g-四链体结构。

为了比较，也以相同的方式构筑基于前述fe-mofs、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的适体传感器作为对比。

之后将空白ae、基于前述fe-mofs的适体传感器、基于前述各氧化铁-介孔碳纳米复合材料的适体传感器在含有一定浓度otc、0.14mnacl和0.1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-的溶液中检测otc，其中采用的电化学检测方法是cv和eis。

如图9a中的cv曲线所示，空白ae图中有一对明确的可逆氧化还原峰，峰间电位差(δep)为248mv。ae经fe-mofs改性后(fe-mof/ae)，δep增加到292mv，氧化还原峰电流相应降低，说明fe-mofs涂在ae上后导电率降低。当otc靶向适体链(apt)固定在fe-mof/ae表面时(apt/fe-mof/ae)，δep稍微升高到311mv，氧化还原峰电流几乎不变，表明apt对于fe-mof/ae的影响不明显。然而，当使用制备的apt/fe-mof/ae检测otc时(otc/apt/fe-mof/ae)，δep进一步增加到369mv，氧化还原峰电流进一步降低，证明了otc/apt/fe-mof/ae的导电性和电化学性降低。从图9b中的eis图中可以得出检测otc的不同阶段的四种aes的电荷转移电阻(rct)分别为141.2、366.6、427.5和478.1ω，表明在空白ae上固定有fe-mofs，apt和otc之后电化学活性降低依次，rct结果的变化趋势与上述cv结果一致。

采用同样的方式测试基于前述fe3o4@c350、fe3o4@c550、fe3o4@c700和fe3o4@c900的适体传感器的cv曲线，结果如图10a1、10b1、10c1、10d1所示。其中，基于fe3o4@c350的传感器(apt/fe3o4@c350/ae)的四个aes的δep分别为271、301、354和399mv；基于fe3o4@c550的传感器(apt/fe3o4@c550/ae)的四个aes的δep分别为256、305、402和463mv；基于fe3o4@c700的传感器(apt/fe3o4@c700/ae)的四个aes的δep分别为243、354、433和500mv；基于fe3o4@c900的传感器(apt/fe3o4@c900/ae)的四个aes的δep为251、283、354和420mv。结果表明，δep和氧化还原峰电流的变化趋势均符合相同的规律，即在空白ae被fe3o4@c、apt和otc连续固定后，δep连续增加，氧化还原峰电流下降，四种基于fe3o4@c纳米复合材料的适体传感器的电化学活性相应降低。如图10a2、10b2、10c2、10d2所示，是用eis表示基于在不同温度下煅烧的四种fe3o4@c纳米复合材料适体传感器来检测otc的整个过程。对于空白ae，在较高频率处有小的半圆，分别对应(a)fe3o4@c350，(b)fe3o4@c550，(c)fe3o4@c700和(d)fe3o4@c900的rct值为122.7、39.26、69.17和42.24ω。用四种fe3o4@c纳米复合材料分别改性后，rct值分别明显增大到260.7、98.4、133.3和119.6ω，表明fe3o4@c纳米复合材料的电导率相对较差；当otc靶向适体(apt)链固定在fe3o4@c/aes表面时，apt/fe3o4@c/ae的rct值分别进一步分别增加到330.3、183.0、236.8和334.1ω，因为适体链中包含的带负电荷的磷酸基与[fe(cn)6]^3-/4-氧化还原对之间的相互排斥作用，所以分析物溶液和电极之间的界面处的rct增加。当使用制备的fe3o4@c基适体传感器来测定otc时，eis曲线的半圆进一步增加，半圆曲线的相应rct值分别为409.6、288.2、375.3和507.3ω，在otc存在的情况下，otc靶向的适体链通过与otc结合而改变其构象，以形成g-四链联体，这将阻止电荷转移。此外，如在n2吸附-脱附等温线中所讨论的，fe3o4@c纳米复合材料具有介孔结构和高比表面积，因此otc可以吸附到fe3o4@c纳米复合材料上，大量的otc被吸附到apt/fe3o4@c/aes的表面，进一步使电荷转移变得困难。因此，otc的阻塞和阻塞效应都导致apt/fe3o4@c/ae的电化学活性显著降低。

为了比较fe-mofs和四种基于fe3o4@c纳米复合材料的电化学适体传感器对检测otc的不同检测效果，本发明提供了前述五个生物传感体系每步的rct值(δrct)的变化并表示在图11中。δrct值的差异如图11中的柱状图所示，从柱状图可以看出，与其他四种材料相比，fe3o4@c900/ae表面的apt吸附量最大，由于fe3o4@c900/ae的比表面积和介孔结构最高，因此可以进一步帮助吸收大多数otc，并具有最大的δrct(rct，apt-rct，材料)和δrct(rct，otc--rct，apt)。因此，测量电化学的最佳电极材料是fe3o4@c900。

apt/fe3o4@c900/ae的灵敏度测试：通过将apt/fe3o4@c900/ae与不同浓度的otc一起孵育，然后在[fe(cn)6]^3-/4-溶液中测定它们的eis图谱。图12a是用于检测不同浓度的otc的apt/fe3o4@c900/ae的eis图，因为适体传感器对otc的有效识别，所以rct的值随otc浓度的增加(从0.005至1.0ng·ml^-1)而逐渐增加。这可能是因为随着otc浓度的增加，在纳米复合电极表面上产生了抗原-抗体复合物之间更多的分子识别，从而导致了rct值的增强。传感器在检测otc之前和之后的δrct是确定的数值(参阅图12b)，且当otc浓度的对数值(logcotc)的范围从-2.301到0时，δrct值与logcotc成正比，它的线性回归方程为δrct＝0.676logcotc+1.762，相关系数(r²)为0.9944。根据langmuir吸附方程，在信噪比(s/n)比为3时，模拟检测限(lod)低至0.027pg·ml^-1。

apt/fe3o4@c900/ae的选择性和稳定性测试：使用apt/fe3o4@c900/ae分别检测可能与otc共存的浓度为10^-3nm(otc浓度的10倍)的抗生素包括四环素、多西环素、金霉素和空白pbs缓冲液。如图13a所示，与检测otc显著的δrct响应值相反，通过添加其他干扰得到的响应变化可忽略。因此，otc与其相应的探针适体之间具有高度特异性，电化学适体传感器对otc具有较高的选择性；再现性是评估开发适体传感器性能的重要指标，在相同条件下制备的五个基于fe3o4@c900纳米复合材料的适体传感器，通过检测在室温(25℃)下溶解于pbs中的10^-5nm的otc引起的δrct值来测试适体传感器的再现性(图13b)。用五个适体传感器同时检测相同浓度的otc的δrct值的相对标准偏差(rsd)为2.6％，表明传感器之间的重现性很好。

此外，稳定性和再生性也是评估适体传感器性能的重要指标。在数天之内，每次测量后将电极浸入超纯水中并将其保存在4℃的冰箱中并记录电极的δrct值，用这些δrct值来表示fe3o4@c900适体传感器的稳定性(图14a)。15天后未发现60nmotc的rct明显减少；再过一周，rct值下降约10％，一个月后，下降了约17％。在室温下将结合有otc的纳米复合电极浸入1.0mnaoh中80分钟并用水洗涤，测其rct值，然后再浸入相同浓度的otc溶液中2小时测其rct值，重复这个步骤数次，比较rct值并评估再生性。如图14b所示，在前5次再生运行期间，观察到适体传感器的δrct值没有实质变化，表明可以容易地再生。所有这些结果表明，本发明提供的适体传感器不仅具有高灵敏度和选择性，而且具有良好的再现性，稳定性和再生性。

实施例3：

采用实施例2制得的一系列传感器对实际样品进行测试，该实际样品为牛奶。相应的测试过程包括：

在50ml离心管中，将12ml生奶与18ml超纯水以及6ml10％三氯乙酸和氯仿的混合物在涡流震荡下混合1min以沉积蛋白质并溶解基质中的有机物质，然后将混合物在20℃下超声处理15min，并以13000rpm离心10min以分离沉积物；将上清液转移到另一个离心管中，并以10000rpm离心10min以再次除去沉积物；在原液中加入一定量的otc，然后按照上述步骤进行预处理和分析；根据上述方法检测所述溶液，通过hplc分析加标样品以验证所提出的分析方法的可靠性。

根据图12b的标准曲线得到结果。如表2所示，该适体传感器的回收率为98％至104％，rsd小于3.0％。同时，根据中国国家标准gb/t22990-2008，还用hplc测定了牛奶中的otc，通过比较得出本发明提供的适体传感器的结果完全符合hplc的要求，这些都表明这一新策略对于快速检测牛奶中的otc具有很高的重现性，准确性和可行性。

表2开发的适体传感器检测牛奶样品中的otc

本发明通过将fe-mofs于不同温度热解形成一系列fe3o4@c纳米复合材料，在这些纳米复合材料中fe3o4纳米颗粒均嵌入介孔无定形碳基底中，使得这些纳米复合材料均具有比表面积高，生物相容性好，生物亲和力强等优点，特别是其中的fe3o4@c900对otc的检测显示出最佳的电化学活性，因此可以用于构建电化学适体传感器。尤其是，基于fe3o4@c900开发的otc适体传感器显示出高灵敏度，在otc浓度从0.005到1ng·ml^-1的宽线性范围内检测限低至0.027pg·ml^-1，同时该传感器还具有高选择性，良好的再现性，稳定性，再生性和适用性等特征。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。