基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测S层蛋白的生物芯片传感器及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物检测，具体涉及一种基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测嗜酸乳杆菌s层蛋白的生物芯片传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

s-层蛋白是存在于细胞膜或细胞壁外的一种表层蛋白，是一类由蛋白质亚基组成的单层晶体结构，有多种乳酸菌表面存在s-层蛋白。嗜酸乳杆菌是黏附于肠道内的一种功能性益生菌，其表面的s-层蛋白在黏附中起到重要作用，对嗜酸乳杆菌发挥益生功能有重要贡献；s-层蛋白可以和肠上皮细胞表面的受体结合，阻断致病菌与病毒与其结合，因此对致病菌与病毒有一定抑制作用。对s-层蛋白进行快速、有效的富集和检测可推进其进一步的研究。目前对s-层蛋白的检测技术主要有质谱技术、氨基酸组分分析技术等，这些方法成本较高且操作复杂。因此开发一种操作简便、准确快速且高效的富集和检测方法十分重要。

多孔硅是使用单晶硅制备得到的具有海绵状结构的材料，多孔硅的光学特性使之在传感器方面具有很大应有价值，主要表现在其具有良好的反射性能，因此传感器可以基于这一点进行光信号的检测；另外由于多孔硅有其他许多不可多得的优点，如具有极大的比表面积、可在室温下发射可见光、化学稳定性良好、具有良好的生物兼容性等，也使其在传感器方面受到了广泛的研究应用。但是现有的孔硅非标记检测技术的稳定性差对复杂样品中s层蛋白不能进行特异性富集和检测，且没有报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的缺陷，如本发明所述的一种基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测s层蛋白的生物芯片传感器，该生物芯片传感器可以有效地、高选择性地富集和检测s-层蛋白。

本发明还提供基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测s层蛋白的生物芯片传感器的制备方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于二氧化钛修饰多孔硅在线富集和检测s层蛋白的生物芯片传感器，由二氧化钛修饰的多孔硅为载体，通过微流控技术结合，利用a蛋白将s-层蛋白单克隆抗体定向固定于二氧化钛修饰的多孔硅表面制备得到。

本发明所述的生物芯片传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)多孔硅的制备：采用阳极氧化法将硅片制备得到多孔硅，并进行高温氧化处理；

(2)二氧化钛修饰多孔硅：将钛酸四丁酯、无水乙醇、三乙醇胺混合均匀，用旋涂法将其涂布于步骤(1)所得的多孔硅表面，接着对多孔硅进行高温氧化处理，该步骤重复2-3次；

(3)抗体的固定：将步骤(2)所得二氧化钛修饰的多孔硅固定于微流控装置，匀速泵入a蛋白溶液使其非共价吸附于多孔硅表面，接着泵入s-层蛋白单克隆抗体溶液，使其被a蛋白捕获，通过a蛋白定向固定抗体的方法将s-层蛋白单克隆抗体固定于二氧化钛修饰的多孔硅表面，得到生物芯片传感器。

其中，步骤(2)所述的钛酸四丁酯、无水乙醇、三乙醇胺体积比5-6:30:1-2。优选体积比为5:30:1。

进一步地，步骤(2)所述的钛酸四丁酯、无水乙醇、三乙醇胺的混合溶液按质量体积比100-120：50(ul/mg)滴在多孔硅表面。作为优选，混合溶液按质量体积比100：50(ul/mg)按片滴在多孔硅表面。

其中，步骤(3)所述微流控装置由样品池和恒流泵构成；二氧化钛修饰的多孔硅固定于样品池底部使液体流经多孔硅表面，由恒流泵提供稳定的流速。恒流泵一端连接装样品的离心管，另一端连接样品池，这样可使样品循环流动经过多孔硅表面，便于蛋白的粘附和检测。使用光纤光谱仪检测多孔硅表面的干涉反射峰，保持光源固定检测多孔硅表面一点，以免光源移动使检测结果产生误差。微流控装置的样品池材料为聚甲基丙烯酸甲酯，厚度8mm，宽度30mm，长度60mm，中间孔径1.5mm，孔径总成长80mm，进出槽孔径由管径1.4mm不锈钢管连接，不锈钢管连接内孔径1.3mm，管壁后1.6mm的硅胶管，样品槽直径5.0mm，光纤垂直多孔硅表面检测。所述生物芯片传感器由微流控装置和固定s-层蛋白单克隆抗体固定于二氧化钛修饰的多孔硅构成。

步骤(3)所述a蛋白溶液浓度为0.1-0.2mg/ml；s-层蛋白单克隆抗体溶液浓度为50-55μg/ml。作为优选，a蛋白溶液浓度为0.1mg/ml；s-层蛋白单克隆抗体溶液浓度为50μg/ml。

本发明所述的生物芯片传感器在线富集和检测s层蛋白中的应用。

进一步地，所述生物芯片传感器在线富集和检测嗜酸乳杆菌中s层蛋白。

所述应用的具体步骤为分别配置不同浓度的s-层蛋白溶液，由低浓度到高浓度行检测；首先将低浓度的s-层蛋白加入生物芯片传感器，首先通过恒流泵泵入到样品池中固定了s-层蛋白单克隆抗体的二氧化钛修饰的多孔硅，加入ph7.4的pbs溶液待光学厚度不再上升并平衡后，洗掉结合在抗体上的s-层蛋白以进行下一个浓度蛋白的检测；接着通入pbs溶液直至光学厚度平衡，然后进行下一个浓度蛋白的检测，依次循环上述操作。检测中使用光纤光谱仪检测多孔硅表面的反射干涉峰，并将其傅里叶转换，监测多孔硅薄膜光学厚度的变化，整个抗体固定过程中保持光源的位置不动。

本发明所用原料和试剂都是市售可得：

其中，本发明的a蛋白购买sigma公司；

s-层蛋白的单克隆抗体采用经典的杂交瘤细胞方法制备，应用小鼠骨髓瘤细胞为sp2/0细胞，应用纯的s层蛋白免疫balb/c小鼠，三天后，取其脾脏细胞，应用聚乙二醇融合sp2/0细胞和脾脏细胞，获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，扩大培养并冻存，单克隆抗体效价≥128k。

嗜酸乳杆菌的s-层蛋白通过licl溶液提取，采用sephadexg-75凝胶层析法进行分离纯化，s-层蛋白经过sds-page电泳分析鉴定，得到单一的目标条带，结果表明s-层蛋白的分子量为46kda左右。

本发明的原理如图1所示，所述生物芯片以二氧化钛修饰的多孔硅为载体，与微流控技术结合，采用非共价结合法将a蛋白吸附在二氧化钛修饰的多孔硅表面，用a蛋白将s-层蛋白单克隆抗体定向固定于二氧化钛修饰的多孔硅表面。本发明利用a蛋白将s-层蛋白单克隆抗体定向固定于二氧化钛修饰的多孔硅表面增强s层蛋白抗体的活性，有利于捕获样品中的s层蛋白。本发明所使用生物芯片传感器富集和检测s-层蛋白的方法，是将多孔硅的反射干涉光谱经过傅里叶快速转换得到一个单峰为光学厚度，当样品中出现目标分子时，s层蛋白抗体会特异性捕获目标分子于多孔硅孔道内会导致多孔硅薄膜的光学厚度发生变化，使其反射干涉光谱的有效光学厚度发生变化，将待检测分子的状态转变为可读的光信号，检测到的信号，就是s层蛋白与其抗体反应的信号，说明样品中的s层蛋白被富集了。用光纤光谱仪实时监测多孔硅光学厚度的变化，添加不同浓度s-层蛋白检测其响应性。建立标准曲线并富集和检测嗜酸乳杆菌表层蛋白提取液中s-层蛋白的含量。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明生物芯片传感器以二氧化钛修饰的多孔硅作为探针载体，增加多孔硅表面的稳定性，多孔结构使该传感器具有很大的表面积，保证了对目标分子(嗜酸乳杆菌s-层蛋白)的灵敏度；采用s-层蛋白的单克隆抗体作为检测探针，保证了对目标分子的高选择性。采用非共价结合法将a蛋白吸附在多孔硅表面，用a蛋白将s-层蛋白单克隆抗体定向固定于二氧化钛修饰的多孔硅表面，增强s层蛋白抗体的活性，有利于捕获样品中的s层蛋白；该生物芯片传感器可以实现了对目标分子(嗜酸乳杆菌s-层蛋白)的快速富集和检测。同时该生物芯片传感器制备方法简单方便，成本低。

通过本发明的生物芯片传感器富集和检测方法，特异性富集嗜酸乳杆菌表层蛋白粗提液中s-层蛋白，利用光纤光谱仪测量多孔硅表面的光学厚度定量检测s-层蛋白，该方法对检测嗜酸乳杆菌s-层蛋白具有高灵敏度、低成本、检测时间快、高选择性、稳定性好、检测限低、特异性强等优势；对s-层蛋白的线性检测范围在0.001～10μg/ml之间，对s层蛋白富集和检测在15分钟之内完成。

附图说明

图1为本发明所述二氧化钛修饰多孔硅生物芯片对目标蛋白的富集和检测原理图；

图2为实施例1制备的生物芯片光学厚度变化图；

图3为实施例1制备的生物芯片对不同浓度s-层蛋白的响应图；

图4为实施例1制备的生物芯片对s-层蛋白检测的标准曲线；

图5为实施例1制备的生物芯片对嗜酸乳杆菌表层蛋白提取液中s-层蛋白的响应图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)硅片的前处理：将p型硅片切割成1.3×1.3cm大小，在丙酮溶液中浸泡30min以去除表面污渍；接着用双蒸水情洗3次，放入烘箱烘干。烘干后在食人鱼洗液中浸泡30min，接着用双蒸水清洗干净，处理好的硅片浸入无水乙醇中保存备用。

将上述处理好的硅片固定在电解池中，铝箔作为电解阳极固定于一个聚四氟乙烯底座上，将多孔硅放在铝箔上，在多孔硅上面放置一个圆形橡胶圈，防止刻蚀液从底部漏出；接着用三颗螺丝将腐蚀槽固定于底座上并拧紧。向腐蚀槽中加入一定量的刻蚀液(含体积分数48％的氢氟酸水溶液：无水乙醇＝3:1v/v)，里面浸泡着一个铂丝弯曲而成的铂电极作为电解阴极。刻蚀电流为正弦波，设定电流密度为500ma/cm²，刻蚀时间为10s。刻蚀结束后，用乙醇多次冲洗硅片，洗掉残留在硅片上的氢氟酸，最后用氮气流吹干。将硅片放在管式炉中，500℃下热氧化处理1小时，得到多孔硅。

(2)将钛酸四丁酯、无水乙醇、三乙醇胺按体积比5:30:1加入离心管中，用涡旋振荡器震荡10min混合，取100μl/片滴在步骤(1)多孔硅上，并用旋涂仪旋涂均匀，接着放入管式炉内500℃高温氧化1h。重复操作2-3次，使其光学信号变化波动在2纳米范围之内，得到二氧化钛修饰的多孔硅。

(3)将上述二氧化钛修饰的多孔硅固定于一个微流控装置，该装置由样品池和恒流泵构成。多孔硅固定于样品池底部，可以使液体流经多孔硅表面，由一个恒流泵来提供稳定的流速，恒流泵一端连接装样品的离心管，另一端连接样品池，这样可使样品循环流动经过多孔硅表面，便于蛋白的粘附和检测。使用光纤光谱仪检测多孔硅表面的干涉反射峰，保持光源固定检测多孔硅表面一点，以免光源移动使检测结果产生误差。

设置恒流泵的流速为1ml/min。使用光纤光谱仪检测多孔硅表面的反射干涉峰，并将其傅里叶转换为光学厚度，实时监测多孔硅表面光学厚度的变化。首先用pbs溶液(ph7.4；0.1m，以下都是用相同浓度ph值的pbs溶液)在装置中流动循环，使光学厚度平衡在2nm内，以此为基础光谱。接着配置0.1mg/ml的a蛋白3ml于离心管中，并用恒流泵将其泵入样品检测池中，使a蛋白非共价吸附于多孔硅表面，实时监测光学厚度的变化，待光学厚度平衡后说明蛋白a已吸附完全，接着使用pbs溶液将体系中未吸附的蛋白洗掉。

将s-层蛋白单克隆抗体稀释至50μg/ml，取4ml于离心管中并用恒流泵将其泵入样品池中，使抗体随着溶液流动被a蛋白捕获。待光学厚度趋平衡后，用pbs溶液洗掉未被捕获的抗体，得到基于二氧化钛修饰多孔硅生物芯片传感器，制备流程如图1所示。

实施例2

实施例2的制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(2)钛酸四丁酯、无水乙醇、三乙醇胺按体积比6:30:2加入离心管中，用涡旋振荡器震荡10min混合，取120μl/片滴在步骤(1)多孔硅上；步骤(3)中所述a蛋白溶液浓度为0.2mg/ml；s-层蛋白单克隆抗体溶液浓度为55μg/ml。

实施例3

将实施例1制备获得的二氧化钛修饰多孔硅生物芯片传感器应用于检测嗜酸乳杆菌s-层蛋白。

分别配置1nm/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、0.01mg/ml的s-层蛋白溶液，各取4ml于离心管中。由低浓度到高浓度行检测，首先将低浓度的s-层蛋白加入生物芯片传感器，首先通过恒流泵泵入到样品池的固定了s-层蛋白单克隆抗体的二氧化钛修饰的多孔硅，保持流速不变，同时监测光学厚度的变化，加入pbs溶液(ph7.4；0.1m)待光学厚度不再上升并平衡后，用1m的醋酸溶液通入生物芯片传感器中10min，洗掉结合在抗体上的s-层蛋白以进行下一个浓度蛋白的检测。接着通入pbs溶液直至光学厚度平衡，然后进行下一个浓度蛋白的检测，依次循环上述操作。检测中使用光纤光谱仪检测多孔硅表面的反射干涉峰，并将其傅里叶转换，监测多孔硅薄膜光学厚度的变化，整个抗体固定过程中保持光源的位置不动。

其中，如图2为整个流程中多孔硅薄膜光学厚度的变化，a蛋白吸附于多孔硅表面使光学厚度了50nm，抗体固定后光学厚度增加了47.5nm。随着不同浓度s-蛋白的加入，光学厚度分别有了不同长度的增加，蛋白浓度越大，光学后的增加值越大，图3更加直观的表示了不同浓度s-层蛋白对应的光学厚度变化值；从图2和图3可以说明本发明的检测时间快，可以在线检测不同浓度s层蛋白。

图4为生物芯片对s-层蛋白检测的标准曲线，蛋白浓度在0.001～10μg/ml范围内，s-层蛋白的浓度与光学厚度增加值有良好的线性关系，线性拟合方程为y＝10.7x+8.9，且r2＝0.9877。说明本发明生物芯片传感器应用于检测嗜酸乳杆菌s-层蛋白具有低检测线，检测范围广，灵敏度高。

酸乳杆菌表层蛋白提取液中s-层蛋白含量的测定：将蛋白粗提液稀释2000倍，用多孔硅生物芯片对其进行检测，检测光学厚度的变化。图5显示多孔硅表面的光学厚度增加了45nm左右，由标准曲线的拟合方程可以计算出，该蛋白粗提液中的s-层蛋白浓度为0.47mg/ml。图5表明本发明制备的二氧化钛修饰多孔硅生物芯片传感器可以有效富集和检测样品中s层蛋白，速度快检测时间在15min内，同时应用了单克隆抗体富集和检测目的分子具有高选择性，特异性。