人类免疫缺陷病毒快速检测测试卡及其应用的制作方法

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及快速检测人类免疫缺陷病毒(包括i型和ii型)抗体和人类免疫缺陷病毒p24抗原的测试卡及其应用等。

背景技术：

艾滋病，获得性免疫缺陷综合征，是一种由人类免疫缺乏病毒(简称hiv)的反转录病毒感染后，因免疫系统受到破坏，逐渐成为许多伺机性疾病的攻击目标，促成多种临床症状，统称为综合征，而非单纯的一种疾病，而这种综合征可通过直接接触黏膜组织(mucosa)的口腔、生殖器、肛门等或带有病毒的血液、精液、阴道分泌液、乳汁而传染。

由于艾滋病的高传染性，高传播范围及高死亡率，从发现艾滋病起，实际上就建立了相应的实验室诊断方法；由于检测的目的不同，也各自建立起不同的检测方法。检测方法大致分为两类：

1.病原学检测

1)病原分离：严格要求在p3实验室内进行，通过对患者血清高度浓缩，在电子显微镜下观察，分离hiv病毒。

2)原位杂交：用同位素标记克隆的hiv病毒cdna片段，与患者的组织细胞进行核酸杂交，经过放射自显影，来判定感染病毒的细胞。

3)pcr：扩增hivcdna片段，通过荧光标记的特异性核酸探针，来检查是否受到hiv感染。

4)逆转录酶的测定：通过测定患者血清中的逆转录酶的活性，来诊断是否受到hiv感染。

5)淋巴细胞功能测定：通过测定淋巴细胞的功能，主要是对t4辅助淋巴细胞，来诊断是否感染hiv。

6)p24抗原的检测:通过免疫反应,对血液中的p24抗原进行检测,作为hiv感染的早期诊断。

2.hiv抗体检测

hiv抗体检测的方法很多，如酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)、明胶颗粒凝集实验(gelatineparticleagglutinationassay,pa)、乳胶凝集实验(latexagglutinationassay,la)、各种快速检测实验(rapidtests)等。这些实验使用的抗原早期是完整病毒的裂解产物，这种抗原常常由于含有宿主细胞的成分而出现假阳性反应，同时这种抗原制备和纯化都比较困难，危险性大。此后的试剂使用重组或合成多肽hiv抗原，选择与免疫反应相关的抗原决定簇，敏感性和特异性均有所提高，这类抗原制备更为安全、容易、重复性好，但是重组抗原有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，尤其是hiv病毒本身容易突变，而多肽抗原由于缺乏合适的立体构象也会使敏感性下降从而导致假阴性，这将对推广应用来说堪称是灾难性的。

例如，中国专利申请cn105842462a公开了一种检测hiv抗体的免疫层析测试条，应用荧光免疫层析技术和双抗原夹心法检测人血清中的hiv-i和hiv-2抗体；中国专利申请cn1858594a公开了人类免疫缺陷病毒抗体多指标快速检测方法，其利用包括p24、gp41和gp36等抗原蛋白片断的固定来进行检测；中国专利申请cn102445538a公开了艾滋病(hiv-1/2)尿液快速检测试剂，其基于胶体金技术检测hiv重组抗原p41、p42和p36。

然而，上述现有技术都不涉及对相应抗原或抗原片断的选择，因此在检测容易突变的hiv病毒的时候，难以避免假阴性结果，为此，本发明人精心研究，研发了一种新的hiv人抗体和hiv抗原快速检测测试卡，不但能同时快速、高灵敏度、低变异系数地检测i型和ii型hiv的人抗体和hiv的p24抗原，而且准确率高，能避免假阴性结果的出现，特别适合用于hiv的初筛。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种hiv人抗体和hiv抗原快速检测测试卡，其能进行快速、高灵敏度、低变异系数地检测，便于野外现场检测和床边检测等初筛，同时具有高度的准确性，尤其是避免假阴性结果，适合推广使用。另外，本发明还提供了该测试卡的制备方法和应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了hiv人抗体和hiv抗原快速检测测试卡，其包括底板(1)和依次贴合在底板上的样品垫(2)、硝酸纤维素膜(8)和吸水垫(9)，硝酸纤维素膜(8)与吸水垫(9)连接，其中，样品垫(2)与硝酸纤维素膜(7)之间连接有贴合在底板上的荧光微球垫(3)，其中，荧光微球垫(3)吸附i型hiv抗原标记的荧光微球、ii型hiv抗原标记的荧光微球、p24抗体标记的荧光微球和质控蛋白标记的荧光微球，硝酸纤维素膜(8)上在样品垫(2)至吸水垫(9)的方向上有依次吸附i型hiv抗原、ii型hiv抗原、p24抗体和抗所述质控蛋白的抗体的三条分离的垂直于样品垫(2)至吸水垫(9)的方向的线。

优选在本发明第一方面的测试卡中，所述i型hiv抗原的氨基酸序列如seqidno：1所示。该抗原是本发明人从大量hiv的蛋白上研发出来的，对本发明第一方面的测试卡的高准确性起了关键作用。

也优选在本发明第一方面的测试卡中，所述ii型hiv抗原的氨基酸序列如seqidno：2所示。该抗原是本发明人从大量hiv的蛋白上研发出来的，对本发明第一方面的测试卡的高准确性起了关键作用。

荧光微球已经大量商品化，然而本发明人发现，它们用于本发明中的效果参差不齐，经研究发现，波长480nm处有吸收峰的带有羧基基团荧光微球(如购自oceannanotech的)特别适合用于本发明中。所以，优选在本发明第一方面的测试卡中，所述荧光微球是在波长480nm处有吸收峰的带有羧基基团荧光微球。

优选在本发明第一方面的测试卡中，所述标记的荧光微球通过如下方法制备：将所述荧光微球与edc振荡混合后，用pbs缓冲液洗涤，再加入所述抗原、抗体或质控蛋白，振荡混合，然后加入含甘氨酸和βsa的pbs缓冲液振荡封闭，最后用含βsa和proclin300的pbs缓冲液洗涤并稀释。通过上述方法可以分别制备所述i型hiv抗原标记的荧光微球、所述ii型hiv抗原标记的荧光微球、所述p24抗体标记的荧光微球和所述质控蛋白标记的荧光微球。

本发明人研究发现hiv上p24抗原的突变通常不在其表位上，因此采用现有的p24抗原制备其抗体即可有效识别。优选在本发明第一方面的测试卡中，所述p24抗体的抗原的氨基酸序列如seqidno：3所示。

本发明人发现，质控蛋白对本发明的效果也有一定影响，为了避免人样本中的物质对质控线的影响，优选采用半抗原及其抗体。优选在本发明第一方面的测试卡中，质控蛋白是dnp-bsa(二硝基氟苯-牛血清白蛋白)，即缀合了dnp(半抗原)的bsa；相应抗体优选是抗所述半抗原的抗体，即抗dnp抗体。采用dnp作为质控蛋白的半抗原，可有效地避免人样本对质控线的影响。

在第二方面，本发明提供了制备本发明第一方面的测试卡的方法，其包括：(a)制备所述i型hiv抗原标记的荧光微球、所述ii型hiv抗原标记的荧光微球、所述p24抗体标记的荧光微球和所述质控蛋白标记的荧光微球，然后混合吸附于荧光微球垫(3)上；

(b)将所述i型hiv抗原、所述ii型hiv抗原、所述p24抗体和所述抗所述质控蛋白的抗体分别划线于硝酸纤维素膜(8)上；和，

(c)将步骤(a)获得的荧光微球垫(3)和步骤(b)获得的硝酸纤维素膜(8)同底板(1)、样品垫(2)和吸水垫(9)组装成所述测试卡。

其中，制备所述hiv抗原标记的荧光微球和所述质控蛋白标记的荧光微球的方法可以是如下方法：

将所述荧光微球与edc振荡混合后，用pbs缓冲液洗涤，再加入所述抗原、抗体或质控蛋白，振荡混合，然后加入含甘氨酸和βsa的pbs缓冲液振荡封闭，最后用含βsa和proclin300的pbs缓冲液洗涤并稀释。通过上述方法可以分别制备所述i型hiv抗原标记的荧光微球、所述ii型hiv抗原标记的荧光微球、所述p24抗体标记的荧光微球和所述质控蛋白标记的荧光微球。

在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的测试卡在制备低变异系数检测hiv人抗体和hiv抗原的检测产品中的应用。

本发明第一方面的测试卡精密性好，变异系数低。优选在本发明第三方面的应用中，所述低变异系数是变异系数不超过15％。

在第另一方面，本发明提供了氨基酸序列如seqidno：1所示的i型hiv抗原和/或氨基酸序列如seqidno：2所示的ii型hiv抗原在制备hiv抗体的检测产品中的应用。

该方面的应用可以是氨基酸序列如seqidno：1所示的i型hiv抗原的单独应用或是氨基酸序列如seqidno：2所示的ii型hiv抗原的单独应用，也可以是他们的联合应用。

另外，该方面也可以是它们与针对氨基酸序列如seqidno：3所示的p24抗原的p24的联合应用。优选其中，所述hiv抗体的检测产品是hiv人抗体和hiv抗原的检测产品，更优选是本发明第一方面的测试卡。

本发明的有益效果在于能进行快速、高灵敏度、低变异系数地检测hiv人抗体和抗原，便于野外现场检测和床边检测等初筛，同时具有高度的准确性，尤其是避免假阴性结果，适合推广使用。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1显示了本发明的hiv快速检测测试卡的结构示意图，其中，附图标记分别表示：1：pvc底板；2：样品垫；3：荧光微球垫；4：i型抗原测试线；5：ii型抗原测试线；6：p24抗体测试线；7：dnp抗体测试线；8：nc膜；9：吸水垫；10：样品。

具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(coldspringharborlaboratorypress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《rna实验技术手册》(科学出版社,北京,中国,2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施；其中的试剂均可通过商业渠道获得。

实施例1hivi型、ii型重组抗原、p24抗体的确定

根据本发明人的设计，从大量的hiv病毒的抗原中设计了如seqidno：1所示的氨基酸序列的抗原作为i型hiv病毒检测抗原(简称i型抗原)、如seqidno：2所示的氨基酸序列的抗原作为ii型hiv病毒检测抗原(简称ii型抗原)。另外，本发明人采用了如seqidno：3所示的氨基酸序列的hivp24抗原，委托北京中杉金桥生物技术有限公司按照常规方法制备了相应p24单抗和多抗(兔抗p24多抗)。

实施例2hiv抗原、抗体在硝酸纤维素上划膜

用硝酸纤维素膜分别与实施例1的重组抗原和抗体在硝酸纤维素膜(nc膜)进行划膜，具体采用sartoriμs(赛多利斯)cn104nc膜，孔径15μm，爬行速度150s/4cm。具体划膜过程如下：

1)划膜缓冲液的配制：配制0.01mpbs(磷酸缓冲液)，ph7.0，含1％蔗糖，用0.22μm进行过滤。

2)取划膜缓冲液，按照一定浓度分别稀释抗原、抗体，其中实施例1的i型hiv抗原、ii型hiv抗原稀释至1mg/ml，实施例1的ii型抗原稀释至1mg/ml，实施例1的p24单抗浓度稀释至1.8mg/ml，作为质控的dnp抗体(购自dako公司)浓度稀释至1.5mg/ml。

3)用划膜仪(可购自杭州峰航科技有限公司)分别在nc膜上划膜，均按照1μl/cm速度划膜，实施例1的i型抗原划膜在0.5cm处划膜，实施例1的ii型抗原在0.9cm处划膜，实施例1的p24单抗在1.3cm处划膜，dnp抗体在1.8cm处划膜，37℃干燥3-4小时，密封保存在1～30℃。

实施例3荧光微球的确定及与抗原、抗体的偶联

取不同来源的羧基基团荧光微球，用0.01mpbs以1:10稀释；用0.01mpbs调零，在波长400nm～600nm范围内扫描，看是否在波长480nm处有狭窄吸收峰(说明荧光微球粒径均一)；用0.01mpbs稀释荧光微球浓度至2mg/ml，在nc膜上点样10μl，检测看是否其荧光值≥10⁴。经测试，购自oceannanotech的带有羧基基团荧光微球效果最好，因此选择该荧光微球。具体抗原、抗体偶联的过程如下：

1)i型抗原标记荧光微球：用活化缓冲液(0.05mmes(2-(n-吗啉代)乙磺酸))将荧光微球稀释到1mg/ml，期间用活化缓冲液清洗两次，每次洗涤后进行离心(10000转，30分钟)。将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与荧光微球按照质量比1：20的比例加入，在25℃振荡30min，用偶联液(0.01mpβs，ph7.4)洗涤2次，按照每毫克微球加入10μg蛋白的浓度,加入实施例1的i型抗原，2-8℃振荡过夜。用额外加入40mm甘氨酸、1％(w/v)βsa的偶联液作为封闭液封闭，25℃振荡60min。用保存液(0.01mpβs中含0.5％(w/v)βsa(牛血清白蛋白)，0.5％(v/v)proclin300(可购自上海闪晶分子生物科技有限公司))洗涤2次。加保存液至浓度为1mg/ml，放置温度2～8℃保存。

2)ii型抗原标记荧光微球：用活化缓冲液(0.05mmes)将荧光微球稀释到1mg/ml，期间用活化缓冲液清洗两次，每次洗涤后进行离心(10000转，30分钟)。将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与荧光微球按照质量比1：20的比例加入，在25℃振荡30min，用偶联液(0.01mpβs，ph7.4)洗涤2次，按照每毫克微球加入10μg蛋白的浓度,加入实施例1的ii型抗原，2-8℃振荡过夜。用额外加入40mm甘氨酸、1％(w/v)βsa的偶联液作为封闭液封闭，25℃振荡60min。用保存液(0.01mpβs中含0.5％(w/v)βsa(牛血清白蛋白)，0.5％(v/v)proclin300)洗涤2次。加保存液至浓度为1mg/ml，放置温度2～8℃保存。

3)p24多抗标记荧光微球：用活化缓冲液(0.05mmes)将荧光微球稀释到1mg/ml，期间用活化缓冲液清洗两次，每次洗涤后进行离心(10000转，30分钟)。将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与荧光微球按照质量比1：20的比例加入，在25℃振荡30min，用偶联液(0.01mpβs，ph7.4)洗涤2次，按照每毫克微球加入5μg蛋白的浓度，加入实施例1的p24多抗，2-8℃振荡过夜。用额外加入40mm甘氨酸、1％(w/v)βsa的偶联液作为封闭液封闭，25℃振荡60min。用保存液(0.01mpβs中含0.5％(w/v)βsa(牛血清白蛋白)，0.5％(v/v)proclin300)洗涤2次。加保存液至浓度为1mg/ml，放置温度2～8℃保存。

4)dnp-bsa标记荧光微球：用活化缓冲液(0.05mmes)将荧光微球稀释到1mg/ml，期间用活化缓冲液清洗两次，每次洗涤后进行离心(10000转，30分钟)。将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与荧光微球按照质量比1：20的比例加入，在25℃振荡30min，用偶联液(0.01mpβs，ph7.4)洗涤2次，按照每毫克微球加入15μg蛋白的浓度,加入dnp-bsa(可购自dako公司)，2-8℃振荡过夜。用额外加入40mm甘氨酸、1％(w/v)βsa的偶联液作为封闭液封闭，25℃振荡60min。用保存液(0.01mpβs中含0.5％(w/v)βsa(牛血清白蛋白)，0.5％(v/v)proclin300)洗涤2次。加保存液至浓度为1mg/ml，放置温度2～8℃保存。

5)将上述i型抗原、ii型抗原、p24抗体、dnp-bsa标记的荧光微球等体积混合，混合的荧光微球加入玻璃纤维上，每毫升荧光微球铺约8平方厘米的玻璃纤维垫，37℃干燥4小时。

实施例4hiv快速检测测试卡的组装

将实例2、3中制备的nc膜、荧光微球玻璃纤维垫(荧光微球垫)与样品垫、吸水垫等黏贴于背衬上，切条、组装。具体如下：

将上述样品垫切成长度30cm和宽度28mm，荧光玻璃纤维垫切成长度30cm和宽度10mm，反应膜切成长度30cm和宽度25mm，吸水层剪切成长度30cm和宽度27mm，然后依次将其贴在衬卡上，组成大板后，切割成长度8cm和宽度4mm的单个人份试纸条，装入测试卡壳中，将每单人份装有干燥剂的密封袋中，存放于室温。制备成的测试卡结构如图1所示。

实施例5hiv检测测试卡的应用

检测样品中hiv抗体、抗原的检测方法，其具体过程如下：

1)取实施例4制备的测试卡。

2)血清、血浆样本，用移液器吸取75μl，加于测试卡样品垫中。

3)测试卡加样5分钟后，立即将测试卡插入荧光仪(可购自杭州和迈科技有限公司)插孔中，检测各条带荧光值，其中：

i型抗原条带荧光值大于500以上，质控条带荧光值≥1000以上,可判定为i型hiv病毒抗体阳性；

ii型抗原条带荧光值大于500以上，质控条带荧光值≥1000以上,可判定为ii型hiv抗体阳性；

p24抗体条带荧光值大于500以上，质控条带荧光值≥1000以上,可判定为hivp24抗原阳性；

质控条带荧光值<1000时，重复第1)步重新测量。

使用上述方法检测检测国家食品药品检定研究院提供的hiv国家标准品，结果如下表1。

表1hiv国家标准品检测结果

另将上述标准品样本分别重复10次检测，变异系数(cv)分别为8.32％、9.87％、10.25％，均≤15％，说明该方法精密性好。另外，本发明的测试卡得灵敏度可达到0.05pg，线性范围可达到200-1000倍。

另对本发明的测试卡进行加速破坏，于37℃放置30天，进行测定，检测结果仍旧如上表所示，而且其cv均≤15％，精密性仍佳，表明本发明的测试卡稳定性好，可用于储存条件不佳的地方快速hiv样本的检测。

另外，使用上述方法对107份普通样品进行检测，结果均与临床多重检测(包括病毒培养)确诊的检测结果一致，没有发现假阴性结果；而利用常规抗原的胶体金或免疫荧光技术对上述样品检测，会出现1～3％的假阴性结果。

<110>苏州华益美生物科技有限公司

<120>人类免疫缺陷病毒快速检测测试卡及其应用

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