100~120 yL 1:500稀释的步骤（1) 中备用的纳米钴-四氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再接着分别滴加100~120 μ L 0. 25%戊二醛溶液，常温下活化2~3h后，用水冲洗干净并用氮气吹干；然后其中一个基底 电极滴加100~120 μ L 1:500稀释的三唑锡人工抗原，另一个基底电极滴加100~120 μ L 1:500稀释的毒死蜱人工抗原，分别于37°C下孵育3~4h，过夜，用0. 01mol/L，ρΗ7. 2~7. 6 的PBS缓冲液冲洗干净，烘干；
[0049] (3)非特异性活性位点的封闭：将表面修饰后的两个基底电极分别滴加100~ 120 μ L 5mg/mL牛血清蛋白缓冲液放于37°C恒温封闭5~6h，取出用0· 01mol/L，ρΗ7· 2~ 7. 6的PBS缓冲液冲洗干净，即得电化学免疫传感器，最后将制备得到传感器探针保存在 4°C环境中待用，如图6所示。
[0050] 实施例2 :利用电化学免疫传感器同时检测三唑锡和毒死蜱的方法
[0051] 1、三唑锡单克隆抗体的制备：将三唑锡抗原ACT-Hl-BSA免疫6-8周龄SPF级雌 性Balb/c小鼠，动物免疫过程如下：取100 μ L分装好的三唑锡抗原与等体积Freund氏完 全佐剂采用注射器互推法乳化成乳剂，乳化至滴，滴至水中能保持完整不分散，成滴状浮于 水面，即乳化完全；采用背部皮下、腹腔和足垫多点注射免疫〇. 2mL~0. 3mL/只（含抗原 100 μ g~150 μ g)，3周后同样剂量人工抗原与等体积Freund氏不完全佐剂混合成乳剂，相 同剂量和方法注射加强免疫；然后，每隔2周加强免疫1次，且剂量相同，共免疫4次，间接 ELISA法检测血清抗体效价，效价为抗血清A49tinm/对照A49tinm^ 2. 1时的抗血清的最大稀释 倍数，选择效价高者用于单克隆抗体的制备；取3d前经加强免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨 髓瘤细胞融合（细胞数目比值约在6 : 1)，采用间接ELISA及间接竞争ELISA筛选阳性杂 交瘤细胞，并采用显微克隆法对阳性细胞进行亚克隆，当细胞培养板中阳性率为100 %时即 可建株，-70°C冰箱冻存；将培养的杂交瘤细胞离心，弃去上清，杂交瘤细胞用无血清培养液 悬浮，并将细胞数调至（1~2) X IO6个/mL，每只小鼠腹腔注射0. 5mL ;2周后抽取腹水，采 用辛酸一硫酸铵法进行单克隆抗体的分离沉淀，分光光度法检测抗体浓度。
[0052] 2、制备纳米银标记的IgG-HRP抗体：首先用碱液调节AgNRs溶液的pH至8~10， 接着将体积比1:1的IgG-HRP和lmg/mLHRP混合液滴加入AgNRs溶液中，搅拌10~20min 后，在8000~12000rpm下离心15~25min，然后用0· 01mol/L pH 7. 4的PBS进行2~5 次洗涤，最后将所得AgNRs-IgG-HRP分散在Iml PBS缓冲液中，4°C下保存，备用。
[0053] 3、制备纳米铜标记的IgG-HRP抗体：首先用碱液调节CuNRs溶液的pH至8~10， 接着将体积比1:1的IgG-HRP和lmg/mLHRP混合液滴加入CuNRs溶液中，搅拌10~20min 后，在8000~12000rpm下离心15~25min，然后用0· 01mol/L pH 7. 4的PBS进行2~5 次洗涤，最后将所得CuNRs-IgG-HRP分散在Iml PBS缓冲液中，4°C下保存，备用。
[0054] 4、检测三唑锡和毒死蜱：本实验采用间接竞争免疫分析法，包括以下步骤：
[0055] (1)先将所述电化学免疫传感器的一个工作电极滴加三唑锡单克隆抗体溶液和三 唑锡标准品组成的混合液；另一个工作电极滴加毒死蜱单克隆抗体溶液和毒死蜱标准品组 成的混合液，分别放于37°C下孵育60min，取出用0.0 lmol. L 1PH 7. 4的PBS缓冲液反复冲 洗干净，随后分别滴加纳米铜棒标记的IgG-HRP抗体和纳米银标记的IgG-HRP抗体，37°C下 孵育45min，取出用0.0 lmol. L 1PH 7. 4的PBS缓冲液反复冲洗干净，备用；
[0056] (2)建立工作曲线：将步骤⑴中修饰后的两个工作电极与两个参比电极、两个辅 助电极分别插入体积比为I : 1 : 1，物质的量之比满足0.1 : 5 : 5的氯化钾、亚铁氰化 钾和铁氰化钾混合成pH 7. 4缓冲液中组组装成相应的两组三电极系统，然后组装在一个 检测器，在不断搅拌下加入相当于三唑锡单克隆抗体溶液和三唑锡标准品组成的混合液或 毒死蜱单克隆抗体溶液和毒死蜱标准品组成的混合液体积的0. 1倍的0. 4mol/L~0. 5mol/ L的双氧水，采用循环伏安法通过单刀双掷开关来测定不同浓度三唑锡标准品和毒死蜱标 准品的电流值，三唑锡标准品和毒死蜱标准品浓度与相应的电流值之间的函数关系，即为 电化学免疫传感器工作曲线，如图5所示；
[0057] (3)测定三唑锡和毒死蜱：利用步骤⑴修饰后的工作电极在-0. 8~0. 8V的范 围内进行循环伏安扫描，扫描速率为50mV/s，通过单刀双掷开关来分别测定三唑锡和毒死 蜱待测溶液中的电流值，然后根据步骤（2)获得的工作曲线，即可计算出待测溶液中三唑 锡和毒死蜱的浓度，如图3,图9,图10所示。
[0058] 实施例3 :同时检测三唑锡和毒死蜱的电化学免疫传感器反应条件的优化
[0059] 免疫传感器中，对免疫过程中的条件进行优化对于发挥传感器的性能非常重要， 用于固定的抗原缓冲液的稀释比，与抗原结合的抗体缓冲液的稀释比，与半抗原结合抗体 的量，与免疫反应的时间，温度等对传感器的准确性和灵敏度都有很大的影响。本实验着 重对萘酚溶液浓度，nan〇-C 〇304/Pan溶液稀释比，抗原抗体稀释比，铁氰化钾缓冲液稀释的 PH值进行了优化，优化过程中的同一实验设置三个平行实验，数据取三个实验得平均值， 实验结果如图4所示，本实验确定了三唑锡：0. 75%作为免疫传感器中萘酚的最佳浓度； 1:400为nano_Co304/Pan溶液最佳稀释比；1:1600作为人工偶联抗原的固定浓度稀释比； 1:400作为三唑锡抗体的最佳稀释比；pH = 7. 4的PBS (l/15mol/L)作为基体溶液。毒死 蜱：1.25%作为免疫传感器中萘酚的最佳浓度；1:800为1^11 〇-(：〇304/?&11溶液最佳稀释比； 1:1600作为人工偶联抗原的固定浓度稀释比；1:1000作为毒死蜱抗体的最佳稀释比；pH = 7. 4的PBS(l/15mol/L)作为基体溶液。
[0060] 实施例4 :同时检测三唑锡和毒死蜱电化学免疫传感器的标准曲线（工作曲线） 和检出限
[0061] 在优化后得到的最佳实验条件下，采用循环伏安法测定不同浓度（10ng/mL、20ng/ mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL 和 100ng/mL)的三 P坐 锡和毒死蜱标准品，绘制出标准曲线。结果见图6。结果表明，该传感器中三唑锡的线性检 测范围是 0. 05ng/mL ~100ng/mL，线性回归方程为 y = -0. 5267x+54. 667，R2= 0. 9932,最 低检测限为0. 05ng/mL ;毒死蜱的线性检测范围是0. 05ng/mL~100ng/mL，线性回归方程为 y = -0· 5309χ+57· 4, R2= 0· 9931，最低检测限为 0· 05ng/mL。
[0062] 实施例5 :同时检测三唑锡和毒死蜱电化学免疫传感器的重现性、稳定性和回收 率分析
[0063] 1、同时检测三唑锡和毒死蜱电化学免疫传感器的重现性：取骏枣和灰枣样品（市 售）各6份，IKTC~120°C烘干，研磨成粉，溶解在无水乙醇中，对制得的样品溶液用同时检 测三唑锡和毒死蜱电化学免疫传感器进行检测，每份样品重复6次，实验结果如表1所示， 由表1可知，每份样品的重现性都很好。
[0064] 表1-三唑锡（毒死蜱）电化学免疫传感器检测值（μ A)
[0065]
[0066] 2、同时检测三唑锡和毒死蜱电化学免疫传感器的稳定性
[0067] 取骏枣和灰枣样品（市售）各6份，IKTC~120°C烘干，研磨成粉，溶解在无水乙 醇中，对制得的样品溶液用同时检测三唑锡和毒死蜱电化学免疫传感器进行检测，每天检 测1次，检测6天，实验结果如表2所示，由表2可知，6天之内电流响应值变化不大，该传感 器具有$父尚稳定性。
[0068] 表2-三唑锡（毒死蜱）电化学免疫传感器检测值（μ A)
[0069]
[0070]
[0071] 3、同时检测三唑锡和毒死蜱电化学免疫传感器的回收率实验
[0072] 取骏枣和灰枣两种样品（市售），IKTC~120°C烘干，研磨成粉，溶解在无水乙醇 中，三唑锡（毒死蜱）标准品用无水乙醇溶解，分别按10 μ g/g，20 μ g/g和50 μ g/g浓度向 样品中加入三唑锡（毒死蜱）标准样品制备加标样品，每种样品平行测定三次，同时，采用 高效液相色谱法测定加标样品作为对照实验，实验结果见表3。由表3可知，表明该方法准 确度高，能用于实际样品中三唑锡和毒死蜱的分析。
[0073] 实施例6 :同时检测三唑锡和毒死蜱电化学免疫传感器的电化学特性
[0074] 用循环伏安法研究电极在自组装过程中的电化学特性，见图7、图8。由图8可知， 当萘酚膜修饰到电极上后，循环伏安曲线的电流值降低，说明萘酚膜阻碍了电子的传递；当 nan〇-C〇304/PAN与萘酚膜发生了离子交换后，修饰电极在铁氰化钾溶液中的氧化还原峰 电流增大，说明萘酸膜里的nano_Co304/Pan可以有效地传递电子；当电极再次修饰三唑锡 (毒死蜱）人工合成抗原-BSA后，氧化还原峰较聚苯胺还原峰下降，这是由于蛋白分子吸 附到电极上从而阻碍了电子传输；特别是当三唑锡（毒死蜱）抗体和三唑锡（毒死蜱）抗 原-BSA专一性结合后，生成的抗原-抗体复合物阻塞了修饰电极表面更多孔径通道，增加 了在通过膜时的阻力从而使响应电流进一步下降。因此，运用该电化学免疫传感器可检测 食物中的三唑锡（毒死蜱）等有毒有害物质是否存在。
[0075] 4、同时检测三唑锡和毒死蜱的电化学免疫传感器的检测方法
[0076] 控制电极电势以不同的速率，随时间以三角波形一次或多次反复扫描，电势范围 是使电极上能交替发生不同的还原和氧化反应，并记录电流-电势曲线（电流响应曲