线）， 在电极上施加一个线性扫描电压，以恒定的变化速度扫描，当达到某设定的终止电位时，再 反向回归至某一设定的起始电位。根据循环伏安曲线图中峰电流Ip、峰电势及峰电势差和 扫描速率之间的关系，可以判断电极反应的可逆性。当电极反应完全可逆时，在25°C下，这 些参数的定量表达式有：
[0077] (I) Ipc = 2· 69X 105n3/2D01/2 υ 1/2(Α ·ο?-2)，即 Ipc 与反应物 0 的本体浓度成 正比，与υ 1/2成正比。其中：D0为O的扩散系数（cm2/s)，C为O的本体浓度，υ为扫描 速率（V/s)。即：本发明中随着待测样品与抗体发生反应，导致抗体量发生变化从而免疫电 流发生上述变化。
[0078] (2) I Ipc I = I Ipa丨，即I Ipc/Ipa I = 1，并与电势扫描速度υ无关。
[0079] (3) Δρ = 59/n(mV)，并pc，pa与扫描速度u和无关，为一定值。
[0080] 其中（2)与（3)是扩散传质步骤控制的可逆体系循环伏安曲线的重要特征，是检 测可逆电极反应的最有用的判据。
[0081] 根据曲线形状可以判断电极反应的可逆程度，中间体、相界吸附或新相形成的可 能性，以及偶联化学反应的性质等。常用来测量电极反应参数，判断其控制步骤和反应机 理，并观察整个电势扫描范围内可发生哪些反应，及其性质如何。
[0082] 表3-三唑锡（毒死蜱）电化学免疫传感器的回收率测定值
[0083]
【主权项】
1. 一种同时检测三唑锡和毒死蜱的电化学免疫传感器，其特征在于，包括两个工作电 极、两个参比电极、两个辅助电极，一个检测池，一个实现同时检测三唑锡和毒死蜱的单刀 双掷开关，其中一个工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺 复合膜，戊二醛，三唑锡人工抗原，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点；另一个工作电 极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺复合膜，毒死蜱人工抗原，并 以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。2. 根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述基底电极为ITO玻璃电 极，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述辅助电极为铂电极；所述三唑锡人工抗原是以三环 锡和5-巯基-3-氨基-1，2, 4-三氮唑为初始原料先合成三唑锡半抗原，再与牛血清蛋白偶 联制备而成的三唑锡人工免疫抗原；所述毒死蜱人工抗原是毒死蜱人工免疫抗原或包被抗 原。3. -种如权利要求1或2所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，首先在预 处理的两个基底电极表面分别滴加萘酚溶液，烘干；接着分别滴加纳米四氧化三钴/聚苯 胺复合材料，烘干；再分别滴加戊二醛溶液活化，清洗，氮气吹干；然后其中一个基底电极 滴加三唑锡人工抗原，另一个基底电极滴加毒死蜱人工抗原，分别孵育，过夜，清洗，烘干， 最后分别滴加牛血清蛋白缓冲液封闭。4. 根据权利要求3所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述免疫传感 器包括以下步骤： (1) 纳米四氧化三钴/聚苯胺复合材料的制备：将〇. 3~0. 4g十六烷基三甲基溴化 铵溶解在45~55mL蒸馏水中，加入0. 2~0. 4g的四氧化三钴纳米颗粒，超声分散、搅拌 4. 5~5. 5h后加入150~200 y L苯胺，持续搅拌0. 5~I. 5h，加入相当于苯胺物质的量 1. 5倍的柠檬酸，搅拌9. 5~10. 5h，加入与苯胺物质的量等量的硫酸铵，继续搅拌11. 5~ 12. 5h后停止反应，将反应后的产物进行抽滤，保留滤饼，依次用去离子水和无水乙醇多次 洗涤至滤液无色，将滤饼置于真空烘箱中60°C干燥4小时即得nan〇-C 〇304/PAN复合材料， 备用； (2) 三唑锡人工抗原的合成：称取193g~195g的三环锡用24~26mL甲醇将其溶 解，然后缓慢的滴加到58g~59g用48~52mL 80°C~85°C热水溶解的5-巯基-3-氨 基-1，2, 4-三氮唑，搅拌1~2h后有大量白色沉淀生成，将白色沉淀过滤后用开水洗涤 3~4遍，干燥后用95%乙醇进行重结晶，即得三唑锡半抗原ACT-Hl ;将8mg~IOmg三唑 锡半抗原用2. 5mL~3. 5mL DMF溶解，涡旋震荡下缓慢的加入9mL~IlmL蒸馏水，然后加 入38mg~42mg BSA，待完全溶解后，滴加30~50 y L戊二醛溶液，4°C下搅拌过夜，溶液由 乳白色变为微黄色；4°C下用生理盐水溶液透析45h~48h，每3~4h换一次水；即得到三 唑锡免疫抗原ACT-H1-BSA，用生理盐水稀释至lmg/mL~I. 5mg/mL，-20°C保存； (3) 基底电极的预处理：将基底电极切成4Xlcm，乙醇超声清洗，烘干，用绝缘胶将探 头面积封至lcm2,再依次用洗洁精、丙酮、乙醇、去离子水中各超声清洗5~lOmin，氮气吹 干，备用； (4) 基底电极的表面修饰：首先在步骤（3)备用的一个基底电极表面滴加50~60 y L 0. 75%萘酚溶液，烘干；接着滴加100~120 y L 1:400稀释的步骤（1)中备用的纳米钴-四 氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再接着滴加100~120 y L 0. 25 %戊二醛溶液，常温下 活化2~3h后，用水冲洗干净并用氮气吹干，然后滴加100~120 y L 1:1600稀释的三唑 锡人工抗原，于37°C下孵育3~4h，过夜，用0.0 lmol/L，pH7. 2~7. 6的PBS缓冲液冲洗干 净，烘干；另一个基底电极滴加50~60 y L 1. 25 %萘酚溶液，烘干；接着滴加100~120 y L 1:800稀释的步骤（1)中备用的纳米钴-四氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再接着滴加 100~120 y L 0. 25%戊二醛溶液，常温下活化2~3h后，用水冲洗干净并用氮气吹干，然 后滴加100~120 y L 1:1600稀释的毒死蜱人工抗原，分别于37°C下孵育3~4h，过夜，用 0? 01mol/L，pH7. 2~7. 6的PBS缓冲液冲洗干净，烘干； (5)非特异性活性位点的封闭：将表面修饰后的基底电极分别滴加100~120 y L 5mg/ mL牛血清蛋白缓冲液放于37°C恒温封闭5~6h，取出用0.0 lmol/L，pH7. 2~7. 6的PBS缓 冲液冲洗干净，即得电化学免疫传感器。5. -种利用权利要求1或2所述的电化学免疫传感器同时检测三唑锡和毒死蜱的方 法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 修饰工作电极：先将电化学免疫传感器的一个工作电极滴加三唑锡单克隆抗体溶 液和三唑锡标准品组成的混合液；另一个工作电极滴加毒死蜱单克隆抗体溶液和毒死蜱 标准品组成的混合液，分别放于37°C下孵育50~70min，取出用0. 008~0. 012mol. L 1PH 7. 2~7. 6的PBS缓冲液反复冲洗干净，随后分别滴加纳米铜棒标记的IgG-HRP抗体和纳米 银标记的IgG-HRP抗体，37°C下孵育30~45min，取出用0? 008~0? 012mol. L 1PH 7. 2~ 7. 6的PBS缓冲液反复冲洗干净，备用； (2) 建立工作曲线：将步骤（1)中修饰后的两个工作电极与两个参比电极、两个辅助电 极分别插入体积比为I : 1 : 1，物质的量之比满足0.1 : 5 : 5的氯化钾、亚铁氰化钾和 铁氰化钾混合成pH 7. 4缓冲液中组装成相应的两组三电极系统，然后组装在一个检测器， 在不断搅拌下加入相当于三唑锡单克隆抗体溶液和三唑锡标准品组成的混合液或毒死蜱 单克隆抗体溶液和毒死蜱标准品组成的混合液体积的〇. 1倍的〇. 4mol/L~0. 5mol/L的双 氧水，采用循环伏安法通过单刀双掷开关来测定不同浓度三唑锡标准品和毒死蜱标准品的 电流值，三唑锡标准品和毒死蜱标准品浓度与相应的电流值之间的函数关系，即为电化学 免疫传感器工作曲线； (3) 测定三唑锡和毒死蜱：利用步骤（1)修饰后的两工作电极在-0. 8~0. 8V的范围内 进行循环伏安扫描，分别测定三唑锡和毒死蜱待测溶液中的电流值，然后根据步骤（2)获 得的工作曲线，即可计算出待测溶液中三唑锡和毒死蜱的浓度。6. 根据权利要求5所述的同时检测三唑锡和毒死蜱的方法，其特征在于，步骤（1)中， 所述三唑锡单克隆抗体由三唑锡人工抗原按照常规方法制备而成；所述纳米铜棒标记的 IgG-HRP抗体是由用碱液调节CuNRs溶液的pH至8~10,接着将体积比1:1的IgG-HRP 和lmg/mLHRP混合液滴加入CuNRs溶液中，搅拌10~20min后，在8000~12000rpm 下离心15~25min，然后用0. 01m〇l/L pH 7. 4的PBS进行2~5次洗涤，最后将所得 CuNRs-IgG-HRP分散在Iml PBS缓冲液中制备而成；所述纳米银标记的IgG-HRP抗体是由 用碱液调节AgNRs溶液的pH至8~10,接着将体积比1:1的IgG-HRP和lmg/mLHRP混合液 滴加入AgNRs溶液中，揽摔10~20min后，在8000~12000rpm下离心15~25min，然后用 0. 01mol/L pH 7. 4的PBS进行2~5次洗涤，最后将所得AgNRs-IgG-HRP分散在Iml PBS 缓冲液中制备而成。7.根据权利要求5或6所述的同时检测三唑锡和毒死蜱的方法，其特征在于，步骤（3) 中，所述循环伏安扫描速率为50mV/s。
【专利摘要】一种同时检测三唑锡和毒死蜱的电化学免疫传感器及其制备方法与应用，所述电化学免疫传感器包括两个工作电极、两个参比电极、两个辅助电极，一个检测池，一个实现同时检测三唑锡和毒死蜱的单刀双掷开关，其中一个工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺复合膜，戊二醛，三唑锡人工抗原，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点；另一个工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺复合膜，戊二醛，毒死蜱人工抗原，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。本发明还包括所述电化学免疫传感器的制备方法与应用。本发明具有原料易获得，稳定、标记牢固、不干扰抗原抗体反应、样品处理简单、检测速度快、携带便捷等优点，并且保质期长，贮存条件容易达到，适合于现场检测，同时检测多种药物。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105092850
【申请号】CN201510300478
【发明人】王伟华, 韩占江, 梁鹏举, 向延菊, 田木星, 宋周林, 马政彪, 李春艳, 赵海蓉
【申请人】塔里木大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年6月4日