Syn特异性抗体而不仅检测样品中那些未结合到结合伴 侣的抗体（"游离的"或"反应性的"抗体）。在本发明的过程中，确定了反应性aSyn特 异性抗体，特别是反应性aSyn特异性IgG的量，是Η)和MSA的诊断和发展的关键标志物。 如上文所述，本方法适合用于确定样品中aSyn特异性抗体的总量，即游离的（或"反应性 的"）抗体以及样品中那些已经结合（例如，结合到aSyn结构）的抗体。这可以有助于建 立样品中反应性vs非反应性抗体的差异（△)，这一参数对于ro和MSA诊断也非常重要。 然而这种差异在具有就DP和MSA而言的"健康状态"的人中不存在（或低），就aSyn特异 性IgG和aSyn特异性IgM而言，这一差异对于Η)和MSA的标志物功能至关重要。
[0050] 本发明的方法应用单颗粒检测技术。这种技术允许鉴定和定量（"计数"）aSyn 特异性抗体和aSyn聚集物"阳性"结合结果的数目和量。该技术的优选实施方案是FACS， 其在本领域中是已建立的技术。其它用于检测结合到aSyn聚集物的抗体的方法为，例如 Luminex或大量细胞计数法（masscytometry)。
[0051] 根据Luminex技术，可以如材料和方法中所述的进行样品的制备。样品制备 后，被特定的aSyn特异性抗体识别的aSyn聚集物可以通过偶联了荧光染色微球 的二抗检测，所述微球可以在多重检测系统例如Luminex读数器中检测（Binder等， Lupusl5(2005):412-421)。
[0052] 如果大量细胞计数法用作单颗粒检测技术，也可以如下面的实施例部分的材料和 方法中所述的进行样品制备。如所述的完成样品制备。样品制备后，被异性抗体识别的 aSyn聚集物可以通过偶联了过渡元素的稳定同位素的二抗检测，所述同位素可以通过原 子质谱检测。接着所述样品可以通过加热到温度>5, 500K的氩等离子填充的感应线圈喷射 (sprayed)。所述样品被气化并电离成其原子成分，而通过飞行时间质谱法定量同位素标记 的抗体的数量（Janes等，Nat.Biotechnol. 29 (2011) :602-604)
[0053] 或者，也可以应用单颗粒检测技术，其中一个结合伴侣（aSyn聚集物或抗体/血 清）固定但在流动条件下测量结合。例子是Hybcell技术和表面等离子共振技术。在本 发明中使用Hybcell技术，可以将血清样品点在Hybcell(旋转圆筒）的表面上并可以与 直接荧光标记的预孵育的aSyn聚集物，或者与荧光标记的单克隆aSyn特异性第二抗体 进行孵育。使用激光检测结合αSyn聚集物的抗体（Ronacher，AnagnosticsTechnical NoteANA-TN-005 (2010))。如果在本发明的方法中使用表面等离子共振，可以应用反向设 置：可以将预孵育的aSyn聚集物固定在芯片表面。来自血清的aSyn特异性抗体与芯片 上的aSyn聚集物的结合可以通过芯片表面质量的增加来检测，因此没有必要标记结合伴 侣。为了增加灵敏度或确定IgG亚型，抗IgG-AB的系列注射是可能的（Cannon等，Anal. Biochem. 328(2004) :67-75)。代替直接将aSyn聚集物固定在芯片表面，可以使用捕获抗 体。对于这一设置，aSyn特异性抗体被固定在芯片表面上，接着注射预孵育的aSyn聚集 物。在捕获聚集物后，注射血清并通过质量的增加测量反应性。
[0054] 根据本发明，检测aSyn特异性抗体对aSyn聚集物的结合可以通过任意适合 的已知方法进行，例如焚光光谱仪（Missailidis等，MethodsinMolecularBiology 248 (2003) :431 - 441)，用于通过二抗（标记的抗IgG或抗IgM二抗）检测结合到aSyn聚 集物的aSyn特异性抗体。
[0055] 对结合到聚集物的自身抗体的检测也可以使用特异性结合抗体的物质进行，例如 蛋白A(ProteinA)或蛋白G(ProteinG)。另一种可能性是使用aSyn聚集物沉淀aSyn 聚集物特异性的自身抗体，洗涤复合物并生物素化所述抗体。接着可以使用链霉亲和素作 为第二步骤试剂。
[0056]与现有技术公开不同（例如，TO2010/099199Al,TO2010/069603A1,和EP2 366 714A1)，其中蛋白，例如aSyn，Tau，AP或其变体固定在颗粒上（例如纳米颗粒，纳米 或微珠等），根据本发明提供的聚集物没有这种表面，但在没有任何支架或表面助剂下由聚 集物自身形成。这比使用微珠或纳米珠更接近自然情况，特别是在人血液中。
[0057] 本发明用途的优选领域是突触核蛋白病的诊断，包括帕金森病（PD)，路易体病 (LBD)，路易体痴呆（DLB)，帕金森病痴呆（PDD)，多系统萎缩（MSA)，单纯性自主神经衰竭 (PAF)，REM睡眠行为障碍（RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变I型（NBIATypeI)以及包涵 体肌炎（IBM);以及其它疾病，例如阿尔兹海默病（AD)和唐氏综合症（DS)，进行性核上性麻 痹（PSP)，皮质基底节变性（CBD)，额颞叶痴呆/匹克氏病（FTD/PiD)。
[0058] 本发明的优选实施方案是蛋白病（proteinopathies)的诊断，其通过本发明显 著改善。蛋白病是由畸形的蛋白质导致的疾病，特别是神经退行性疾病。根据本发明优 选的待诊断的蛋白病是阿尔兹海默病（AD)，唐氏综合症中的痴呆，帕金森病（PD)，路易体 病（LBD)，路易体痴呆（DLB)，帕金森病痴呆（PDD)，多系统萎缩（MSA)，单纯性自主神经 衰竭（PAF)，REM睡眠行为障碍（RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变I型（NBIATypeI)， 包涵体肌炎（IBM);皮质基底节变性（CBD)，进行性核上性麻痹（PSP)，皮克氏病（Pick's Diease，PiD)，拳击员痴呆症（慢性创伤性脑病，DP)，额颞痴呆（FTD)，Lytico-Bodig病 (LD)，亨廷顿氏病（HD)和脊髓小脑性共济失调（1，2,3和7型）和肌萎缩性侧索硬化症 (ALS)，prionosis和II型糖尿病；以及具有α-突触核蛋白沉积和/或聚集的疾病，特别 是阿尔兹海默病（AD)唐氏综合征（DS)，进行性核上性麻痹（PSP)，皮质基底节变性（CBD)， 额颞痴呆/皮克氏病（FTD/PiD);特别是用于蛋白病的早期追踪和用于观察用于治疗蛋白 病的药物的临床试验的开发。
[0059] 本方法特别适用于与和MSA诊断相关联。使用本发明，人类患者中的aSyn特 异性自身抗体作为Η)和MSA状态的标志物。在他们的血液中具有正常水平的aSyn特异 性抗体的人对于ro和MSA是"健康的"。如果在患有ro和MSA的患者或具有形成ro和MSA 的风险或怀疑患有ro和MSA的受试者中该水平改变，这种改变水平与ro和MSA相关。"改 变的"水平可以是aSyn特异性抗体绝对数量的变化，或aSyn特异性抗体的总体反应性的 改变（例如，给定类型的aSyn特异性抗体（IgG，IgM等））。例如，改变的反应性aSyn特 异性IgG与Η)和MSA相关，并且是Η)和MSA的标志物。使用本方法，当将反应性aSyn特 异性IgG的"健康的"水平设置为100%时，血液样品中反应性aSyn特异性IgG的显著变化 为，例如，降低到70%或更低，降低到50%或更低和降低到30%或更低，或增加至少30%， 例如至少50 %或至少100%。
[0060] 由于本发明提供用于ro和MSA和甚至是用于ro和MSA发展的标志物，可以使用 本方法观察疾病的发展以及可能的治疗方法的效果，特别是所述治疗方法是否能建立Αβ 特异性抗体，特别是IgG或IgM"健康的"或"更健康的"水平。
[0061] 因此，本发明优选用于监控ro和MSA患者，特别是使用用于治愈或改善ro和MSA 的药物治疗的ro和MSA患者。本方法可以成功的应用于在ro和MSA疫苗（例如，rooiA， TrialAFF008，NCT01568099)或aSyn靶向疾病改造药物的临床试验中观察患者。
[0062] 本发明的方法还可以用于评价形成蛋白病的风险，优选突触核蛋白病，特别是ro 和MSA，或者用于检测早期的蛋白病，优选突触核蛋白病，特别是ro和MSA。使用本发明， 在原理上使得在比认知和/或功能损伤明显更早的时间点检测患者的免疫学配置中关于 aSyn特异性自身抗体的变化成为可能。如果相对于较大部分人群以常规检测形式建立，这 可以允许对蛋白病，优选突触核蛋白病，特别是ro和MSA的早期诊断的显著改善。这使得 患者符合蛋白病，优选突触核蛋白病，特别是ro和MSA的早期治疗方案和/或预防（或延 迟）策略，特别是免疫疗法（包括疫苗接种）的条件。
[0063] 根据另一个方面，本发明涉及用于实施本发明方法的试剂盒，包含：
[0064]-包含aSyn的聚集物，和
[0065]-样品容器，特别是用于人样品（例如，血液，血清，血浆）。
[0066] 优选地，根据本发明的试剂盒可以进一步含有用于检测结合到aSyn特异性抗体 的包含aSyn的聚集物的方法，优选二抗，特别是标记的二抗，例如，抗IgG或抗IgM抗体。 其它组分可以是标准样品，阳性和/或阴性对照，使用说明和适合的包装设备（例如，牢固 的盒子，彩色小瓶等）。
[0067] 本发明通过以下实施例和附图进一步说明，但不受限于此。
[0068]图1示出了使用FACS分析的aSyn聚集物尺寸测定。可以使用流式细胞术检测 aSyn聚集物并在斑点印记中描绘为SSC-A(对数尺度）和FSC-A(对数尺度）通道中的同 质群体（A)。如FSC-A-直方图中所示，使用市售的校准尺寸珠（1，2, 4, 6, 10,和15μm)确 定aSyn聚集物的尺寸分布（通过FCS-A信号确定）（B)。
[0069] 图2示出了使用基于FACS的试验检测单克隆抗体对aSyn聚集物（A，B，C)和 Αβ1-42聚集物（D，E，F)的反应性。aSyn特异性单克隆抗体LB509特异性结合aSyn聚 集物（A)但不结合Αβ1-42聚集物（D)。相反，Αβ1-42特异性抗体3A5结合Αβ1-42 (E) 但不结合aSyn聚集物（Β)。使用抗免疫球蛋白-PE-标记的二抗在FL2-PE-通道中确定反 应性。
[0070] 不相关的对照mAbD129既不与aSyn(C)也不与Αβ1_42(F)相互作用，表明不同 的聚集物结合各自特异性的mAb的发现（E)。当聚集物与仅PE标记的二抗孵育时，可以看 到如C和F示出的荧光强度与背景染色可比。
[0071] 图3示出了两种不同方法，基于FACS的方法（A，C)和ELISA(B，D)试验灵敏度（A， B)和试验线性度（C，D)的比较。㈧aSyn聚集物与mAbLB509的稀释物系列孵育，并使用 流式细胞术在FL-2通道确定反应性。（B)在用aSyn包被的ELISA板上，mAbLB509的滴 定。请注意用于比较的所有结果以背景信号的倍数给出。
[0072] 下组示出了本文所述的FACS聚集试验（C)和ELISA⑶的线性范围。在FACS 聚集试验中使用范围从80ng/ml至0. 128ng/ml(超过三个对数阶）而在ELISA中范围从 15. 625ng/ml至0. 498ng/ml(超过两个对数阶）的aSyn特异性mAb确定线性范围。黑 线表示在Excel中计算的指定范围的趋势线。指出了两种滴定的皮尔森确定系数（The Pearson'scoefficientofdetermination)(R2)〇
[0073] 图4示出了来自于aSynFACS聚集试验（黑条）和aSynELISA(灰条），使用源 自各个小鼠的不同血清稀释物（A，B，C)，或使用源自用aSyn特异性疫苗免疫的20只小鼠 的1:100稀释物的CSF(D)的信号。所有的值描述为背景值的倍数。
[0074] 可以看到FACS聚集试验以比标准方法例如ELISA高达30倍更高的灵敏度检测 aSyn特异性抗体。
[0075] 来自于小鼠2 (B)和3 (C)的血清甚至在1:125, 000的稀释下表现出2xBG以上的 MFI信号，而来自小鼠1(A)的血清在1:25, 000的稀释下产生MFI>2xBG，而在ELISA中使 用所示的稀释不能检测到信号。
[0076] 使用1:500稀释的血清MFI信号达到了超过背景的400倍（C)而在ELISA系统中， 相同的血清稀释物仅产生20倍的背景增加。
[0077] 使用1:100的CFS样品比较两种方法，导致在ELISA中20个样品中仅1个达到了 显著的信号检测。当在FACS聚集试验中测量时，20个样品中的17个表现出MFI信号>2x BG〇
[0078] 图5示出了在人的IgG制备物（IVIG)中，对aSyn特异性IgG自身抗体的反应性 的确定，所述IVIG从来自健康供体的血浆提取。对IVIG进行所述的FACS试验。在FL2