异性疫苗免疫的动物的血清和CSF样品的aSyn反应性的检测极限。因 此，将aSyn固定在Maxisorp微量滴定板上用于ELISA测量。或者，生成aSyn聚集物用 于FACS分析。接着，将系列稀释的3种血清或1:100稀释的20个不同鼠CSF样品应用到 单独系统，并对ELISA确定405nm的0D值或对于FACS试验确定荧光强度（MFI值）。为比 较的原因，对不同的血清和CSF测量评价信噪比，且信号表示为背景信号的倍数（xBG)。
[0111] 通过对来自免疫的小鼠的血清滴定，证实了FACS聚集试验较高的灵敏度。来自小 鼠2 (B)和3 (C)的血清甚至在1:125, 000稀释时表现出MFI信号大于2xBG，对于小鼠2为 2xBG而对于小鼠3为3.llxBG，然而在ELISA中使用这一血清稀释物不能检测到信号。另 外与使用这一稀释物在ELISA中没有特异性信号相比，使用来自小鼠1(C)的血清的MFI信 号测量的结果在1:25, 000稀释时MFI为4, 45xBG。
[0112] 此外，也使用两种试验分析了来自20只小鼠的CSF样品。使用1:100稀释的CSF 样品比较两种方法的结果是ELISA中20个样品中仅一个达到显著信号检测（对于小鼠8为 2. 02xBG)，而当在FACS聚集试验中测量时，20个样品中的17个表现出MFI信号>2xBG。 分析来自小鼠2的CSF样品，结果是几乎30xBG的MFI信号。相同的CSF样品在ELISA测 量中没有传递出阳性信号。
[0113] 这表明新开发的基于FACS的试验检测aSyn特异性自身抗体比传统的试验系统 例如ELISA更灵敏高达30倍。
[0114] 使用IVIG确定人自身抗体的aSyn反应性
[0115] IVIG(静脉内免疫球蛋白）是一种市售的血液产品。其含有从来自健康供体的血 浆提取的汇集的IgG部分（来自至少1000个供体的人血浆）。已证明IVIG制品含有对 a Syn肽特异的自然存在的抗体（自身抗体）。
[0116] 本实验的目的是确定本文所述的技术是否提供以有效的方式检测IVIG中aSyn 特异性自身抗体的可能性（IVIG-Subcuvia，购自Baxter,Austria)。
[0117] 为了这一目的，生成aSyn聚集物用于FACS分析。接着，不同IVIG稀释物（范围 从200μg- 64ng/ml)应用于所述聚集物并确定焚光强度（MFI值）。如图5中所示，基于 FACS的试验提供强荧光信号，表明新开发的基于FACS检测aSyn特异性自身抗体的试验对 于aSyn自身抗体是高度灵敏的。
[0118]mAb对混合聚集物的反应性
[0119] 为了确定混合的聚集物是否允许以及在什么程度上允许aSyn,Αβ1-42,和p(E) Aβ3-42特异性抗体的结合，以及为了确定是否可以通过本文所述的基于FACS的试验监控 这种相互作用，进行了另一组实验。为了这一目的，除了纯的aSyn聚集物，Αβ1-42聚集 物和Ρ(Ε)Αβ3-42,还如ΜΜ中所述生成了等摩尔的混合物或使用不同比率的个体蛋白的聚 集混合物。接着，这些聚集物与对aSyn(LB509)或Αβ1-42(3Α5)和ρ(Ε)Αβ3-42φ129) 特异的单克隆抗体孵育，并确定混合聚集物的mAB结合模式。
[0120] 这些mABs对三种不同的聚集物底物（通过混合等摩尔量的所示肽建立）的反应 性示于图6中。如FACSPE直方图所示，单克隆抗体3A5仅仅结合含有Αβ1-42聚集物 的混合物（6Α+Β)而其对ρ(Ε)Αβ3-42/aSyn聚集混合物不表现出反应性（6C)。抗ρ(Ε) Αβ3-42mABD129仅结合含有ρ(Ε)Αβ3-42的混合物（6E+F)但对Αβ1-42/aSyn不表现出 反应性。此外，aSyn特异性mABLB509仅与含有aSyn的聚集混合物反应（6H)。这表明， 首先，可以产生含有不同肽的混合的聚集物，其次，这些聚集物与相应的mAbs特异性反应。
[0121] 形成具有差异化标记的肽的混合聚集物
[0122] 如丽中所述，生成了差异荧光标记的Αβ1-42和α-突触核蛋白肽的等摩 尔混合的聚集物。因此，将等摩尔比率的Αβl-42-Hilyte-555(在ΡΕ通道中可检测） 和aSyn-Hilyte-488(在FITC通道中可检测）混合并通过过夜孵育生成聚集物。孵 育后，使用FACSCantoII分析混合的聚集物。在FSC-A/SSC-1中的P1中门控具有大 小范围为0. 5-10μm的获得的聚集物，并在ΡΕ/FITC点阵图中进一步评价P1以确定 A0 1-42-Hilyte-555(PE)和aSyn-Hilyte-488(FITC)的贡献。A0 1-42-Hilyte-555 和 aSyn-Hi1yte-488的共孵育产生~90 %双阳性的混合聚集物，表明了在聚集物群体中 Αβ1-42和aSyn的均质分布。
[0123] 在进一步的实验中，检测了特异性a-Aβ1-42-和aSyn-mAB针对具有不同妝构 成的混合物的反应性，而Ρ(Ε)Αβ3-42特异性AB用作阴性对照。因此，在样品制备前，使用 单体Αβ1-42和aSyn的定量的，对称的滴定系列用于生成不同的混和聚集物底物。详细 的说，将35μΜΑβ1-42和aSyn的单体溶液以如表1中所示的比率混合，并在样品制备后 确定PE-MFI。
[0126]表1
[0127] 正如所预期的，非特异性对照ABD129没有反应性，且当100%的Αβ1-42用作底 物时，使用aSyn特异性ABLB509也没有反应性。但是滴定系列显示，只要0. 1% /1 %的 aSyn与99, 9/99%的Αβ1-42混合，足以诱导aSyn特异性ABLB509的强反应性，其甚至 比当LB509与100%的aSyn聚集物孵育达到的信号更强。其一个原因可能是aSyn单独形 成具有非常紧凑包裹的表位的聚集物，因为空间位阻其抑制mAB接近所有可得的表位。另 一方面，在混合的聚集物中，aSyn以这样的方式整合，其中所有可得的表位可以被mAB接 近而不封闭自身，并因此与当100%的aSyn聚集物用作底物时相比，PE-MFI信号增加。
[0128] 确定来自患者的人血液中的aSyn淀粉样蛋白抗体
[0129]a.IgG对aSyn的反应性
[0130] 使用如上文所述的aSyn聚集物和FACS分析，分析来自Η)患者（η= 30,~60-80 岁）的血清样品自然存在的aSyn特异性抗体含量。在所有测试的样品中检测到了对aSyn 聚集物特异的自然存在的抗体。结果表明，尽管自身抗体的水平在患者与患者之间明显不 同，在所有测试的样品中检测到了对aSyn聚集物特异的自然存在的抗体（图10A)。
[0131] b.IgM对不同的aSyn聚集物的反应性
[0132] 在下一组实验中，在如上文所述的相同组的血清样品中确定了aSyn聚集物特异 性IgM反应性。在所有测试的样品中检测到了对aSyn聚集物特异的自然存在的IgM同种 型抗体。再一次，与IgG抗体的反应性类似，在该ro患者组中可以检测到不同水平的自身 抗体（图10B)。
【主权项】
1. 一种用于检测生物样品中a突触核蛋白（a Syn)特异性抗体的方法，包含以下步 骤： -使所述样品与包含a Syn的聚集物特别是a Syn组成的聚集物接触，并允许所述 a Syn特异性抗体结合所述包含a Syn的聚集物，和 -通过单颗粒检测技术，优选通过荧光激活的细胞分选（FACS)检测结合到所述包含 a Syn的聚集物的a Syn特异性抗体。2. 根据权利要求1的方法，特征在于所述a Syn特异性抗体是人抗体，优选人IgG或 IgM抗体，特别是人IgG抗体。3. 根据权利要求1或2的方法，特征在于所述a Syn特异性抗体是自身抗体。4. 根据权利要求1至3任一项的方法，特征在于所述包含a Syn的聚集物具有50nm至 15 y m，优选从IOOnm至10 y m，特别是从200nm至5 y m的尺寸。5. 根据权利要求1至4任一项的方法，特征在于所述包含a Syn的聚集物通过在pH 2 至9孵育a Syn至少20分钟，优选至少1小时，特别是至少4小时而制备。6. 根据权利要求1至5任一项的方法，特征在于所述包含a Syn的聚集物以0. 01至 10 y M，优选0. 1至I y M的量存在用于使所述样品接触包含a Syn的聚集物。7. 根据权利要求1至6任一项的方法，特征在于所述生物样品是人血或源自人血的样 品，优选人血清或人血浆；人脑脊液或人淋巴。8. 根据权利要求1至7任一项的方法，特征在于所述包含a Syn的聚集物与所述样品 接触至少10分钟，优选10分钟至24小时，特别是20分钟至2小时。9. 根据权利要求1至8任一项的方法，特征在于使所述样品接触包含a Syn的聚集物 之前，在样品中的a Syn特异性抗体上进行解蔽（demasking)步骤，特别是如果检测IgM抗 体。10. 根据权利要求1-9任一项的方法，其中所述生物样品是正在接受或者理应接受 a Syn免疫治疗的患者的样品，且其中检测到的a Syn特异性抗体的量与同一患者在从所 述患者取出样品的同时，蛋白病相关的，特别是突触核蛋白病相关的诊断结果有关。11. 根据权利要求1至10任一项的方法，其中所述方法在同一患者不同时间取出的样 品上进行至少两次，且其中优选检测到的a Syn特异性抗体的量与同一患者在从所述患者 取出样品的同时，蛋白病相关的，特别是突触核蛋白病相关的诊断结果有关。12. 根据权利要求11的方法，其中所述方法每六个月进行至少一次，优选每三个月至 少一次，特别是每个月至少一次。13. 根据权利要求1至12任一项的方法在蛋白病，特别是突触核蛋白病的诊断 中的用途，其中所述蛋白病优选选自帕金森病（Parkinson' s diseas, F1D)，路易体病 (Lewy Body Disease，LBD)，路易体痴呆（Dementia with Lewy Bodies，DLB)，帕金森病 痴呆（Parkinson' s Disease Dementia，PDD)，多系统萎缩（Multiple System Atrophy， MSA)，单纯性自主神经衰竭（Pure Autonomic Failure，PAF)，REM睡眠行为障碍（REM Sleep Behavior Disorder，RBD)，脑铁沉积型神经退行性病变 I 型（Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation type I，NBIA Type I)，包涵体肌炎（inclusion body myositis，IBM)，皮质基底节变性（Cortico-Basal Degeneration，CBD)，进行性核上性麻痹 (Progressive Supranuclear Palsy，PSP)，皮克氏病（Pick's Diease, PiD)，拳击员痴呆症 (Dementia pugilistica)(慢性创伤性脑病，DP)，额颞痴呆（Frontotemporal dementia， FTD)，Lytico-Bodig 病（LD)，亨廷顿病（Huntington's disease，HD)和脊髓小脑性共济 失调（Spinocerebellar ataxias，1，2,3和 7 型）和肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，prionosis和II型糖尿病；以及具有a-突触核蛋白沉积和 /或聚集的疾病，特别是阿尔兹海默病（Alzheimer' s disease，AD)唐氏综合征（Down Syndrome，DS)，进行性核上性麻痹（PSP)，皮质基底节变性（CBD)，额颞痴呆/皮克氏病 (FID/PiD);特别是用于蛋白病的早期追踪和用于观察用于治疗蛋白病的药物的临床试验 的开发。14.用于执行根据权利要求1至12任一项的方法的试剂盒，包含 -包含a Syn的聚集物，和 -样品容器。
【专利摘要】公开的是一种用于检测生物样品中的αSyn特异性抗体的方法，包括以下步骤：-使所述样品与包含αSyn的聚集物接触并允许所述αSyn特异性抗体结合所述包含αSyn的聚集物，和-通过单颗粒检测技术，优选通过荧光激活的细胞分选(FACS)检测结合到所述包含αSyn的聚集物的所述αSyn特异性抗体。
【IPC分类】G01N33/564
【公开号】CN105247368
【申请号】CN201480029965
【发明人】G.斯塔夫勒, M.曼德勒, A.梅罗弗, A.冯博宁
【申请人】阿费里斯股份公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年4月2日
【公告号】CA2908607A1, EP2787348A1, EP2981824A1, US20160054333, WO2014161879A1