-PE 通道中评价Αβ聚集物的荧光强度，并表示为中位数荧光强度（MFI)。
[0079] 图6示出了mAB针对聚集物的反应性，所述聚集物从aSyn与Αβ1-42，aSyn 与ρ(Ε)Αβ3-42或Αβ1-42与ρ(Ε)Αβ3-42的等摩尔混合物生成。将聚集物与针对 Αβ1-42(3Α5)，ρ(Ε)Αβ3-42φ129)和aSyn(LB509)的特异性单克隆抗体孵育，并确定所 述混合的聚集物的mAB结合模式。
[0080]FACSPT直方图表明，单克隆抗体3A5仅仅与含有Αβ1-42聚集物的混合物结合 (6Α+Β)但对ρ(Ε)Αβ3-42/aSyn聚集物混合物没有反应性（6C)。抗ρ(Ε)Αβ3-42mABD129 仅结合含有ρ(Ε)Αβ3-42的混合物（6E+F)但对Αβl-42/αSyn(6D)表现出无反应性。所 述aSyn特异性mABLB509仅与含有aSyn的聚集物混合物反应（6G+I)但不与Αβ1-42/ ρ(Ε)Αβ3-42聚集物混合物反应（6Η)。
[0081] 图7:对聚集物的FACS分析，所述聚集物使用差异荧光标记的Αβ1-42和aSyn肽 A0 1-42-Hilyte-555(PE)和aSyn-Hilyte-488(FITC)的等摩尔混合物生成。获得的具有 尺寸范围为0. 5-10μπι的聚集物在FSC-A/SSC-A中的P1中门控（gated) (A)且P1进一步 在PE/FITC点图中评价以确定Αβl-42-Hilyte-555(PE)和aSyn-Hilyte-488(FITC)的贡 献（C)。使用未标记的混合的聚集物作为阴性对照（B)。
[0082] 图8:针对从不同浓度的aSyn和Αβ1-42生成的聚集物的mAb反应性。aSyn和 Αβ1-42肽如表1中所示混合。
[0083]图9示出了Αβ1-42 (3Α5)，Αβρ(Ε) 3-42 (D129)和aSyn(LB509)特异性抗体针对 由等摩尔的Αβ1-42，Αβρ(Ε)3-42和aSyn肽组成的聚集物的反应性。
[0084] 图10示出了源自ro患者的人血浆中，IgG㈧和IgM⑶自身抗体反应性的确定。 血浆样品（1:300稀释）进行所述的FACS试验。在FL2-PE通道评价与aSyn聚集物结合 的荧光强度，并表示为中位数荧光强度（MFI)。 实施例
[0085] 材料和方法
[0086] 使用ELISA检测aSyn特异性抗体
[0087]将aSyn肽（购自Anaspec)以 5μg/ml的浓度稀释于 100mMNaHC03(pH9. 2)并 在Maxis〇rp96孔板上包被过夜。为了防止非特异性结合，使用1%BSA/PBS封闭板，37°C1 小时。使用溶于结合缓冲液（PBS/0. 1%BSA/0. 1%Tween20)的系列稀释物mAbs(从所示浓 度起始）在37°C1小时进行ELISA。在使用PBS/0. 1 %TWeen20重复洗涤步骤（3x)后，添 加抗人IgGHRP(0. 5μg/ml)检测二抗，37°C1小时。样品再次洗涤3x并添加ABTS(0. 68mM 溶于pH4. 3的0. 1M梓檬酸）30分钟用于试验显影，之后在读板器（Biotek-Gen5Program) 上在波长405nm进行0D测量。
[0088] 使用FACS分析检测aSyn特异性抗体
[0089] 通过重悬和短暂的涡旋振荡直到溶液澄清而将500yg冻干的aSyn溶解于 100μ1无菌过滤的MonoQ。接着将该溶液在超声水浴中超声处理30秒，并以5μ1等分试 样不进行急冻（shock-freezing)而储存于-20°C。为了诱导聚集物的形成，将等分试样解 冻且整个体积的aSyn溶液以35μΜ的浓度在Eppendorf管中的1 %NH40H(pH4. 5)溶液 中在振动器上（350rpm)37°C孵育过夜。aSyn聚集物仅用于一个试验，并且弃去残余物。
[0090] 另外，对于每个实验，在样品制备如确定聚集物的量以确保可比的aSyn聚集物 密度。
[0091] 在样品制备前，过夜孵育后生成的聚集物数量在FSC/SSC通道中测量，并且标准 化作为底物使用的聚集物的数量。详细的说，如上文所述将3μ1过夜生成的aSyn聚集物 稀释于97μ1 0.5%BSA/PBS中。3μ1代表了用于每个样品的底物的标准量。使用FACS CantoII，70μ1的该aSyn溶液以高流速（2μ1/s)测量，结果是35秒的收集时间，并确定 聚集物的数量。将在这些条件下获得的约10, 〇〇〇个颗粒定义为标准。如果检测到了较多 或较少的聚集物，调整在进一步样品制备中用作底物的aSyn聚集物的体积以确保在不同 实验中样品内的可比的聚集物密度。这意味着例如如果仅获得了 5000个事件，则用于样品 制备的底物的体积增加到6μ1每孔。如上所述，对于每一个样品制备，~10, 000以上的颗 粒用作起始材料。
[0092] 对于aSyn特异性抗体的检测，将3μ1的aSyn聚集物悬浮液与92μ1的0.2μm 过滤的0. 5%BSA/PBS混合，并接着转移到96孔V型底板的孔中用于进一步的样品制备。 将这些悬浮液在RT孵育60分钟用于封闭。
[0093] 将-80°C的鼠或人血清样品的等分试样新鲜解冻用于每个测量，对于鼠血清样品 以1:50稀释或者对于人血清样品以1:5稀释于0. 5%BSA/PBS，接着通过0. 22μm96孔过 滤板在96孔板离心机中离心（3000rpm，3分钟）将这些样品0. 2μm过滤。CSF样品以1:5 预稀释到0. 5%BSA/PBS且不无菌过滤。将5μ1预稀释的血清或CSF样品添加到95μ1的 aSyn聚集物悬浮液中，产生最终1:1000的鼠血清稀释物和1:100的人血清或CSF稀释物。 在振动器上（450rpm)室温孵育60分钟后，将0. 5%BSA/PBS添加到每个孔。将所述板以 3000rpm离心5分钟（96孔板离心机）并通过将其彻底倒入水槽移除上清液（SN)。其后，添 加200μ1的0. 5%BSA/PBS并重复此洗涤步骤3次。对于鼠血清和CSF样品的检测，在第 4次洗涤步骤后，再次弃去上清液，并将沉淀重悬于100μ1 0. 5 %BSA/PBS中，该溶液含有 1:10000 稀释的ΡΕ标记的抗mlgG(H+L)F(ab') 2片段（JacksonTmmunoResearch)。对于 IVIG的检测，使用 1:1000 稀释的PE标记的抗mIgG(H+L)F(ab' )2片段（JacksonImmuno Research)。样品在振动器上（600rpm)再室温孵育60分钟。接着，无需额外的洗涤步骤，在 装有高通量取样器（HTS)的FACSCanto上测量样品。基于它们的FSC/SSC特征鉴定aSyn 聚集物。在FL2-PE通道中评估Abs结合到聚集物的信号，并使用FASCDiva软件基于其中 位数荧光强度（MFI)评价。
[0094] 混合聚集物的生成和检测
[0095]为了测试不同的肽（例如，aSyn和Αβ1-42)是否形成含有两种肽的混合聚 集物，使用Ν端焚光标记的Αβ1-4和C端标记的aSyn肽。如Anderson和Webb所述 (BMCBiotechnology2011，11:125)，标记Αβ和aSyn肽不阻止淀粉样蛋白聚集物的 形成。因此，以等摩尔的比率（20μΜ)混合Αβl-42-Hilyte-555(在PE通道中可检测） 和aSyn-Hilyte-488(在FITC通道中可检测），并在1%ΝΗ40Η(ρΗ4. 5)中在振动器上 (350rpm)室温孵育20小时。孵育后，使用FACSCantoII分析这些聚集物。获得的聚集物 在FSC-1/SSC-A的P1中进行尺寸门控（~0. 5μπι-ΙΟμπι)，接着在PE/FITC点阵图中进一 步分析Ρ1 以确定A0 1-42-Hilyte-555(PE)和aSyn-Hilyte-488(FITC)的分布。
[0096]使用从单体aSyn，Αβ1-42和ρ(Ε)Αβ3-42蛋白的混合溶液生成的聚集物作为底 物通过FACS分析检测特异性抗体反应性
[0097] 通过重悬和短暂的涡旋振荡直到溶液澄清而将500μg冻干的aSyn或100μg Aβ1-42或p(E)Aβ3-42溶解于100μ1无菌过滤的MonoQ(aSyn)或100μ1无菌过滤的 1 %ΝΗ40ΗpHll(Αβ1-42和ρ(Ε)Αβ3-42)。接着将该溶液在超声水浴中超声处理30秒， 并以5μ1等分试样不进行急冻而储存于-20Γ。为了诱导聚集物的形成，将单个蛋白的等 分试样解冻，且三种蛋白溶液的全部体积在1%NH40H(pH4. 5)稀释到~35μΜ的等摩尔浓 度。在Eppendorf管在振动器上37°C孵育20小时之前，将这些蛋白溶液以所有三种可能的 组合混合：Αβ1-42&aSyn，Αβl-42&p(Ε)Αβ3-42 和ρ(Ε)Αβ3-42&aSyn。此外，不仅是等 摩尔的比率（=50:50)，也进行滴定实验以测试聚集混合物的不同比率。聚集混合物的比 率示于实验中（例如，1:100 = 1μ1aSyn(20μM) +99μ1Αβ1-42 (20μM)溶液）。混合的 聚集物作为底物用于进一步的样品制备并如以上段落所述的对αSyn聚集物的处理而进 行处理。
[0098] 解蔽（Demasking)
[0099] 为了破坏aSyn特异性自身抗体与患者血清中可能存在的aSyn的结合，以及因 此阻止通过基于抗原的方法（ELISA或FACS)对这些结合aSyn的自身抗体的检测，将血清 以1:16. 7预稀释到10mM的pH2. 6甘氨酸中5分钟。接着，将5μ1酸化的血清与3μ1aSyn 共孵育另外5分钟。然后通过添加92μ1 0. 5%BSA/PBS中和混合物，并孵育20至60分 钟。如上文所述的用于非解蔽血清的进行洗涤步骤和使用二抗孵育。
[0100] 结果
[0101] aSyn聚集物：低聚化和纤丝形成
[0102] 近几年，已经在多种条件下对从单体aSyn形成aSyn聚集物进行了深入研究。已 发现aSyn肽的聚集非常依赖于不同的条件包括pH，温度，缓冲液组分和蛋白浓度。聚集开 始于从单体形成发夹，导致可溶性的低聚物。接着，构象转变为平行的折叠导致纤 丝和纤丝状聚集物的形成，其可以通过离心沉淀。
[0103] 根据本发明，生成了aSyn聚集物（全长人aSyn1-140)。这些aSyn聚集物可 以使用FACS分析检测。如材料和方法（MM)中所述，为了这一目的，将无核的可溶aSyn以 35μΜ浓度在37°C孵育20小时。如图1A所示（上组），通过FACS分析可以检测到清晰的 aSyn聚集物同质群体。使用范围从1至15μm的校准尺寸珠分析aSyn聚集物（通过前 向散射FSC-A确定）的大小分布（流式细胞术尺寸校准试剂盒（Cat.#F-13838)通过分子 探针）（图1下组）。使用该分析，表明生成的aSyn聚集物的尺寸正如预期的从亚微米范 围直到10μπι，其中大多数生成的聚集物在~500nm直到2μπι的范围内。
[0104]mAbs对aSyn聚集物的反应性
[0105] 为了确定aSyn聚集物是否允许aSyn特异性抗体的结合和为了确定是否可以使 用本文所述的基于FACS试验监控这种相互作用，进行了另一组实验。为了这一目的，生成 了aSyn聚集物以及Αβ1-42聚集物（根据国际申请PCT/EP2012/068494中的公开内容制 备），并与aSyn(LB509)或Αβ1-42(3Α5)特异性单克隆抗体孵育。另外，两种形式的聚集 物与非特异性的对照抗体mABD129孵育。如图2中的FACS直方图所示，单克隆抗体LB509 仅仅结合aSyn聚集物而mAb3A5仅与Αβ1-42聚集物相互作用。此外，用作同种型对照 的不相关mAbD129既不与aSyn也不与Αβ聚集物反应。这表明所述基于FACS的试验允 许以高特异性的方式检测aSyn抗体。
[0106] 在FACS试验和ELISA系统中确定针对aSyn的抗体反应性的线性范围
[0107] 为了确定线性分析测量范围的上限和下线，使用mAbLB509进行了滴定实验（图 3)，
[0108]使用PearsoYs决定系数在Excel中计算估算的线性范围，在FACS聚集试验中 浓度范围为80-0. 128ng/ml的LB509的结果是R2值〉0. 9966,从而穿过了三个对数级。在ELISA中确定线性度，结果是线性范围在15. 625ng/ml和0. 489ng/ml之间，从而仅穿过了两 个对数级。R2值为1将表示100 %的线性度。
[0109] 确定用于用aSyn特异性疫苗处理的动物血清和CSF中特异性自身抗体的aSyn 结合的FACS聚集物试验和ELISA的灵敏度
[0110] 本实验的目的是确定和比较两种独立检测方法（ELISA和基于FACS的试验）用于 源自用aSyn特