当荧光分子的周围微环境温度发生变化时，荧光分子的荧光特性发生改变，荧光强度或者光谱发生改变。
[0030]如图2所示，纳米粒子11、荧光分子12和靶向性分子13构成分子探针；其中，荧光分子的分子通过连接分子14间接连接在纳米粒子11的表面。
[0031]如图3所示，荧光分子和靶向性分子既可以直接连接在纳米材料表面，也可以通过连接分子或包覆层间接连接在纳米材料的表面；其中，(a)为荧光分子12和靶向性分子13分别通过连接分子14与纳米粒子11间接连接；(b)为靶向性分子13与纳米粒子11直接连接，焚光分子12与纳米粒子11通过连接分子14间接连接；(c)为革E向性分子13与纳米粒子11通过连接分子14间接连接，荧光分子12与纳米粒子11直接连接；(d)为荧光分子12和革E1向性分子13分别与纳米粒子11直接连接；(e)为革El向性分子13与纳米粒子11通过连接分子14直接连接，荧光分子12与纳米粒子11通过包覆层15间接连接；(f)为靶向性分子13与纳米粒子11直接连接，荧光分子12与纳米粒子11通过包覆层15间接连接，纳米粒子本身具有的有机或无机的壳层结构也可以作为包覆层，如透明质酸壳层、聚多巴胺壳层、多孔二氧化硅壳层、硫化锌壳层等。
[0032]实施例一
[0033]在本实施例中，选用最大吸收峰在512nm和780nm的金纳米棒作为纳米粒子，荧光分子采用罗丹明B染料；利用分子量为3.4kDa的带有巯基的聚乙二醇分子作为连接分子将罗丹明B染料分子与纳米棒相连，同时加入过量的带有巯基和氨基的聚乙二醇分子。最后，将靶向性分子通过酰胺键化学连接在金纳米棒的表面，并用离心方法分离，得到分子探针。
[0034]将上述分子探针与组织切片共同孵育，并用PBS缓冲溶液洗去多余的分子探针。利用荧光显微镜对切片进行成像。然后利用波长为785nm，输出功率为llOmW的调控光对成像区域照射20s，保证成像区域中每一点受到的照射基本一致。关闭调控光，迅速对同一区域进行再次成像。对两次成像的荧光强度分布求差或滤波，得到荧光强度减弱的幅度即反映了分子探针浓聚的程度。
[0035]实施例二
[0036]本实施例中采用三种不同的分子探针，其结构和制备方法与实施例1中的均相同。唯一的区别是，本实施例中的三种分子探针，其使用的金纳米棒的纵向共振峰分别为780nm、1064nm和1240nm，且三种金纳米棒各对应一种彼此不同的革E1向性分子。
[0037]同时使用这三种分子探针对组织切片进行标记，并用荧光显微镜进行成像。接着，根据需要研究的靶位点的不同，选用波长分别为785nm、1064nm和1240nm的激光器单独或共同对成像区域进行照射。每次照射后迅速对同一区域进行再次成像，并与照射前的荧光分布进行求差或滤波。相应波长照射后荧光强度减弱的程度反映了相应吸收波长金纳米棒所对应的分子探针的浓聚情况。通过三路调控光的开关，可以定向检测某一种靶位点上的荧光信号，达到对多位点荧光标记的实时监测成像的效果，可以实现多个生物靶位点的同步成像。对于成像结果的图像处理亦可提高荧光检测的精度。
[0038]实施例三
[0039]本实施例应用于活体荧光成像。以皮下肿瘤作为探针靶位点，采用两种不同的分子探针，其结构和制备方法与实施例1中的均相同，不同的地方是两种探针使用的抗体分别对应结合血管增生和癌细胞的标志物，两种金纳米棒的纵向共振峰分别为780nm和1064nm。将该两种探针通过尾静脉注射或直接局部注射的方法，注入小鼠体内。并在活体荧光成像系统中观测荧光，使用785nm和1064nm的红光/红外光分别进行调制，并对结果进行求差或滤波处理，方法及原理同上所述，可以得到针对血管增生标志物和癌细胞标志物的较为精确的荧光成像结果，辅助检测观察。
[0040]最后需要注意的是，公布实施方式的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解:在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。
【主权项】
1.一种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针，其特征在于，所述分子探针包括:纳米粒子、荧光分子和靶向性分子；其中，所述荧光分子为对温度敏感的小分子荧光分子；所述荧光分子与已知吸收谱的纳米粒子之间直接连接或者间接连接；所述纳米粒子再与靶向性分子直接或间接连接；所述靶向性分子通过特异性结合作用结合到靶位点。2.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述荧光分子与纳米粒子的直接连接，采用纳米粒子表面本身带有的基团与荧光分子的活化基团形成共价键；所述荧光分子与纳米粒子通过连接分子间接连接，线性或枝化的有机小分子、高分子聚合物或生物分子作为连接分子，连接分子的一端与纳米粒子相连，另一端与荧光分子的分子相连；或者通过包覆层间接连接。3.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述靶向性分子通过共价键连接到纳米粒子的表面；或者通过线性或枝化的有机小分子、高分子聚合物或生物分子作为连接分子，间接连接至纳米粒子的表面；或者革E向性分子通过包覆层与纳米粒子间接连接。4.一种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针系统，其特征在于，所述分子探针系统包括:纳米粒子、荧光分子、靶向性分子、激发光、加热源和荧光探测器；其中，所述荧光分子为对温度敏感的小分子荧光分子；所述荧光分子与已知吸收谱的纳米粒子之间直接连接或者间接连接；所述纳米粒子再与靶向性分子直接或间接连接；所述荧光分子、纳米粒子和靶向性分子构成分子探针；当分子探针分布在成像区域内，靶向性分子通过特异性结合作用结合到靶位点；激发光入射到成像区域，激发荧光分子发出荧光；所述荧光探测器检测荧光；所述加热源入射至成像区域，对纳米粒子加热，改变纳米粒子的温度，同时改变纳米粒子周围微环境温度，从而影响与纳米粒子连接的荧光分子的发光特性，荧光强度或者光谱发生改变，实现光调控。5.如权利要求1所述的分子探针系统，其特征在于，所述加热源采用调控光、微波或者超声中的一种。6.如权利要求5所述的分子探针系统，其特征在于，对于调控光作为加热源，纳米粒子的吸收峰避开作为荧光分子的激发光的波长。7.—种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针的探测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将选定的小分子荧光分子与已知吸收谱的纳米粒子之间通过共价键直接连接或者通过连接分子间接连接，纳米粒子再连接靶向性分子，荧光分子、纳米粒子和靶向性分子构成分子探针； 2)当分子探针分布在成像区域内，靶向性分子通过特异性结合作用结合到靶位点； 3)激发光入射到成像区域，激发荧光分子发出荧光； 4)加热源入射至成像区域，对纳米粒子加热，改变纳米粒子的温度，同时改变纳米粒子周围微环境温度，从而影响与纳米粒子连接的荧光分子的发光特性，荧光强度或者光谱发生改变； 5)撤去加热源，在微纳米尺度上热量扩散速率快，纳米粒子的温度迅速降低，从而实现即时的光调控。8.如权利要求7所述的探测方法，其特征在于，在步骤2)中，分子探针分布在成像区域分为三种方式:a)将结合有分子探针的革E位点组织制作成显微切片，在焚光显微镜下观察；b)通过系统给药或局部给药的方法将分子探针注射或注入到成像区域内；c)将分子探针注射、涂抹或涂敷在成像区域内。9.如权利要求7所述的探测方法，其特征在于，对于多个不同的靶位点，分别选择与其相对应的靶向性分子，并将不同的靶向性分子一一对应地分别连接至不同的纳米粒子，不同的纳米粒子具有不同的吸收峰；当加热源为调控光时，对于不同波长的调控光，与其对应的纳米粒子升温，调控与纳米粒子相连的荧光分子的强度或光谱，从而对于同一种荧光分子，同一种激发光，采用不同的纳米粒子调控，分别对应标记不同的靶位点，即能够实现同一种荧光分子、同一条荧光光路下，利用不同吸收峰对应的外加调控光调控各靶位点的荧光强度，实现对多位点荧光标记的观测和成像。10.如权利要求7所述的探测方法，其特征在于，进一步包括通过提取调控的荧光信号去除背景荧光，包括以下步骤:a)打开激发光光路，荧光分子被激发，荧光探测器对成像区域进行成像，得到调控前图像山)打开加热源，对成像区域进行加热，荧光强度发生改变，荧光探测器再次对成像区域进行成像，得到调控后图像；c)将调控前后的图像进行相减或滤波处理，从而去除大部分背景荧光。
【专利摘要】本发明公开了一种基于纳米粒子微环境温控荧光的分子探针及其系统和方法。本发明通过对纳米粒子微环境温度控制的方法间接调控与纳米粒子绑定的荧光分子发光，实现了一种不改变激发光的分子探针即时调控方法，操作简单易行；采用吸收峰不同的纳米粒子进行调控，分别对应标记不同的靶位点，即可实现在同一种荧光分子、同一条荧光光路下，利用不同吸收峰对应的外加调控光调控各自位置的荧光强度，实现对多位点荧光标记的观测和成像；并且，通过对荧光强度改变前后的图片进行对比，可轻松实现对该分子探针的精确标记定位，特异性好，并且由于背景荧光不受外加加热源调控，将减少背景荧光干扰，提高信噪比，提升空间分辨率，具有可观的应用前景。
【IPC分类】C09K11/06, A61K49/00, G01N21/64
【公开号】CN105300939
【申请号】CN201510617023
【发明人】李长辉, 俞玥, 孟祥溪, 席鹏
【申请人】北京大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月24日