专利名称：克雷伯氏菌属的细菌分离物以及从其中分离的异麦芽酮糖合酶基因的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及细菌分子生物学和重组DNA技术。
2.相关现有技术描述异麦芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖)是一种具有物理特性的还原糖，味似蔗糖。它是蜂蜜中天然存在的蔗糖的结构同分异构体(Sporns et al.，1992)。把异麦芽酮糖当作蔗糖的替代品有以下几点优势(1)它不被导致龋齿的口腔链球菌代谢，不腐蚀牙齿(Minami et al.，1990)；(2)它的摄入对血中糖和胰岛素的浓度影响很小，说明它可以做为肠道外营养物，非糖尿病和糖尿病患者都可以接受(Kawai，et al.，1989)；(3)与蔗糖不同，它在绝大多数细菌和酵母菌中不发酵，在酸性溶液中更稳定，异麦芽酮糖的这些特性便于保持它在发酵食物和饮料中的甜度和味道(Takazoe，1989；Schiweck etal.，1991)；(4)它不具有蔗糖和果糖的吸湿特性，含异麦芽酮糖的食物比含蔗糖的食物更稳定(Takazoe，1989)；(5)在人肠的微生物群区中，它选择性刺激双歧菌的生长(Mizutani，T.1989)。越来越多的证据表明双歧菌有助于保持人体的健康和减缓衰老的过程(Mitsuoka，T.1990)。在日本的食物中，异麦芽酮糖已广泛用做糖的替代品(Takazoe，1989)。利用生化方法把蔗糖转变成异麦芽酮糖，全世界每年的产量超过1万吨(Kunz，1993)。
异麦芽酮糖还是合成表面活性剂和多聚物的原材料。因为每年的蔗糖产量达1亿1千万吨，所以它是世界上最高产的可再生产有机复合物。然而，因为它糖链间的不稳定性和缺乏特异化学反应性，所以利用蔗糖做为化学工业的原材料大大受限(Kunz，1993)。另一方面，异麦芽酮糖是蔗糖的还原性异构体，能被特异性氧化并衍生成不同的化学产品。异麦芽酮糖能成功制备聚酰胺和聚脲(Kunz，1993)。
已知有几个菌种可以把蔗糖转变成异麦芽酮糖。美国专利No.4,359,531描述了生产异麦芽酮糖的过程，包括固定Erwinia rhapontici菌的整个菌体或整个或断裂菌体的溶剂抽提物。大约70-95％的蔗糖转变成异麦芽酮糖。美国专利No.4,390,627描述了从Protaminobacterrubrum固定蔗糖变位酶生产异麦芽酮糖的方法。美国专利No.4,670,387描述了使用Erwinia rhapontici、Protaminobacter rubrum、Serratia plymuthica、Esevinia carotovora var atroseptica、Erwiniadissolvens和Serratia merscescens的固定化菌体生产异麦芽酮糖的发酵过程。大约可以转化70-95％蔗糖。美国专利No.4,857,461公开了从Protaminobacter rubrum、Serratia plymuthica和Erwinia carotovora菌得到的固定化粗酶连续生产异麦芽酮糖的过程。美国专利No.5,229,276和No.5,336,617描述了用Pseudomonas mesoacidophila和Agrobacterium radiobacter菌的固定化菌体生产海藻糖和异麦芽酮糖的过程。
单个酶——异麦芽酮糖合酶(EC5.4.99.10)可以把蔗糖转变成异麦芽酮糖。虽然几种细菌能够把蔗糖转变成异麦芽酮糖，但产量很不稳定，转化率为8-86％(Tsuyuki et al.，1992；Nagai et al.，1994；Huang etal.，1998)。而且，这些生产异麦芽酮糖的菌株不仅把蔗糖转化成异麦芽酮糖和海藻糖还产生2-7％的葡萄糖做为副产品(McAllister et al.，1990；Tsuyuki et al.，1992；Huang et al.，1998)。这是一个值得考虑的工业问题，因为需要复杂的纯化过程去除这些污染的复合物(Sugitani etal.，1993，U.S.Patent No.5,229,276)。一些菌株甚至能够把异麦芽酮糖水解成葡萄糖和果糖。
最近，美国专利No.5,786,140公开了从几种有生物体中分离了蔗糖异构酶的基因。根据纯化的蔗糖异构酶N端的氨基酸序列，使用DNA探针从Protaminobacter rubrum和Enterobacter sp菌中克隆了蔗糖异构酶的基因。利用PCR技术进一步从E.Rhapontici和P.Mesoacidphila菌中分离了蔗糖异构酶的部分DNA序列。
发明简述能够高效生产异麦芽酮糖的细菌和酶对于生物技术的应用和进一步理解酶的机制具有重大的意义。
本发明涉及一个新细菌纯培养株，分类学鉴定为新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)。该菌株具有高效的酶活把蔗糖转变成异麦芽酮糖。
本发明进一步还包括使用此新加坡克雷伯氏菌的固定化菌体生产异麦芽酮糖的过程。与那些以前公开的专利相比，蔗糖的转化率超过99％，异麦芽酮糖的含量超过87％，葡萄糖的含量不到1％。利用功能性克隆方法从新加坡克雷伯氏菌克隆了编码蔗糖异构酶的新基因，与从Enterobacter sp菌分离得到的蔗糖异构酶高度同源，但有几个氨基酸的不同。
附图简述
图1是蔗糖培养基上生长的新加坡克雷伯氏菌菌株的负染电子显微镜照片。
图2是从16S rRNA序列资料分析得到的系统进化树，显示了新加坡克雷伯氏菌菌株的位置。用邻域连接方法得到分枝模型。到下一个节点的数目显示了从1000个数据集得到的引导值百分率。
图3详述了在所选的属于Enterobacteriaceae家族细菌中，根据部分rpoB基因序列资料分析得到新加坡克雷伯氏菌的系统发生位置。
图4显示了在新加坡克雷伯氏菌培养物中异麦芽酮糖和KIS酶的活性。A是24小时细菌生长的详细情况。B是相同时间内KIS酶活性的详细情况。C是相同时间内培养基中检测到的异麦芽酮糖。
图5是从新加坡克雷伯氏菌克隆KIS基因的策略。优选的克隆在LB肉汤培养基中，含5％蔗糖，37℃，200转/分钟培养18小时。用DNS方法(Miller，1959)判定肉汤中的还原糖。pBluescript II SK(+)做为插入片段的克隆载体。
图6A是新加坡克雷伯氏菌KIS基因的核苷酸序列。上游和终止子区的DNA序列用斜体字，开放读码框(ORF)的DNA序列使用正常字体。推测的潜在核糖体结合区(SD)用下横线标示。上游推测的蔗糖可诱导区用双横线标出。螺旋-环-螺旋结合位点的同源序列用框标示。粗体字体表示下游终止位点。图6B是翻译后KIS蛋白的氨基酸序列。推测的蔗糖结合位点用下横线标示。
图7是KIS基因中推测蔗糖可诱导启动子的富AT区相关的同源序列。Kis是新加坡克雷伯氏菌LX3中异麦芽糖合酶的基因。数字表示从转录起始点的距离(bp)，而kis中的数字表示从翻译起始点ATG的距离(bp)。
图8详细比较了kis蛋白与利用蔗糖做底物的其他酶之间推测的蔗糖结合位点间的氨基酸序列。数字表示距离酶N末端的位置。
发明详述从新加坡的土壤样品和甘蔗的根部分离了两株纯菌种LX3和LX21，它们能把蔗糖转化成异麦芽酮糖。
根据以前发表的对克雷伯氏菌的描述(Orskov，1984)，此菌具有如下形态学特征革兰氏染色和氧化酶反应阴性，兼性需氧，杆状，不运动，V.P.实验呈阳性和能够产生芽孢。这些特征与本发明分离得到的菌株一致，说明LX3和LX21菌株应属于克雷伯氏菌。
本发明分离到的菌株与那些已知的克雷伯氏菌株比较，表现型有显著差别，包括产生吲哚，在10℃生长，利用乳糖产生气体和甲基红实验(见表1)。
与从最相关的肺炎克雷伯氏菌分离出菌株的不同点是，肺炎克雷伯氏菌能在44.5℃利用乳糖产生气体，而在10℃却不能生长。表1.比较两种新分离的菌株与相关菌种的表型特征
系统发生分析表明本发明的菌株属于克雷伯氏菌属。最相关的菌属是K.pneumoniae、K.rhinoscleromatis、K.ozaenae和S.liquefaciens。已有人建议如果菌株的相似性不到97％，通常认为不属于相同的菌属。(Stackebrandt and Goebel，1994)。LX3和Klebsiellapneumoniae菌株间16s rRNA的相似性仅94.8％。
克雷伯氏菌属间有许多相似的表型特征。为了解决这些分类问题，利用rpoB基因的序列进行系统进化分析。已发现在Enterobacteriaceae属中不同菌株rpoB基因序列间的趋异进化程度高于它们16s rRNA基因间的趋异进化程度(Mollet et al.，1997)。
在肠菌株中，菌株内比较具有98-100％相似性，而菌株间比较具有2-21.9％的差异。如图3所示，分析rpoB基因的序列能够估计本发明菌株在系统进化中的位置。虽然分析rpoB基因表明与16srRNA序列分析在系统进化中的位置相似，但值得注意的是本发明菌株与其它相关菌株间rpoB基因序列的趋异进化程度高于它们16srRNA基因的趋异进化程度。这些菌株间相似性的范围从88.3％到94.9％。
根据LX3和LX21的生理和系统进化特征，很明显这些菌株不是以前已鉴定的细菌种。所以，建议应把LX3和LX21命名为新的菌种Klebsiella singaporensis sp.Nov。这种新菌种类型命名为LX3T。
异麦芽糖合酶能够催化蔗糖转变成异麦芽酮糖和海藻糖(Cheetham et al.，1982)。新加坡克雷伯氏菌LX3T(菌属)和LX21可以把蔗糖转化成异麦芽酮糖(87.3％)、少量的海藻糖(11.6％)和痕量的葡萄糖(＜1％)。与其它产生异麦芽酮糖的菌株(McAllister et al.，1990；Tsuyuki et al.，1992；and Huang et al.，1998)相比，本发明分离到的菌株产生更多的异麦芽酮糖和较少的海藻糖，并且产生葡萄糖的量尤其少。
Erwinia rhapontici ATCC 29283和Serratia plymuthica ATCC15928(Bucke and Cheetham，1987，U.S.patent No.4,670,387；Egerer etal.，1989，U.S.patent No.4,857,461)是两个可以生产异麦芽酮糖的菌株，新加坡克雷伯氏菌的异麦芽糖合酶酶活明显高于它们的酶活。在相同的生长条件下，新加坡克雷伯氏菌的异麦芽糖合酶酶活分别比Erwinia rhapontici ATCC 29283和Serratia plymuthica ATCC 15928的酶活高43％和19％。这说明了新加坡克雷伯氏菌具有较高的蔗糖转化率。新加坡克雷伯氏菌的固定化菌体几乎可以完全转化蔗糖(99.7％)，而其它已知菌株的蔗糖转化率仅达95％(Bucke andCheetham，1987，U.S.patent No.4670387)。新加坡克雷伯氏菌这种新的细菌菌株具有很重要的工业化生产异麦芽酮糖的潜力。
有趣的是，新加坡克雷伯氏菌的异麦芽糖合酶(KIS)不是固有的表达。含有糖类的果糖可以显著诱导异麦芽糖合酶的表达，包括果糖、蔗糖、棉子糖和异麦芽酮糖。在这些糖中，蔗糖是最有效的诱导剂，棉子糖和果糖次之。当使用其它糖做为碳源时，仅有很低的酶活或检测不到酶活。这与以前报道的基本固有表达异麦芽糖合酶不同(Huang et al.，1998)。
已克隆和鉴定了新加坡克雷伯氏菌编码异麦芽糖合酶的kis基因，其核苷酸序列如图6A(SEQ ID NO.1)所示。本发明包括SEQ IDNO.1(SEQ ID NO.2)本来编码相同氨基酸序列的遗传密码简并性范围内的核苷酸序列。此基因编码598个氨基酸的多肽计算其分子量为69.94kDa。与Enterobacter sp.strain SZ62克隆的蔗糖异构酶进行序列比较说明两者高度同源但在C末端有三个氨基酸的差异。
用功能性克隆法分离编码KIS蛋白DNA的说明如下(a)从供体生物体制备基因库，在适当的宿主生物体中含有具有异麦芽酮糖生物合成活性的DNA编码序列；(b)利用它们增加还原糖的含量从基因库中筛选目的克隆；(c)用异麦芽酮糖生物合成活性分离含有编码蛋白DNA的克隆。在优选的实施例中，用大肠杆菌做为步骤(a)中基因库的宿主菌，最优选的大肠杆菌在进行以上步骤(a)-(c)的时间内不产生大量的还原糖。
在kis基因的上游已鉴定了推定的启动子序列。在大肠杆菌中证实了此启动子的活性，在蔗糖或果糖存在时，它可以诱导kis基因的表达。与其它蔗糖反应区(Yokoyama et al.，1994)比较，在-10区发现了推定的富AT蔗糖反应区(-54TTTTCTTTAATAACAATT-37)[SEQID NO.3]。
异麦芽糖合酶属于葡糖基转移酶家族。比较推测的kis基因氨基酸序列，说明存在潜在的蔗糖结合位点321F-D-L-I-R-L-D-R-D-S-N-E332[SEQ ID NO.4]。已确定天冬氨酸残基对于结合蔗糖及其衍生物葡糖基至关重要。葡糖基转移酶结合位点中的天冬氨酸变成天冬酰胺，酶活降低或完全受到抑制，说明了催化位点中羧基基团的作用(Mooser et al.，1991；Kato et al.，1992；Monchois et al.，1996,1997)。通过比较，看起来KIS酶中327位的天冬氨酸似乎在异麦芽酮糖的生物合成中催化结合蔗糖。在底物结合和催化中，还没有确定第二个高度保守氨基酸325位精氨酸的作用。
本发明的异麦芽糖合酶可以在任何类型细胞中表达，如细菌、植物、哺乳动物、昆虫或真菌细胞，并且本发明包含转化的原核和真核细胞表达KIS。在一个优选的实施例中，利用常规的方法将kis基因转移到细菌如大肠杆菌中，KIS酶在其中表达。在发酵的培养基中这种转化的细菌细胞系可以生产异麦芽酮糖。在另一个优选的实施例中，把kis基因转移到植物细胞中。在培养基中，这种转化的植物细胞能够生产异麦芽酮糖，或者用常规的方法将kis基因导入转基因植物，使其通过转化蔗糖生产异麦芽酮糖。这种植物将是异麦芽酮糖的丰富资源。在这个实施例中优选的植物是甘蔗、玉米、西瓜和甜菜。
使用常规的方法完成细胞转化，如使用在宿主细胞中繁殖的适宜表达载体(如质粒)进行转化，利用机械方法(如粒子轰击、微注射)或本领域已知的其它方法如脂质融合或电穿孔进行转化。转化植物和植物细胞优选的实施例是土壤杆菌属tumefaciens Ti质粒载体，有大量文献实例报道(如美国专利Nos.4,940,838,4,762,785 and5,068,193)。
用土壤杆菌属介导的转化可以得到Ti质粒载体转化，还可以使用其它方法把Ti质粒转入靶细胞中。在优选的实施例中，kis基因插入到表达载体中在原核或真核细胞中扩增，并且本发明包括转化后的原核和真核细胞含有这种载体。在宿主细胞中，适宜的表达载体含有kis编码序列和启动子活性使kis编码序列表达，以及在宿主细胞中维持和/或扩增载体的必需序列。
另外，载体含有使kis基因稳定插入到宿主细胞基因组中的序列，例如Ti质粒的边缘区(c.f.美国专利Nos.4,762,785和5,068,193)，或与宿主基因组交叉或插入的同源区。
在另一个实施例中，kis基因融合信号肽序列。信号肽靶向表达肽到特定的细胞位置，如液泡(Bednarek and Raikhel，1991；Matsuokaand Nakamura，1991)、叶绿体(Van den Broeck et al.，1985)、内质网(Borisjuk et al.，1999)或细胞膜(Okamoto et al.，1991)。在一个优选的实施例中，kis基因与靶向液泡的信号肽序列融合。在另一个实施例中，kis基因与膜附着区编码序列连接，这段序列对酶稳定性很重要(Hsu et al.，1993；Okamoto et al.，1991)。实施例1生产异麦芽酮糖的新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis sp.Nov)的分离、纯化和鉴定。
收集新加坡Clementi森林公园的土壤样品、甘蔗根部和各种过熟的热带水果和甘蔗组织悬浮在灭菌盐水中，再以不同稀释度涂布在蔗糖琼脂平板上。
用于筛选产生异麦芽酮糖的蔗糖琼脂培养基包括(每1000ml)40g蔗糖、5g酵母抽提物、0.5g MgSO4H2O、0.7g KNO3、1gK2HPO4、0.5g NH4Cl、1g NaCl、20g琼脂，用1N NaOH调节pH到7.0。
分离和纯化产生异麦芽酮糖的细菌所有的平板在30℃孵育24小时。蔗糖琼脂板上的每个单克隆菌落一部分转到新蔗糖琼脂板上进一步纯化，另一部分在SPY培养基上孵育过夜。SPY培养基的组成每1000ml中，40g蔗糖、10g蛋白胨和4g酵母抽提物(pH7.0)。
通过在SPY平板上重复划线，从不同样品得到的细菌分离物纯化成均一的单菌落。利用蔗糖做为单一碳源，筛选能够产生还原糖的纯化后细菌分离物。
能够高产还原糖的细菌分离物进一步检测异麦芽酮糖和葡萄糖的产量。能够有效生产异麦芽酮糖和痕量葡萄糖两个细菌分离株LX3和LX21被选定进一步研究。这两株细菌分别来自接近甘蔗根部的土壤样品和新加坡Clementi森林公园的土壤样品。
粗异麦芽糖酶的制备和酶的分析在SPY培养基中孵育过夜后，14000转/分离心10分钟，分别收集沉淀和上清。
上清保存在4℃，用DNS法(Miller，1959)检测还原糖，用薄层层析法(Schwimmer and Bevenue，1956)检测异麦芽酮糖，分析描述如下。细菌沉淀用去离子水洗三次，用pH6.6，原体积的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液悬浮。重悬的菌体分成两部分。一部分直接用于分析全细胞组分的酶活。另一部分超声破碎，14000转/分得到粗蛋白部分和菌体碎屑部分。菌体碎屑部分洗三次并重悬在相同的缓冲液中进行酶学分析。
酶活的检测在0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(pH6.6)中，混合450μl4％的蔗糖与50μl的酶制剂或细菌悬液，37℃孵育15分钟。
用DNS法测定形成的还原糖。一个单位异麦芽糖酶的定义是在以上指定的条件下，1分钟内把蔗糖转变成1μmol还原糖的酶量。
测定大肠杆菌中的酶活的方法相同，只是在大肠杆菌生长LB培养基中补充不同浓度的蔗糖，细菌的悬浮培养基加倍到100pi，蔗糖溶液相应减少到400μl并且反应时间增加到30分钟。
用薄层层析检测细菌产生的异麦芽酮糖。0.5pi的培养基悬液，用DNS法检测还原糖，在TLC平板(多用途聚酯上的硅胶，Aldrich)上点样、显像。溶剂系统是乙酸乙酯-乙酸-水，体积比为4∶3∶0.8。斑点用二苯胺-苯胺-磷酸试剂(Schwimmer and Bevenue，1956)80℃，5min显色。Sigma公司生产的异麦芽酮糖形成典型的绿-黄颜色斑点做为标准对照指示异麦芽酮糖的存在。
超声后上清液中未检测到异麦芽糖合酶活性，仅在沉淀部分中检测到酶活，延长超声时间没有变化。沉淀部分的异麦芽糖合酶活性是19.2U/ml，全细胞组分的酶活是20.1U/ml，二者几乎相等。结果暗示异麦芽糖合酶是细胞壁结合酶。
形态学在蔗糖琼脂培养基上30℃，生长24小时后，用相差显微镜和透射电镜(TEM)检查。透射显微镜检查时，离心后的细菌沉淀用5％(wt/vol)戊二醛和1％(wt/vol四氧化锇固定。
样品埋入环氧树脂用超薄切片机制成超薄切片，用醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，用JEM-1200EX透射电镜检查。
革兰氏染色后用光学显微镜检测细胞形态学，并把固定的标本与活细胞进行形态学比较。
菌株LX3和LX21为革兰氏阴性，不运动，直棒状带圆形末端，单个存在有时成对。菌体直径为0.6-0.8μm，长0.9-2.0μm。没有观察到内生孢子。蔗糖培养基上生长的菌体的大小和形状如
图1所示。这两个菌株的克隆呈圆形、光滑、垫状、完整、不透明、白色，用针检测时有一定粘性。
生理和生化特性细菌分类学工作的生理和生化特性使用基础培养基每1000ml含有0.5g MgSO4，H2O，0.7g Kan03，1g K2HPO4，0.5g NH4Cl，1g NaCl，pH7.0-7.2，加入的碳源见说明。细菌分离物的液体培养基在30℃往复振摇培养。
革兰氏染色特性使用Hucker所述的方法(Doetsch，1981)。
氧化酶活性检测滤纸上1％(wt/vol)的四甲基-p-亚苯二胺，过氧化氢酶活性检测3％(wt/vol)过氧化氢在SPY培养基中孵育18-48小时后观察形成的气泡(Smibert and Krieg，1981)。在基础培养基中加入0.2％(wt/vol)的各种底物，研究利用各种底物生长的情况。
使用以前的方法进行如下检测明胶水解(方法1)，产生吲哚(方法2)，产生hydrogen uide(方法2)，硝酸盐减少和淀粉、酪蛋白和琼脂水解(Smibert and Krieg，1981)。在基础培养基中补充所述的各种糖确定由糖产生的酸(Smibert and Krieg，1981)。
确定细菌分离物的生长条件从5℃到60℃，把分离的新培养物在蔗糖琼脂平板上不同温度分别孵育10天。
生理和生化特性见表2。这两个菌株具有过氧化氢酶和脲酶活性，没有氧化酶、硝酸还原酶和脂肪酶活性。这两个菌株均不能水解明胶、淀粉和纤维素。菌株LX3不能水解酪蛋白，而LX21可以降解酪蛋白。
伏-波试验阳性，但甲基红反应阴性。LX3和LX21是兼性厌氧，有芽孢。它们都能利用柠檬酸和葡萄糖做为唯一碳源，并利用所有测试的碳源产酸产气，碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、果糖、甘油、肌糖、甘露糖、半乳糖和山梨醇。蛋白胨、胰蛋白胨、酵母抽提物、牛肉抽提物、酪蛋白水解产物、KNO3和(NH4)都可以做为氮源维持菌株生长，而尿素不能。菌株不需要特殊的生长因子。
表2.菌株LX3和LX21的特性分离株 LX3LX21直杆状 + +圆形末端 + +直径 0.6-0.80.6-0.8长度 0.9-2.00.9-2.0单个出现 + +成对出现 有时 有时荚膜和粘液层 + +革兰氏染色 - -胞囊和微胞囊 - -球体 - -内生孢子 - -运动性 - -兼性厌氧 + +过氧化氢酶 + +氧化酶脲酶 + +卵磷脂酶 - -脂肪酶 - -利用柠檬酸 + +水解明胶 - -淀粉 - -纤维素 - -酪蛋白 - -葡萄糖做为碳源 + +分解代谢 发酵 发酵从以下物质产生硫化氢半胱氨酸 + +硫代硫酸盐 - -TSI - -M.R. - -V.P. + +硝酸盐还原 - -吲哚产生 - -气体产生 + +酸 + +
由于这些特征把LX3和LX21菌株归为Klebsiella菌属。最接近的菌株为K.oxytoca和K.pneumoniae。但LX3和LX21菌株与K.oxytoca菌株不同之处在于产生吲哚，与K.pneumoniae的不同之处在于可以在10℃生长和在44.5℃利用乳糖产气(表1)。
在实施例3中检查了生理学、生化特性和DNA序列的差异，说明分离的菌株为克雷伯氏菌属新发现的菌种，即新加坡克雷伯氏菌。菌株的类型为LX3T。
Klebsiella singaporensis sp.nov.的说明Klebsiella singaporensis(sin.ga.po.ren′.Sis是新加坡发现，属于新加坡，亚洲一个国家的名字)。
革兰氏阴性兼性厌氧菌，圆形末端直杆菌。不运动，有芽孢。无内生孢子。菌体直径0.5-0.8μm，长度为0.9-2.0μm，单个分布，有时成对出现。在蔗糖琼脂平板上生长时，菌落为圆形、光滑、垫状、完整、不透明、白色，有粘性。产生过氧化氢酶和脲酶，不产生氧化酶和脂肪酶。
伏-波试验阳性，但甲基红反应阴性。硝酸盐没有减少。不发酵明胶、淀粉、纤维素和酪蛋白。不需要特殊的生长因子。可以利用柠檬酸和葡萄糖做为唯一的碳源。无硫化氢产生。利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、果糖、甘油、肌糖、甘露糖、半乳糖和山梨醇产酸产气。最适温度为30℃，最适pH为7.0。DNA中GC含量为56.5％。
菌株类型为LX3T。
实施例2在海藻盐中固定新加坡克雷伯氏菌LX3T，利用固定化菌株LX3T生长在SPY培养基30℃，250转/分振摇16小时生产异麦芽酮糖。每5ml细菌培养基与100ml藻酸混合(2％的培养基粘度)并用注射器滴加0.65％(w/v)CaCl2溶液。持续搅拌溶液，固定化菌体在0.65％(w/v)CaCl2溶液中4℃，4小时，逐渐变硬。
然后，在藻酸盐颗粒中，固定化的菌体孵育在含0.2％(w/v)CaCl2的SPY培养基中，30℃过夜振摇增加菌体密度。
固定化菌体(100ml)填充在200ml柱反应器中。不同浓度的蔗糖溶液，不同保留时间留过柱子。收集洗脱液，用以上所述的方法确定不同条件下所有还原糖和异麦芽酮糖的产量。
固定化新加坡克雷伯氏菌生产异麦芽酮糖新鲜培养的新加坡克雷伯氏菌固定在藻酸盐凝胶中。表3所示，填充在200ml柱反应器中的固定化菌体能够有效生产异麦芽酮糖。当10％的蔗糖溶液以6ml/min的速度留经柱反应器时，蔗糖的转化率最高为99.7％。在这些条件下，异麦芽酮糖的产量为522.8mg/min或31kg/h。蔗糖浓度增加到20％时，可以进一步增加异麦芽酮糖的产量，但蔗糖的转化率降低。增高蔗糖浓度没有获得增高的转化率。
表3.固定化S.Singarporensis生产异麦芽酮糖*蔗糖浓度延迟时间(ml/min) 转化率(％) 产量(mg/min)**2 ND ND10 4 99.7 348.56 99.7 522.82 98.2 343.320 4 96.4 674.06 72.1 756.21 71.8 188.330 2 65.4 342.93 32.7 357.21 67.2 234.940 2 65.1 455.23 34.3 359.7*数据是每次处理两个样品的平均值。**根据异麦芽酮糖在所有还原糖的比例为87.4％，换算异麦芽酮糖的产量。
确定产率洗涤后LX3菌株的菌体在0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液中用4％蔗糖，37℃孵育10分钟。沸水浴加热5分钟，立即终止反应。反应混合物的上清点样于TLC平板并显色。分别切下TLC平板中含有异麦芽酮糖和海藻糖的组分并用蒸馏水抽提。用DNS法确定糖浓度并计算这两种糖的比率。
为了确定反应混合液中葡萄糖的含量，使用葡萄糖分析试剂盒(KitGAHK-20，Sigma)和DNS法分别分析上清中葡萄糖和总还原糖的浓度。用以上的定量资料确定异麦芽酮糖、海藻糖和葡萄糖的比率。
生产酶和异麦芽酮糖在有氧条件下30℃培养菌株LX3T，在基础培养基中补充不同的糖做为唯一碳源，糖的起始浓度相同(1.5％，w/v)，间隔取样测定异麦芽糖合酶、菌体质量和异麦芽酮糖产量。如表4所示，蔗糖、棉子糖或果糖做为唯一碳源时，最高酶活分别是15.12、13.62或11.08U/ml。
麦芽糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、纤维二糖或蜜糖做为碳源时，酶活低于1.7U/ml。异麦芽酮糖还能够诱导产生异麦芽糖合酶，但有蔗糖存在时活性仅有30％。除了果糖，几乎所有测试的单糖，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖不能诱导异麦芽糖合酶的活性。表4.新加坡克雷伯氏菌LX3利用碳源生产生产异麦芽糖合酶。基础培养基组成0.1％蛋白胨，0.2％酵母抽提物，0.05％MgSO4，0.2％NaCl。碳源(1.5％，w/v) 细菌生长(OD600) KIS活性(Umol-1)蔗糖 1.89 15.1葡萄糖1.94 0.0果糖 1.82 11.1棉子糖1.96 13.6异麦芽酮糖1.92 4.5蜜糖 1.88 1.6麦芽糖1.77 1.5甘露糖1.84 0.7乳糖 1.82 0.0木糖 1.97 0.0阿拉伯糖 1.73 0.0半乳糖1.71 0.0甘露醇1.77 1.7纤维二糖 1.83 0.0当分别使用无机化合物如KNO3、尿素或(NH4)2SO4做为唯一氮源时，菌株LX3T生长不好，并且在培养基中没有检测到异麦芽糖合酶活性(表5)。测试所有有机氮源，都能很好维持菌株LX3T的生长，但检测到异麦芽糖合酶活性不同。其中，酵母抽提物和胰蛋白胨能最有效地诱导异麦芽糖合酶活性(表5)。表5.新加坡克雷伯氏菌LX3利用氮源生产异麦芽糖合酶。基础培养基包括1.5％蔗糖、0.02％MgSO4、0.5％NaCl、0.03％K2HPO4。数据是每次处理两个样品的平均值。氮源(1.5％，w/v) 菌生长(OD600) 相对KIS酶活性(％)蛋白胨 1.97 59.2胰蛋白胨 2.13 85.9酵母抽提物 2.33 100牛肉抽提物 2.23 54.4酪蛋白水解产物 2.34 53.9硝酸 0.60 0尿素 0.33 0硫酸铵 0.56 0图4显示了菌株LX3T生产异麦芽酮糖和异麦芽糖合酶的典型图谱。
当蔗糖浓度为10％时，迅速产生异麦芽酮糖，培养7小时后达到最高浓度。从7到22小时，培养基中异麦芽酮糖的浓度基本维持在相同水平，说明菌株LX3T不分解代谢异麦芽酮糖。值得注意，在7小时培养基中细菌生长和异麦芽酮糖活性都没有达到最高水平，而异麦芽酮糖的产生基本停止。一种可能是当培养基中蔗糖的浓度处于低水平时，剩余蔗糖活跃地泵入细胞维持细菌生长。
比较几种菌株的异麦芽糖合酶活性在相同的生长条件下(SPY培养基)，K.singaporensis、Erwinia rhapontici ATCC 29283和Serratiaplymuthica ATCC 15928菌株的相对异麦芽糖合酶活性为100％，57％，和81％。实施例3kis基因的操作、克隆、定位和序列分析DNA操作纯化全基因组DNA，用限制性内切酶消化，DNA连接，琼脂糖凝胶电泳，用标准的操作转化大肠杆菌(Sambrook et al.，1989)或者如试剂制造商推荐。质粒提取用Qiagen的试剂盒按照制造商的指导进行。DNA限制片段使用QIAEX II凝胶抽提试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中回收。
细菌菌株和质粒列于表6。用大肠杆菌DH5α做为克隆的宿主菌。质粒载体pLAFR3和pBluescript II SK(+)分别用于构建基因组DNA文库和亚克隆。大肠杆菌粘粒克隆和亚克隆37℃，需氧生长于Luria-Bertani-蔗糖培养基(每升含胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g和蔗糖50g，pH7.0)。根据需要在培养基中加入四环素(12mg/l)或氨苄青霉素(100mg/l)。
表6.本研究中使用的细菌菌株和质粒菌株基因型或表型标准/来源细菌K.singaporensis LX3T分离自土壤，产生异麦芽酮糖 本研究K.singaporensis LX21分离自土壤，产生异麦芽酮糖 本研究Erw.rhapontici ATCC 29282 产生异麦芽酮糖 ATCCS.plymuthica ATCC 15928 产生异麦芽酮糖 ATCCE.coli DH5αrecAl endAl hsdRl7supE4 gyrA96 Sambrook et al.1989relAlΔ(lac ZYA-argF)U169(80DLACzΔM15)质粒pPLAFR3 克隆载体，四环素抗性实验室保存pBluescript II sk(+)克隆载体，氨苄青霉素抗性StratagenepPLASI164 具有约6.1kb的BamHI/BamHI本研究片段的pLAFR3质粒pSIBB pBluescript II SK(+)质粒的约本研究6.1kb的BamHI/BamHI片段pSIBP pBluescript II SK(+)质粒的约本研究4.8kb的BamHI/PstI片段pSICB pBluescript II SK(+)质粒的约本研究3.6kb的ClaI/BamHI片段pSIBX pBluescript II SK(+)质粒的约本研究3.5kb的BamHI/XhoI片段pSIEE pBluescript II SK(+)质粒的约本研究2.5kb的EcoRV/EcoRI片段DNA的G+C含量使用热变性法(Marmur & Doty，1962)测定基因组DNA中鸟嘌呤加胞嘧啶含量。与克雷伯氏菌株的G+C含量比，菌株LX3和LX21的G+C含量是56.5mol％。
16S rRNA基因序列菌株LX3T(T是菌株类型)和LX21的16SrRNA基因DNA片段对应于大肠杆菌16S rRNA的位置95到1395，使用纯化的基因组DNA扩增，引物组成5′TGACGAGTGGCGGACGGGTG-3′(正向)[SEQ ID NO.5]，5′CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG-3′(反向)[SEQ ID NO.6]。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Germany)纯化扩增产物，并用dRhodamine terminator cycle测序试剂盒(PE Applied Biosystems)和2400型Perkin Elmer GeneAmp PCR System(PE Applied Biosystems)测定序列。用Perkin Elmer ABI PRISM 377 DNA测序仪从两侧测定序列。设计序列分析引物见于表7。至少重复测序两次。利用序列数据库搜索确定与新菌株已知最相关的菌种从GenBank和核糖体数据库项目(RDP II)文库检索最相关菌株的序列。用PILEUP程序(Devereux et al.，1984)进行序列的同源性比较并人为校正比较结果。用PHYLIP程序包中的DNADIST程序(Felsenstein，1989)得到距离模型，并用PHYLIP程序包(V3.5c)(Felsenstein，1989)中的NEIGHBOR程序构建系统发生进化树。使用SEQBOOT，DNADIST，NEIGHBOR和CONSENSE程序(Felsenstein，1989)利用引导(1000次重复)得到组间的统计显著性。表7.用于PCR扩增和菌株LX3和LX21测序的寡核苷酸引物引物代码 序列(5′-3′) 方向1 16sf95 TGACGAGTGGCGGACGGGTG[SEQ.ID NO.7] 正向2 16sr394 CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG[SEQ ID NO.8] 反向3 16sf342 TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA[SEQ ID NO.9] 正向4 16sr616 ATGCAGTTCCCAGGTTGAGC[SEQ ID NO.10] 反向5 16sf605 GAAATCCCCGGGCTCAACCTG[SEQ ID NO.11] 正向6 16SR798 ACATCGTTTACGGCGTGGACTACC[SEQ ID NO.12] 反向7 16sus93 GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG[SEQ ID NO.13] 正向8 16sr119 CCGGACCGCTGGCAACAAAG[SEQ ID NO.14] 反向确定菌株LX3和LX21的16S rRNA基因序列。比较数据库提供的16S rRNA序列，发现菌株LX3和LX21与Klebsiella属的菌株最接近，其次为Serratia和Enterobacter属的eO种。这两个菌株的序列与Klebsiella pneumoniae的序列非常相近，在这些菌株间距离的范围为91.0到94.8t。用于构建系统进化树的资料包括每条序列中的1282个核苷酸，从95到1395位排除了序列间隙和模糊的核苷酸(相应于Escherichia coli序列)。如图2所示，利用相邻连接方法构建系统进化树。菌株LX3和LX21与Klebsiella pneumoniae菌最相关。引导程序分析结果可信度100％证实了菌株LX3与LX21与菌株Klebsiella pneumoniae属于同一类。
但这两个菌株与K.pneumoniae菌不同；LX3与K.pneumoniae的16S rRNA基因序列的趋异值＞5％(表8)。表8.Klebsiella singaporensis sp.nov.与Enterobacteriaceae科其它代表菌株间16s rRNA和rpoB基因的DNA序列的相似性16s rRNA rpoB菌株 GenBank 与 GenBank号 与K.singaporensis号K.singaporensis的rpoB序列相似的16s rRNA序 性(％)列相似性(％)Klebsiella singaporensis 100 100Klebsiella pneumoniae Y17656 94.8 U7744495.0KlebsiellaY17657 94.7rhinoscleromatisKlebsiella terrigena Y17658 93.3Klebsiella planticola Y17659 92.8Klebsiella ozaenaeY17654 94.5Klebsiella ornithinolyticaU78182 93.1 U7744093.9Klebsiella oxytocaY17655 92.4 U7744293.6Serratia liquefaciens AB004752 94.7Serratia macescensM59160 92.2 U7744988.3Serratia rubidaea AB004751 91.5Salmonella typhimuriumU90316 91.2 X0464293.4Salmonella sofia X80677 91.5 U7745293.2Salmonella waycross U92194 91.0Citrobacter werkmanii AF025373 92.6Citrobacter farmeri AF025371 93.1Citrobacter amalonaticus AF025370 93.1Citrobacter rodentunm AF025363 91.8Enterobacter cloacae Y17665 92.9 U7743594.9Enterobacter Z96078 93.1cancerogenusEnterobacter aerogenesAB004750 93.5Enterobacter intermedius AB004747 92.6Enterobacter asburiae AB004744 93.6Enterobacter Z96077 92.4nimipressuralisErwinia wasabiae U80199Erwinia cypripediiU80201 91.5Escherichia coli Z80725 90.8 V00340 94.9Salmonelia typhi AF008577 92.8Citrobacter freundii U77434 95.5Salmonella arizonae U77447 92.0Salmonella paratyphi U77450 93.0Salmonella shomron U77451 92.4Yersinia enterocolitica U77453 85.5
菌株LX3和LX21的部分rpoB基因DNA，这部分基因代表了这个基因最易变的部分，通过测定序列确定这两株菌在Enterobacteriaceae家族中系统进化的位置。菌株LX3和LX21的序列与数据库提供的Enterobacteriaceae家族rpoB序列比较，得到相似的模型。如图3所示，系统进化的位置与属于Klebsiella属的菌株非常相关。最接近的菌株是K.pneumoniae，但有5％的趋异值(表8)。RpoB的扩增及测序菌株LX3和LX21编码RNA聚合酶beta亚单位(rpoB)基因的DNA，对应于大肠杆菌rpoB的第1468到2114位，根据已发表的大肠杆菌(GenBank V00340)、Salmonella typhimurium(X04642)、Pseudomonas putide(X15849)和Klebsiella pneumoniae(U77443)序列的同源区为参照设计配对引物进行PCR扩增，其正向引物为5′-CAGTTCCGCGTTGGCCTG-3′[SEQ ID NO.15]，反向引物为5′-CGGTTGGCGTCATCGTGTTC-3′[SEQ ID NO.16]。如上所述，进行PCR产物的纯化和测序。使用与16S rRNA相同的处理和程序分析rpoB的系统进化。
Kis基因的克隆和测序用BamHI部分消化Klebsiellasingaporensis菌的基因组DNA，连接到粘粒载体pLAFR3的BamHI位点在体外用Gigapack II(Stratagene)包装后转化大肠杆菌构建基因组DNA文库。在含四环素的LB琼脂平板上37℃孵育过夜筛选转化的大肠杆菌DH5a。粘粒克隆孵育补充蔗糖的LB培养基，24小时后使用DNS法(Miller，1959)检测肉汤培养基中形成的还原糖。用薄层层析鉴定细菌培养基中的异麦芽酮糖。选择装有kis基因的克隆，用BamHI消化后纯化6.1kb的片段。使用ABI PRISMdRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(PEApplied Biosystem)，利用末端终止法从两条链测序pSIEE克隆。测序引物列于表9。用DNAStar测序进行序列分析和比较。用BLAST计算程序(Altschul et al.，1997)搜索同源性。表9.kis基因DNA测序引物引物(方向) 序列SI-1(F)5′-CCCGCTGGCAATATTTCTGACT3′[SFQ ID NO.17]SI-2(R)5′-CACGACCACTACCCTTTCTCCTGA-3′[SEQ ID NO.18]SI-3(F)5′-CCTCGCCTCATTTAAAGACACCAA3′[SEQ ID NO.19]SI-4(R)5′-TAGGCGCCATATACCAGAGCAG-3′[SEQ ID NO.20]SI-5(F)5′-CGTGACTATTATTTCTGGCGTGAC-3′[SEQ ID NC.21]SI-6(R)5′-CGTCGCCCGCTGAGTGAGGTAA-3′[SEQ ID NO.22]SI-7(F)5′-TAGATAACCATGACAACC-3′[SEQ ID NO.23]SI-8(R)5′-GCGGTGGCCACATCATACC-3′[SEQ ID NO.24]SI-9(F)5′-CGCCGTTTATTTATCAAGGTTCAG-3′[SEQ ID NO.25]SI-10(R) 5′-GGAGCATTGCCGTAAAGAT-3′[SEQ ID NO.26]SI-11(F) 5′-CTATACTCTCCCGGCTAATGATGC-3′[SEQ ID NO.27]SI-12(R) 5′-CCACCATGCAGGATATTCACTTT-3′[SEQ ID NO.28]筛选Klebsiella singaporensis粘粒库中的异麦芽酮糖生物合成活性。
得到两个阳性粘粒克隆，称为pPLASI164和pPLASI169，通过它们能产生还原糖，用TLC分析证实异麦芽酮糖。这两个克隆的限制性酶分析发现用BamHI消化得到相同大小1kb的片段。
进一步证实这两个菌株pPLASI164和pPLASI169的限制性酶切图谱相同。如图5所示，这个6.1kb的片段含有一个PstI位点、一个ClaI位点、一个XhoI位点和两个EcoRV位点。删除分析限定编码异麦芽酮糖生物合成的区域于克隆pSIEE EcoRV酶切得到的2.5kb片段。
从两个DNA链确定克隆pSIEE的核苷酸序列(Fig.6A)。查找开放读码框架(ORF)发现存在一个1797bp核苷酸的ORF。删除分析表明这是异麦芽糖合酶基因kis的编码区。推测的ATG起始密码子与潜在核糖体结合序列(AAGGA)间隔8个碱基。与-35启动子元件(TTGACA)没有明显同源。可能的-10区启动子序列(TTTAAT)与大肠杆菌o70的启动子序列(TATAAT)同源，位于启动子上游44bp处。推定的蔗糖反应区(-SqTTTTCTTTAATAACAATT-37)[SEQ ID NO.3]富含AT，也位于-10区，与几种蔗糖诱导启动子的保守蔗糖反应区同源(图7；Yokoyama et al.，1994).证实存在蔗糖和果糖时kis基因的诱导表达，而当葡萄糖做为唯一碳源时没有kis基因表达。推定的核心序列″CAACTG″，螺旋-环-螺旋转录因子的结合基元(Murre et al.，1989；Rocha and Gomes，1998)位于起始密码子上游21bp(图6A)。下游有三个TCTC盒、一个TCTT盒和一个TGTG盒，与因子独立终止位点的TCTG同源序列极相似。在推定终止密码子(TAA)下游也发现反转重复序列。这会形成一个潜在的稳定发夹结构，阻止RNA聚合酶通过。(Brendel and Trifonov，1984).
从K.singaporensis克隆的kis基因编码598氨基酸的蛋白，计算其分子量为69.94kDa，等电点为6.62(Fig.6B)。亲水性氨基酸占所有氨基酸的68.4％。Enterobacter sp.strain SZ62(Mattes et al.，1998美国专利No.5786140)的异麦芽糖合酶与kis基因同源性最近，在ORF中有99.3％的同源性核苷酸，在预测的多肽序列中有99.7％的相同氨基酸。蛋白的C末端区不同。KIS有一个多余的氨基酸，577位的丙氨酸，和菌株SZ62的异麦芽糖合酶有两个位点发生取代，Gly577和Ala593分别被Ala578和Val594取代。另外，KIS蛋白与Protaminobacter rubrum相同的酶有67％的同源(Mattes，et al.，1998美国专利No.5786140)。
与α-葡糖基转移酶鉴定的位点序列同源性比较后，确定潜在的蔗糖接触反应结合位点F-D-L-I-R-L-D-R-D-S-N-E332″[SEQ ID NO.4](Fig.8)。
在这个基元中，两个氨基酸精氨酸和天冬氨酸高度保守。天冬氨酸(D)在酶活中起关键作用，突变后完全抑制了蔗糖结合特性(Mooser et al.，1991；Kato et al.，1992；Monchois et al.，1997)。参考文献Altschul SF，Madden TL，Schaffer AA，Zhang JH，Zhang Z，MillerW，Lipman DJ.1997.Gapped Blast和PSI-Blast新一代蛋白数据库查找程 序核酸研究.253389-3402.
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权利要求
1.一种命名为LX3的克雷伯氏菌菌属的菌株。
2.一种命名为LX21的克雷伯氏菌菌属的菌株。
3.编码KIS蛋白的核苷酸序列，包含SEQ ID No.1的序列。
4.由核苷酸序列SEQ ID No.1编码的异麦芽糖合酶，包含SEQID No.2的序列。
5.在遗传编码简并性范围内，相应于来自权利要求3的SEQ IDNo1的核苷酸序列。
6.与任何来源的信号肽编码区融合的相应于来自权利要求3的SEQ ID No1的核苷酸序列。
7.含有权利要求3的核酸分子的表达载体，其中该表达载体在原核或真核细胞中增殖。
8.使用权利要求7的表达载体转化或转染的原核或真核细胞。
9.在植物中生产异麦芽酮糖的方法，此方法包括向这种植物的细胞中导入编码转化蔗糖成异麦芽酮糖的酶的核酸序列，以此方式使细胞表达所述核酸序列。
10.权利要求9的方法，其中所述核酸序列包括来自权利要求3的SEQ ID No1，其融合或不融合任何来源的信号肽编码区。
11.权利要求9的方法，其中所述核酸序列包括来自权利要求3的SEQ ID No1，其融合或不融合任何来源的靶向液泡的信号肽编码区。
12.权利要求9的方法，其中所述核酸序列包括SEQ ID No1，其掺入或没有掺入任何来源的膜附着区的编码区。
13.权利要求9的方法，其中所述核酸序列包括在遗传编码简并性范围内相应于来自权利要求3 SEQ ID No1的核苷酸序列，其掺入或没有掺入任何来源的膜附着区的编码区。
14.权利要求9的方法，其中所述核酸序列包括在遗传编码简并性范围内相应于来自权利要求3的SEQ ID No1的核苷酸序列，其融合或不融合任何来源的信号肽编码区。
15.权利要求9的方法，其中所述蛋白包含SEQ ID No2，其融合或不融合任何来源的信号肽。
16.权利要求9的方法，其中所述蛋白包含SEQ ID No2，其掺入或没有掺入任何来源的膜附着区。
17.权利要求9的方法，其中的植物优选自甘蔗、玉米、西瓜和甜菜。
18.分离权利要求3中DNA的功能克隆方法，其中该DNA编码具有产生异麦芽酮糖活性的蛋白，所述方法包括如下步骤(a)从供体生物体制备基因库，其含有编码在适当的宿主生物体中的异麦芽酮糖生物合成活性的DNA序列；(b)利用它们的增加的还原糖含量从基因库中筛选目的克隆，以及(c)分离含有编码具有异麦芽酮糖生物合成活性的蛋白的DNA的克隆。
19.权利要求18的方法，其中使用大肠杆菌做为宿主生物体。
20.权利要求19的方法，其中制备基因库、筛选克隆和分离克隆一种大肠杆菌菌株中进行，该菌株在规定时间段内不产生大量的还原糖。
全文摘要
本发明涉及一种新菌种的两个菌株，即新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)LX3及LX21。本发明还涉及编码一种新型异麦芽酮糖合酶KIS的核苷酸序列(kis)。还涉及在植物中产生异麦芽酮糖的方法，此方法包括在该植株细胞中引入一种编码将蔗糖转化成异麦芽酮糖的酶的核酸序列，从而使得转化细胞表达所述的核酸序列。本发明还涉及用于分离编码KIS蛋白的核苷酸序列的功能克隆方法，包括步骤(a)从供体生物体制备基因库，其含有编码在适当的宿主生物体中的异麦芽酮糖生物合成活性的DNA序列；(b)利用它们的增加的还原糖含量从基因库中筛选目的克隆；(c)分离含有编码具有异麦芽酮糖生物合成活性的蛋白的DNA的克隆。
文档编号A01H1/00GK1434861SQ00819035
公开日2003年8月6日 申请日期2000年2月15日 优先权日2000年2月15日
发明者张炼辉, 李宪臻, 张道海 申请人:分子农业生物学院