专利名称：一种抗果蔬病原菌活性肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及复合酶分段定向酶解牡蛎制取抗果蔬病原菌活性肽的方法。本发明产品以海洋生物为原料进行酶解制备，安全、无毒、抗菌性强，可用于果蔬采后病害的生物防治。
背景技术：
新鲜果蔬采收以后，病害引起的腐烂损失是导致果蔬品质下降的最主要因素。据果蔬产业资料统计，由于我国保鲜产业落后，每年约有8000万吨的果蔬腐烂，总价值近750亿元，采后损失非常严重。为减轻果蔬腐烂，目前多采用冷藏结合化学杀菌剂处理，但化学杀菌剂的大量使用，导致病原微生物产生耐药性，并引发环境污染、食品安全、致畸致癌等多种问题，且部分化学杀菌剂在一些国家已被禁用，因此寻求安全无毒的生物防治技术显得十分必要。
抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是生物体内存在的自然抗病物质，是宿主免疫防御系统的组成部分。AMPs的广谱抗菌性、不易导致微生物耐药性及对生物体本身无毒等特性正日益引起生物学家的广泛关注。AMPs串珠镰刀菌(Fusarium Moniliforme)、青霉菌(Penicillium sp.)、木霉菌(Trichoderma sp.)、灰霉葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、疫霉菌(Phytophthora infestans)等多种植物真菌均具有抗性。对果蔬采后病原菌青霉菌(Penicillium digitatum、Penicilliumitalicum)、葡萄孢霉菌(Botryis cinerea)等也显著的抑制作用。虽然AMPs具有广谱抗菌性，但其来源不足限制了对其抗菌特性的进一步研究。海洋生物资源丰富，不但蕴含着丰富的营养物质，而且蕴含着丰富的活性物质。近年来，随着海洋生物技术的发展，已有不少关于从海洋生物中提取抗菌肽的报道。牡蛎是世界上的第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一，资源较为丰富。因此，以牡蛎为原料酶解制备抗菌肽，不但为果蔬采后病害防治提供新的途径，还可提高养殖贝类的附加值，促其可持续发展。
目前，尚未见到酶解海洋贝类制备抗果蔬病原菌活性肽的报道。
发明内容
本发明的目的本发明提供一种安全无毒、抗菌性强、可防治果蔬采后青霉病和灰霉病的海洋生物抗菌肽。
本发明的技术方案(1)酶解液的制备。本发明以新鲜牡蛎肉为原料，去壳取肉匀浆，用Tris-HCl缓冲液调pH值至8.5，加入600 UAlcalase 2.4L/g肉，底物与提取液比为1∶3，50℃条件下水解3h，后调节pH值至5.5，加入700U菠萝蛋白酶/g肉，相同条件下继续水解3h。然后在100℃灭酶10min，酶解液在9000r/min条件下离心15min，收集上清液即为酶解粗提液。(2)酶解液中抗菌肽的分离纯化。采用分子量为5K，10K的超滤膜对酶解粗提液进行超滤，旋转蒸发仪浓缩后，收集活性成分，冷冻干燥即为本发明产品。经抗菌和抗病试验表明，此产品对果蔬采后病原菌青霉菌、灰霉菌具有显著的抑菌活性，最小抑菌浓度分别为140μg·mL-1和120μg·mL-1。常温条件下，油桃青霉病和草莓灰霉病发病率分别比对照低21％和32％。
有益效果因为本发明是以食用牡蛎为原料经酶法水解制备而成，安全，无毒，抗菌性强，可替代化学杀菌剂用于果蔬的病害防治，避免了化学杀菌剂引发的环境污染、食品安全、致畸致癌等多种问题，而且提高了牡蛎的附加值，促进了养殖业的持续发展。
具体实施例方式新鲜牡蛎→去壳取肉→匀浆→缓冲液调pH至8.5→加入Alcalase 2.4L，50℃水解3h→调节pH至5.5→加入菠萝蛋白酶，50℃水解3h→灭酶(100℃，5min)→离心(4000r/min，15min)→旋转蒸发仪浓缩→超滤(膜孔经5K，10K)→旋转蒸发仪浓缩→冷冻干燥→产品。
本产品为白色至淡黄色粉末状物质，使用时可配制成一定浓度的抗菌肽溶液对新鲜水果或蔬菜进行喷施或浸泡处理，自然风干后冷库贮藏。
权利要求
1.一种抗果蔬病原菌活性肽的制备方法。以新鲜牡蛎肉为原料，去壳取肉匀浆，用Alcalase2.4L和菠萝蛋白酶分段酶解，离心，收集上清液浓缩。后采用分子量为5K和10K的超滤膜进行超滤，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥后即为抗菌肽产品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于酶解原料为海洋贝类。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于酶解过程中先加Alcalase 2.4L，再加菠萝蛋白酶进行分段酶解。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于Alcalase 2.4L的酶解条件为pH值8.5，加酶量600UAlcalase 2.4L/g肉，底物与提取液比为1∶3，酶解温度50℃，酶解时间3h；菠萝蛋白酶的酶解条件为pH值5.5，加酶量700U菠萝蛋白酶/g肉，底物与提取液比为1∶3，酶解温度50℃，酶解时间3h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于制备过程中以抗果蔬病原菌青霉菌和灰霉菌为靶标，实施定向酶解和纯化。
全文摘要
一种抗果蔬病原菌活性肽的制备方法，其产品具有抗果蔬病原菌特性，可替代化学杀菌剂用于果蔬采后病害的生物防治。其特征是以青霉菌和灰霉菌为靶标，采用Alcalase 2.4L和菠萝蛋白酶定向酶解牡蛎，经分离纯化制备而成。该抗菌肽对果蔬病原菌青霉菌和灰霉菌具有显著的体外抗菌作用，对油桃青霉病和草莓灰霉病具有显著的抑制作用。采用本发明制备的天然抗菌剂，成本低，安全性高，适于工业化生产。
文档编号A01P3/00GK101020916SQ200610136478
公开日2007年8月22日 申请日期2006年10月23日 优先权日2006年10月23日
发明者刘尊英, 曾名湧, 董士远, 徐杰, 宋宏霞 申请人:中国海洋大学