专利名称：：表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS及其工程菌的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地说，涉及一种表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS及其工程菌。
背景技术：
：Harpin胃θHt·_帛_胃巾hrp■@(hypersensitivereactionandpathogenicitygenecluster)中的某些(或某个)基因编码的一种蛋白质，为非特异性激发子，在非寄主植物中能诱导植物抗病性，还能启动植物的多种信号传导途径，例如通过水杨酸(salicylicacid,SA)信号途径诱导植物产生系统获得抗病性(systemicacquiredresistance,SAR)，通过乙烯调节信号途径促进植物生长和抗逆性，通过茉莉酸(jasmonicacid,JA)调节信号通路诱导抗虫性。1992年美国康乃尔大学的Dr.ZhongminWei首次发现了梨火疫病菌(ErwiniaamylOVOra)hrp基因簇中的hrpN基因产物与植物的过敏性反应(HR反应)有关，并将hrpN基因编码的蛋白命名为HarpinEa。迄今，已经从多种植物病原细菌中发现了编码Harpin的基因，例如HarpinEa，由梨火疫病原菌欧文氏菌(Erwiniaamylovora)的hrpN编码；Harpinpss，由丁香单Ifi丁香至文病$禾中(Pseudomonassyringaepv.syringae)白勺hrpZ编码；HarpinRS,才古胃(Ralstoriasolanacearum)白勺popA|S石马；HarpinXoo,τΚ禾g白叶枯病原菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的hrfl编码；HarpinXooc，由水稻细菌性条斑病病原菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)的hrf2编码。其中，后两种Harpin蛋白(HarpinXoo和HarpinXooc)及其编码基因hrfl和hrf2是申请人所在的分子植物课题组从水稻黄单胞两个致病变种中克隆鉴定的，并已获得授权专利(ZL00135403.5)。十五期间在国家863计划(2001AA246013)的资助下，课题申请人已将编码HarpinXoo和HarpinXooc的基因hrfl(GenBankAY205561)和hrf2基因(GenBankAY875714)分别克隆于大肠杆菌表达载体pET30a(+)(Novagen)上，构建了Harpin蛋白大肠杆菌表达载体pET30a(+):hrfl和pET30a(+):hrf2，并将构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)中，最终构建成了能够诱导表达Harpin蛋白的大肠杆菌基因工程菌。通过多种廉价的简单糖类诱导和筛选，多数培养基均可以诱导表达Harpin蛋白，其中以工程菌BL21/pET30a(+):hrf2在乳糖的诱导下Harpin蛋白的表达效率最高，总蛋白含量达40%左右，在发酵液中达到近lg/L。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是重要的植物促生长根围细菌(PlantGrowth-PromotingRhizobacteria,PGPR)，在植物病害生物防治中起着重要的作用，目前已有多种商品化的枯草芽孢杆菌制剂在农业生产中大面积使用并取得了较好的抗病和增产效果。Harpin蛋白的研发被誉为植物生产和食品安全的一场绿色化学革命，而枯草芽孢杆菌是目前仅有的几种可用于绿色蔬菜A级和AA级生产的微生物农药之一，将二者结合起来开发一种绿色环保多功能的生物制品，在大田和保护地应用，必定能够有效促进植物生长、防治植物病虫害、提高植物产量，但是目前未见相关报道。
发明内容本发明的目的在于提供表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS，本发明的另一目的在于提供表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌，并将其开发成一种绿色、环保、多功能的生物制品，用于促进植物生长、防治植物病虫害、提高作物产量。上述目的是通过如下技术方案实现的一、构建表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS(1)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物aprE_l和aprE_2扩增aprE基因及其两侧序列2815bp，扩增的程序为:95°C，4min；94°C,45s；55°C,30s；72°C,2min；30个循环；72°C，IOmin；将扩增的片段与pGEM-T-esay克隆载体连接，成功构建pGEM-easy-T-aprE；aprE-1ATAGTAAGGGCAGCATCAACC；aprE-2CGGTCGTGATTGATCCTTTATA；(2)以本实验室自行设计的枯草芽孢杆菌_大肠杆菌Harpin蛋白穿梭表达载体pM43HF质粒(ffuHuijun,ShuaiWang,JunqingQiao,JunLiu,JiangZhan,andXuewenGao.2008.ExpressionofHpaGXoocProteininBacillussubtilisanditsBiologicalFunctions.J.Microbiol.Biotechnol.doi:10.4014/jmb.0802.154.)为模板，引物P43-1(HapI)和Hrp_2(ClaI)扩增p43+SP+hrf2基因序列，大小为813bp。引物P43-1(HapI)和Hrp-2(ClaI)分别在扩增序列两端引入HapI和ClaI酶切位点，扩增的程序为95°C，4min；94°C，45s；62°C，30s；72°C,Imin；30个循环；72°C,IOmin；将扩增的片段经过HapI和ClaI双切后与pGEM-T-esay-aprE载体连接，成功构建pGEM-easy-T_aprE-p43sphrf2中间载体；P43-I(HapI)AACTGATAGGTGGTATGTTTTC；Hrp-2(ClaI)TTTTATCGATCTATTACTGCATTGATGCGC；(3)以质粒pIC333为模板，用引物spe-l_lox66和引物spe-2-lox71扩增含有Iox序列位点的抗生素(壮观霉素Spectinomycin)标记基因序列，引物spe-l-lOX66和spe-2-lox71分别在扩增序列两端引入1οχ66和1οχ71位点，扩增的程序为:95°C,4min；940C，30s；62°C，30s；72°C，2min；30个循环；72°C，IOmin；扩增获得的Ioxspec编码基因片段大小为1438bp；spe-l"lox66:TACCGTTCGTATMTGTATGCTATACGMGTTATGCTCAGTGGMCGAAMCTCACG；spe-2-lox71:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGMGTTATMGGTGGATACACATCTTGTCA；将上述Pfu酶扩增的抗生素筛选基因以平末端的方式与以HpaI限制酶酶切的中间载体pGEM-easy-T-aprE-p43sphrf2连接，成功构建出表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS。表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS的图谱如图1所示，构建流程如图3所示。二、构建表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/AHN(一)、构建枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK(1)以质粒pBT2-arcA为抗生素lox-km序列的供体载体，利用pstl限制酶酶切，并回收lox-km片段，将之与常见克隆载体pUC18相连接，成功构建中间克隆载体ρΜ；(2)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物nrpE-Ll-blunt(EheI)和nrpE-L2(sphl)扩增nprE基因部分及其左侧序列共1492bp，扩增的程序为95°C，4min；94°C，45s；62°C，30s；72°C，2min；30个循环；72°C,IOmin；将扩增的片段与(1)的中间克隆载体PUK连接，成功构建中间克隆载体pUKN-L；nrpE-Ll-blunt(EheI):TCACTGTTGTCTGAATCCCTTG；nrpE-L2(sphl):AAAAAGCATGCACCTAAACCCACAATAAATCCC；(3)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物nrpE2274Rl(Sail)和nrpE3662R2(KpnI)扩增nprE基因部分及其右侧序列共1388bp，扩增的程序为95°C，4min；94°C，45s；62°C，30s；72°C，2min；30个循环；72°C,IOmin；将扩增的片段用SalI、KpnI双酶切后与(2)的中间克隆载体pUKN-L连接，成功构建枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体PUNprEK；枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK的图谱如图2所示，构建流程如图4所示；nprE2274Rl(SalI):AATCGTCGACCTCGCCTATGATGTAAC；nprE3662R2(KpnI):AAGGTACCATGTACAATGGAACATGGC。(二)、构建表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌FZB42/ANHSK选择促生和生防优秀的可遗传转化菌株枯草芽孢杆菌FZB42为工程菌起始菌株，采用化学感受态转化方法，先将表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS转化枯草芽孢杆菌FZB42，重组载体pGAprEHS通过双交换同源重组到枯草芽孢杆菌染色体上的碱性蛋白水解酶aprE基因位点，得到中间工程菌FZB42/AHS；然后将枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体PUNprEK转化入中间工程菌FZB42/AHS中，敲除了工程菌中的另一个中性蛋白水解酶nprE基因，成功构建出表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌FZB42/ANHSK。工程菌FZB42/ANHSK由于一方面能够表达和胞外分泌Harpin蛋白，另一方面又缺失了能够降解蛋白的碱性蛋白水解酶aprE和中性蛋白水解酶nprE，因此其所表达的Harpin蛋白分泌到胞外后被降解的能力下降，更有利于Harpin蛋白量的积累。(三)、构建表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/AHN将表达重组酶蛋白Cre的质粒pBRl_Cre转化(二)的工程菌FZB42/ANHSK，通过低温表达去除其中的抗生素标记基因，最终成功构建出表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH，由于不带有任何抗生素标记基因，工程菌FZB42/ANH对环境和人畜更加安全、友好。(四)、表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/AHN胞外外泌Harpin蛋白的SDS-PAGE电泳和westernblot免疫印迹杂交将表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/AHN于发酵培养基(2.5%酵母粉，1.5%胰蛋白胨，0.3%磷酸钾，PH7.2)中发酵48小时；取发酵液2ml，离心3min，然后以5%的TCA沉淀法浓缩50倍至40ul；分别取IOul和20ul跑SDS-PAGE电泳，并分别取IOul和20ul与纯harpin蛋白的抗体做westernblot免疫印迹杂交，结果如图5所示，可见15kDa左右有特征性的harpin蛋白条带。三、制备表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH的生物制品在发酵罐中配制发酵培养基每升培养液中含1020g葡萄糖或1020g蔗糖或2535g玉米浆、0.5Ig酵母提取物、0.5g谷氨酸钠、0.5gMgS04、0.5gKClUgKH2PO4,0.15mgFe2SO4·6Η20、5·OmgMnSO4·H20,0.16mgCuSO4·5H20，调pH范围至6·87·0，力口水至IL；按发酵培养基体积的2%加入种子菌，温度30°C37°C，转速300800r/min，溶氧30%，发酵3036h，发酵结束后直接利用发酵液为生物制品或发酵液离心收集芽孢，收集的芽孢经真空干燥，加入质量比99%的玉米淀粉即制成表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH的生物制品。将上述表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH的生物制品稀释至浓度为(15)X106-(l5)X108cfu/ml，然后用其进行植物种子处理，灌根或喷施植物表面13次，可以明显促进植物生长和防治植物病害，并显著提高植物产量。与现有技术相比，本发明具有如下优点和积极效果1、首次提供了表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS和表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH；2、本发明的表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH,既能够表达和胞外分泌Harpin蛋白，又缺失了能够降解蛋白的碱性蛋白水解酶aprE和中性蛋白水解酶nprE，因此其所表达的Harpin蛋白分泌到胞外后被降解的能力下降，更有利于Harpin蛋白量的积累；另一方面，工程菌FZB42/ANH中的抗生素标记被切除，对环境更加友好；3、首次将表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH投入生产使用，明显具有促进植物生长和防治植物病虫害的作用，显著提高了植物产量，是一种多功能、环境友好的新型生物制品。下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。图1表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS的图谱；图2枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK的图谱；图3表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS的构建流程图；图4枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK的构建流程图；图5表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH胞外外泌全蛋白的SDS-PAGE电泳和westernblot免疫印迹杂交；图6实施例6中表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH生物制品以及清水和FZB42对于番茄的促生效果比较图。具体实施例方式以下实施例是本发明的几个优选实施方式，但并非是对本发明的进一步限定，根据本发明的上述内容作出其他形式的变更、替换等均属于本发明的范围。实施例1构建枯草芽孢杆菌Harpin蛋白表达载体pGAprEHS(1)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物aprE_l和aprE_2扩增aprE基因及其两侧序列2815bp，扩增的程序为:95°C，4min；94°C,45s；55°C,30s；72°C,2min；30个循环；72°C，IOmin；将扩增的片段与pGEM-T-esay克隆载体连接，成功构建pGEM-easy-T-aprE。aprE-1ATAGTAAGGGCAGCATCAACCaprE-2CGGTCGTGATTGATCCTTTATA(2)以本实验室自行设计的枯草芽孢杆菌_大肠杆菌Harpin蛋白穿梭表达载体PM43HF质粒为模板，引物P43-1(HapI)和Hrp_2(ClaI)扩增p43+SP+hrf2基因序列，大小为813bp，扩增的程序为:95°C,4min；94°C,45s；62°C,30s；72°C,Imin；30个循环；72°C,IOmin；将扩增的片段经过HapI和ClaI双切后与pGEM-T-esay-aprE载体连接，成功构建pGEM-easy-T-aprE-p43sphrf2中间载体。P43-1(HapI)AACTGATAGGTGGTATGTTTTCHrp-2(ClaI)TTTTATCGATCTATTACTGCATTGATGCGC(3)以质粒pIC333为模板，用引物spe-l_lox66和引物spe-2-lox71扩增含有Iox序列位点的抗生素(壮观霉素)标记基因序列，扩增的程序为95°C，4min；9430s；62°C,30s；72°C,2min；30个循环；72°C，IOmin；扩增获得的Ioxspec编码基因片段大小为1438bp；spe-l-lox66:TACCGTTCGTATMTGTATGCTATACGMGTTATGCTCAGTGGMCGAAMCTCACG；spe-2-lox71:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGMGTTATMGGTGGATACACATCTTGTCA；将上述Pfu酶扩增的抗生素筛选基因以平末端的方式与以HpaI限制酶酶切的中间载体pGEM-easy-T-aprE-p43sphrf2连接，成功构建表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS(图1)。实施例2构建枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK(1)以质粒pBT2-arcA为抗生素lox-km序列的供体载体，利用pstl限制酶酶切，并回收lox-km片段，将之与常见克隆载体pUC18相连接，成功构建中间载体ρΜ；(2)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物nrpE-Ll-blunt(EheI)和nrpE-L2(sphl)扩增nprE基因部分及其左侧序列共1492bp，扩增的程序为95°C，4min；94°C，45s；62°C，30s；72°C，2min；30个循环；72°C,10min；将扩增的片段与pUK中间克隆载体连接，成功构建pUKN-L。nrpE-Ll-blunt(EheI)TCACTGTTGTCTGAATCCCTTGnrpE-L2(sphl):AAAAAGCATGCACCTAAACCCACAATAAATCCC(3)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物nrpE2274Rl(Sail)和nrpE3662R2(KpnI)扩增nprE基因部分及其右侧序列共1388bp，扩增的程序为95°C，4min；94°C,45s；62°C,30s；72°C，2min；30个循环；72°C,IOmin；将扩增的片段Sail、KpnI双切后与pUKN-L中间克隆载体连接，成功构建枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK。nprE2274Rl(SalI):AATCGTCGACCTCGCCTATGATGTAACnprE3662R2(KpnI):AAGGTACCATGTACAATGGAACATGGC实施例3构建表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH选择促生和生防优秀的可遗传转化菌株枯草芽孢杆菌FZB42为工程菌起始菌株，采用化学感受态转化方法，将实施例1的Harpin蛋白表达载体pGAprEHS转入FZB42菌株中，得到中间工程菌FZB42/AHS；接着将实施例2的nprE基因定点突变载体pUNprEK转化入中间工程菌FZB42/AHS中，构建表达Harpin蛋白的工程菌FZB42/ANHSK；最后将能够表达重组酶蛋白Cre的载体pBRl-Cre转入工程菌FZB42/ANHSK中，切掉其中的抗生素标记基因，成功构建出目的工程菌一表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH。在含有30%甘油的Landy培养基中于_70°C保存。实施例4制备表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记生物工程菌FZB42/ANH生物制品取出实施例3中于_70°C保存的表达Harpin蛋白的芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH，首先在Landy平板上活化，然后将活化的基因工程菌接种到含有Landy液体培养基的三角瓶内，于温度33°C、转速200r/min的条件下进行种子菌培养；在瑞士比欧30L发酵罐(NLF，BioengineeringAG)中配制发酵培养基20L将300g葡萄糖、20g酵母提取物、IOg谷氨酸钠、IOgMgS04、10gKCl、20gKH2PO4,3mgFe2SO4·6H20UOOmgMnSO4·H20,3.2mgCuSO4·5H20溶于适当水中并混合均勻后，调pH范围至6.87.0，再加水补足至20L；按发酵培养基体积的2%加入种子菌，温度33°C，转速500r/min，溶氧30%，发酵3036h，发酵结束后直接利用发酵液为生物制品或者离心收集芽孢，收集的芽孢经真空干燥，加入质量比99%的玉米淀粉即制成生物制品。实施例5表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记生物工程菌FZB42/ANH生物制品对农作物的促生和防病作用将实施例4的表达Harpin蛋白的芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH生物制品稀释至浓度为(15)X106-(l5)X108cfu/ml，用于田间进行植物种子处理、灌根或者喷施植物表面13次。结果表明，本发明的工程菌能够促进水稻、小麦、番茄、辣椒、黄瓜、青菜等多种农作物的生长，并且对于植物病虫害的防治效果达45%85%，同时增产10%20%。详细的使用方法及作用效果见表1。实施例6表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记生物工程菌FZB42/ANH生物制品对番茄的促生效果将实施例4的表达Harpin蛋白的芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH生物制品稀释至浓度为(15)X107cfu/ml，将番茄种子在其中浸种35h，然后播种于盆钵中，并于播种后的第14天和第28天两次向叶面喷施前述生物制品，进行温室番茄促生试验；同时分别用清水(CK)和FZB42按照同样方法处理番茄种子，作为对照。在试验的第五周观察株高，结果如图6所示，可以看出用表达Harpin蛋白的芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH生物制品处理后的番茄株高明显高于用清水或者用FZB42处理的番茄株高。从试验的第五周开始每隔1周测量一次株高，连续测量20周，并对测量结果的数据进行统计分析，结果表明，用表达Harpin蛋白的芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH生物制品处理的番茄植株株高比清水处理的植株平均增高约30%，比FZB42处理的植株平均增高约15%。表1表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH的生物制品对作物病虫防治作用及增产作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS，其特征在于，是通过如下方法构建而成的(1)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物aprE-1和aprE-2扩增aprE基因及其两侧序列2815bp，扩增的程序为95℃，4min；94℃，45s；55℃，30s；72℃，2min；30个循环；72℃，10min；将扩增的片段与pGEM-T-esay克隆载体连接，成功构建pGEM-easy-T-aprE；aprE-1ATAGTAAGGGCAGCATCAACC；aprE-2CGGTCGTGATTGATCCTTTATA；(2)以本实验室自行设计的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌Harpin蛋白穿梭表达载体pM43HF质粒为模板，引物P43-1(HapI)和Hrp-2(ClaI)扩增p43+SP+hrf2基因序列，大小为813bp。引物P43-1(HapI)和Hrp-2(ClaI)分别在扩增序列两端引入HapI和ClaI酶切位点，扩增的程序为95℃，4min；94℃，45s；62℃，30s；72℃，1min；30个循环；72℃，10min；将扩增的片段经过HapI和ClaI双切后与pGEM-T-esay-aprE载体连接，成功构建pGEM-easy-T-aprE-p43sphrf2中间载体；P43-1(HapI)AACTGATAGGTGGTATGTTTTC；Hrp-2(ClaI)TTTTATCGATCTATTACTGCATTGATGCGC；(3)以质粒pIC333为模板，用引物spe-1-lox66和引物spe-2-lox71扩增含有lox序列位点的抗生素(壮观霉素Spectinomycin)标记基因序列，引物spe-1-lox66和spe-2-lox71分别在扩增序列两端引入lox66和lox71位点，扩增的程序为95℃，4min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，2min；30个循环；72℃，10min；扩增获得的loxspec编码基因片段大小为1438bp；spe-1-lox66TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCTCAGTGGAACGAAAACTCACG；spe-2-lox71TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGGTGGATACACATCTTGTCA；将上述Pfu酶扩增的抗生素筛选基因以平末端的方式与以HpaI限制酶酶切的中间载体pGEM-easy-T-aprE-p43sphrf2连接，成功构建出表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS。2.枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK，其特征在于，是通过如下方法构建而成的(1)以质粒pBT2-arcA为抗生素lox-km序列的供体载体，利用pstl限制酶酶切，并回收lox-km片段，将之与常见克隆载体pUC18相连接，成功构建中间克隆载体ρΜ；(2)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物nrpE-Ll-blunt(EheI)和nrpE-L2(sphl)扩增nprE基因部分及其左侧序列共1492bp，扩增的程序为95°C，4min；94°C，45s；62°C，30s；72°C，2min；30个循环；72°C,IOmin；将扩增的片段与(1)的中间克隆载体PUK连接，成功构建中间克隆载体pUKN-L；nrpE-Ll-blunt(EheI)TCACTGTTGTCTGAATCCCTTG；nrpE-L2(sphl):AAAAAGCATGCACCTAAACCCACAATAAATCCC；(3)以枯草芽孢杆菌FZB42的基因组为模板，用引物nrpE2274Rl(Sail)和nrpE3662R2(KpnI)扩增nprE基因部分及其右侧序列共1388bp，扩增的程序为95°C，4min；94°C，45s；62°C，30s；72°C，2min；30个循环；72°C,IOmin；将扩增的片段用SalI、KpnI双酶切后与(2)的中间克隆载体pUKN-L连接，成功构建出枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK；nprE2274Rl(SalI):AATCGTCGACCTCGCCTATGATGTAAC；nprE3662R2(KpnI):AAGGTACCATGTACAATGGAACATGGC。3.由权利要求1所述的表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS和权利要求2所述的枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK所构建的表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌。4.根据权利要求3所述的表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌无抗生素标记。5.权利要求3所述的表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤采用化学感受态转化方法，先将表达Harpin蛋白的重组载体PGAprEHS转化枯草芽孢杆菌FZB42，得到中间工程菌FZB42/AHS；然后将枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK转化入中间工程菌FZB42/AHS中，突变nprE基因，成功构建出表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌FZB42/ANHSK。6.权利要求4所述的表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤采用化学感受态转化方法，先将表达Harpin蛋白的重组载体PGAprEHS转化枯草芽孢杆菌FZB42，得到中间工程菌FZB42/AHS；然后将枯草芽孢杆菌FZB42nprE基因定点突变载体pUNprEK转化入中间工程菌FZB42/AHS中，突变nprE基因，得到表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌FZB42/ANHSK；最后将表达重组酶蛋白Cre的质粒PBRl-Cre转化工程菌FZB42/ANHSK，通过低温表达去除其中的抗生素标记基因，最终成功构建出表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌无抗生素标记基因工程菌FZB42/ANH。7.权利要求4所述的表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌的生物制品。8.权利要求7所述的表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌的生物制品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)在发酵罐中配制发酵培养基每升培养液中含1020g葡萄糖或1020g蔗糖或2535g玉米浆、0.5Ig酵母提取物、0.5g谷氨酸钠、0.5gMgS04、0.5gKClUgKH2PO4,0.15mgFe2SO4·6Η20、5·OmgMnSO4·H20,0.16mgCuSO4·5H20，调pH范围至6·87·0，力口水至IL；(2)按照发酵培养基体积的3%加入表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌作为种子菌，温度30°C37°C，转速300800r/min，溶氧30%，发酵3036h，发酵结束后直接利用发酵液为生物制品；或者将发酵液离心收集芽孢，收集的芽孢经真空干燥，力口入质量比99%的玉米淀粉，即制成表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌的生物制品。9.权利要求7所述的表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌的生物制品的用途，其特征在于，稀释至浓度为(15)XIO6-(15)X108Cfu/ml，灌根或喷施植物表面13次，用于促进植物生长以及防治水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦根腐病、小麦白粉病、小麦赤霉病、番茄青枯病、番茄早疫病、辣椒疫病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、黄瓜根腐病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病和青菜霜霉病及蚜虫。全文摘要本发明公开一种表达Harpin蛋白的重组载体pGAprEHS及其工程菌。是将Harpin蛋白的编码基因克隆到表达载体中构建表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌重组载体pGAprEHS；然后将其重组到枯草芽孢杆菌染色体上的碱性蛋白水解酶aprE基因位点，得中间工程菌FZB42/AHS；再将nprE基因定点突变载体pUNprEK转化到前述中间工程菌中，以敲除另一中性蛋白水解酶nprE基因，构建出缺失两个蛋白水解酶且表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌FZB42/ANHSK；最后借助Cre/lox重组酶系统去除工程菌中的抗生素筛选标记，得到对环境和人畜更加安全友好的工程菌。文档编号A01N63/00GK101812475SQ20091022335公开日2010年8月25日申请日期2009年11月19日优先权日2009年11月19日发明者乔俊卿,伍辉军,沈波,高学文申请人:无锡亚克生物科技有限公司