专利名称：一种白背三七的组织培养方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种白背三七的组织培养方法。
背景技术：
白背三七(Gynura divaricata (L. ) DC.)属菊科三七属植物，又名白东枫、白子草、 玉枇杷、三百棒、厚面皮、鸡菜、大肥牛、白番苋、白红菜、富贵菜、白子菜等，分布于台湾至华南、西南一带。其根、茎叶均可入药；其根性味甘、凉，能清热凉血，散瘀消肿；其茎、叶味咸微辛、寒，有毒，具有清热，舒筋，止血，祛痰之功效。在福建等地，民间以其茎叶冲茶饮水服用，用于治疗糖尿病等，疗效很好。白背三七富含黄酮类及其苷类化合物(黄骐等，白子菜总黄酮含量的测定，福建师范大学学报，2006，22 (4) 118-120 ；李娈等，富贵菜茎及不同发育时期叶总黄酮含量的比较，湖南林业科技，2007,34(3) :13-14 ；胡勇等，白背三七地上部分的化学成分，中国天然药物，2006,4( =156-158 ；李丽梅等，白背三七化学成分研究，时珍国医国药，2008，19(1) :118-119)、多糖类(姜曼花等，白背三七多糖的提取纯化及含量的测定，时珍国医国药，，2008，19(9) :2147-2149)、醇类化合物及其衍生物(胡勇等，白背三七地上部分的化学成分，中国天然药物，2006,4( =156-158 ；李丽梅等，白背三七化学成分研究，时珍国医国药，2008，19(1) :118-119)等，是我国重要的传统保健型蔬菜和中草药资源(李炎林等，药用植物富贵菜的研究现状与展望，中国野生植物资源，2011，30(1) 10-13，19)。富贵菜在我种植主要分布在南方，其受生长环境的要求，其最适生长环境温度为 20-30°C，低于15°C茎叶生长缓慢，成株可忍耐40°C的高温、3°C的低温，_2°C时地上部分冻死(郑华等，富贵菜人工栽培技术，中国蔬菜，2004，(4) :54-55)，同时经常采收的植株很少开花结籽，另外在我国广东南部珠江三角洲地区只开花不结籽(贺东方，富贵菜高产优质栽培技术，长江蔬菜，2003，(11) :29-33;赵世乐等，富贵菜及其栽培，特种经济动植物， 2002，(6) :36-39)。这种繁殖特性给白背三七的种质资源保存和运输带来了一定的困难，但传统的人工扦插繁殖制约着白背三七的大规模种植。因此通过白背三七再生体系构建、器官发生途径、侧芽丛芽诱导等途径建立了白背三七的组织培养体系(李娈，富贵菜黄酮含量及离体培养的研究，湖南农业大学硕士论文，2007，6 ；李娈等，富贵菜离体培养体系的建立，长江大学学报(自然科学版)，2009,6 ) :56-60;李娈等，富贵菜器官发生的研究，湖南农业科学，2009，(6) :4-6;黄丽莉等，白子菜的组织培养与快速繁殖，植物生理学通讯， 46(4) :377-378)。上述4种方法以白背三七茎段或者叶片产生愈伤组织，然后发生器官再生形成植株，最后生根形成完整植株；或者以侧芽诱导培养形成植株，但繁殖系数较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一套利用生物技术工厂化生产白背三七苗木的种苗的方法，克服上述现有繁殖技术或方法存在的缺陷，以便快速、高效、大规模地生产种性纯正、健康、整齐一致的高质量白背三七种苗。本发明的目的是通过以下方式实现的。一种白背三七的组培方法，包括以下步骤(1)外植体的取材与消毒选取一年生或者当年生的新梢白背三七茎段，剪去叶片留叶柄，清洗、用70%酒精和2%次氯酸钠消毒，切成0. 5-1. Ocm带芽茎段；(2)诱导培养将消毒好的茎段带芽外植体接种在不含任何激素的MS启动培养基，诱导腋芽产生，培养条件为25°C 士 1°C，光照强度为20001x，光照时间为16h/d，20天后得到5-8cm高的启动苗；(3)增殖培养将启动苗切成单个的带芽茎段，接种在培养基MS+6-BA 0. 2mg/L+ 蔗糖20g/L+琼脂6g/L，培养条件为25°C 士 1°C，光照强度为20001x，光照时间为16h/d ；(4)生根将增殖培养出的4-6cm的芽切下转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为 MS+IBA 0. lmg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L，或者为 MS+IBA 0. 3mg/L+IAA 0. 3mg/ L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，培养条件为25°C 士 1 °C，光照强度为20001x，光照时间为Wh/d ；(5)炼苗与移栽将生根后的苗进行炼苗移栽。所述步骤(1)中的一年生或当年生枝梢来源于春季白背三七萌发的新梢、任何季节扦插枝条、老枝打顶所萌发的新梢、种子萌发芽或者组培移栽苗。所述步骤(1)清洗消毒过程具体如下先将外植体用自来水添加去污剂清洗，再用自来水流水冲洗1个小时，在超净工作台内经70%酒精消毒1 和2%次氯酸钠消毒 12min，无菌水冲洗5次后备用。所述步骤( 中在增殖培养基MS+6-BA 0. 2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L上，在增殖培养2周后腋芽萌发，但外植体基部并不形成愈伤组织，并从其基部逐渐分化出许多不定芽。培养5-6周后芽高达4-6cm左右，每个外植体可以产生小芽平均数达18个左右。所述步骤⑷中两种生根培养基诱导的根系质量不同。在生根培养基 MS+IBAO. lmg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L上诱导生根，9天可以生根，根系数量适中，但长度较长，可直接进行炼苗后移栽；在生根培养基MS+IBA 0. 3mg/L+IAA 0. 3mg/L+蔗糖20g/L+ 琼脂6g/L诱导生根，9天可以生根，根系数量多而长度适中，可直接进行炼苗后移栽或进入下一轮增殖循环周期中。所述步骤( 具体包括以下炼苗与移栽过程将生根苗的容器直接转移到普通房间放置2天，然后用镊子将生根苗移出，在自来水下冲洗去掉培养基，移栽到炼苗基质的苗床上，浇透水，并搭建塑料小拱棚，保证棚内的湿度80%以上，于塑料大棚15-30°C培养，两周左右小苗逐渐适应培养环境，可以慢慢移除小拱棚，进行正常的肥水管理。所述的炼苗基质为棉籽壳(食用菌生产后的下脚料)河沙珍珠岩的重量比为 3:1:1的混合物。该发明具有以下优点(1)外植体采集方面，污染率低，所用消毒剂无环境污染； (2)增殖培养通过无菌苗腋芽途径获得无菌苗，繁殖系数高；C3)生根率和定植成活率极高，增殖途径不经过愈伤组织再分化成苗阶段，遗传稳定性好。此方法可以实现快速繁殖白背三七，为规模化种植白背三七提供优质种苗。增殖培养系数平均为18左右，每3-4周或者5-6周重复继代一次，移栽成活率达到95%以上。 通过植物组织培养植株可以在短时间内实现快速繁殖和大规模种植的目的，繁育种苗不受
4外界不良环境的影响，该法已经在珍稀花卉、名贵中药材的扩大种植和濒危树种的拯救方面得到广泛的应用。
图1是本发明方法中由嫩梢茎段获得的各阶段的白背三七植株，其中A.茎段的启动培养；B.增殖培养；C.生根培养；D.生根培养；E.生根苗移栽到苗床(70天后)。
具体实施例方式以下实施例旨在进一步说明本发明，而不会限制本发明。实施例11)外植体的取材与消毒选取20天左右的嫩梢作外植体，剪去叶片(保留叶柄)， 先用适量的去污剂清洗，再用自来水流水冲洗1个小时，在超净工作台内经70%酒精消毒 15s和2%次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5次后放在超净工作台内，切成0. 5-1. Ocm带芽茎段备用。2)诱导培养在超净工作台内将消毒好的茎段带芽外植体接种在不含任何激素的MS启动培养基，诱导腋芽产生，培养条件为25°C 士 1 °C，光照强度为20001x左右，光周期为16h/8h,20天左右后得到5-8cm高的启动苗(图1，A)；3)增殖培养以启动苗的顶芽和带芽茎段为外植体，接种在MS+6-BA0. 2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L增殖培养基上，培养条件同诱导培养。在增殖培养2周后腋芽萌发，但外植体基部并不形成愈伤组织，并从其基部逐渐分化出许多不定芽(图1，B)。培养5-6周后芽高达4-6cm左右，每个外植体可以产生小芽平均数达18个左右。再将4-6cm左右的芽直接进行生根诱导。4)生根培养将增殖培养出的4cm左右的芽切下转移到生根培养基上进行生根诱导培养，在生根培养基MS+IBA 0. lmg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L上诱导生根，9天可以生根 (图1，C)，根系数量适中，但长度较长，可直接进行炼苗后移栽。培养条件同诱导培养。生根率达到100%。5)炼苗与移栽将生根苗的容器直接转移到普通房间放置2天，然后用镊子将生根苗移出，在自来水下冲洗去掉培养基，移栽到炼苗基质的苗床上，浇透水，并搭建塑料小拱棚，保证棚内的湿度80%以上，与塑料大棚25°C培养，两周左右小苗逐渐适应培养环境， 可以逐步移除小拱棚，进行正常的肥水管理。成活的植株与实生苗无差异，完全保持母本的遗传特征(图1，E)。移栽成活率达到95%以上。实施例2具体实施过程同实例1。其中生根培养基配方为MS+IBA 0. 3mg/L+IAA 0. 3mg/L+ 蔗糖20g/L+琼脂6g/L，通过诱导生根9天可以生根(图1，D)，根系数量多而长度适中，可直接进行炼苗后移栽；生根率达到100% ；移栽成活率达95%以上。
权利要求
1.一种白背三七的组培方法，其特征在于，包括以下步骤(1)外植体的取材与消毒选取一年生或者当年生的新梢白背三七茎段，剪去叶片留叶柄，清洗、用70%酒精和2%次氯酸钠消毒，切成0. 5-1. Ocm带芽茎段；(2)诱导培养将消毒好的茎段带芽外植体接种在不含任何激素的MS启动培养基，诱导腋芽产生，培养条件为25°C 士 1°C，光照强度为20001x，光照时间为16h/d，20天后得到 5-8cm高的启动苗；(3)增殖培养将启动苗切成单个的带芽茎段，接种在培养基MS+6-BAO.aiig/L+蔗糖 20g/L+琼脂6g/L，培养条件为25°C 士 1°C，光照强度为20001x，光照时间为16h/d ；(4)生根将增殖培养出的4-6cm的芽切下转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为 MS+IBA 0. lmg/L+蔗糖 20g/L+琼脂 6g/L，或者为 MS+IBA 0. 3mg/L+IAA 0. :3mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，培养条件为25°C 士 1°C，光照强度为20001x，光照时间为16h/d ；(5)炼苗与移栽将生根后的苗进行炼苗移栽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的一年生或当年生枝梢来源于春季白背三七萌发的新梢、任何季节扦插枝条、老枝打顶所萌发的新梢、种子萌发芽或者组培移栽苗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)清洗消毒过程具体如下先将外植体用自来水添加去污剂清洗，再用自来水流水冲洗1个小时，在超净工作台内经70%酒精消毒1 和2%次氯酸钠消毒12min， 无菌水冲洗5次后备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中在生根培养基MS+IBA 0. lmg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L上诱导生根， 9天生根，直接进行炼苗后移栽；在生根培养基MS+IBA 0. 3mg/L+IAA 0. ;3mg/L+蔗糖20g/L+ 琼脂6g/L诱导生根，9天生根，直接进行炼苗后移栽或进入下一轮增殖循环周期中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤( 具体包括以下炼苗与移栽过程将生根苗的容器直接转移到普通房间放置2天，然后用镊子将生根苗移出，在自来水下冲洗去掉培养基，移栽到炼苗基质的苗床上，浇透水，并搭建塑料小拱棚，保证棚内的湿度不低于80%，于塑料大棚15-30°C培养，小苗适应培养环境两周后，移除小拱棚，进行正常的肥水管理。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的炼苗基质为棉籽壳河沙珍珠岩的重量比为3:1:1的混合物。
全文摘要
本发明公开了一种白背三七的组织培养方法。包括诱导培养接种在不含任何激素的MS启动培养基，诱导腋芽产生；增殖培养接种在培养基MS+6-BA 0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L增殖；生根培养在MS+IBA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，或者为MS+IBA0.3mg/L+IAA 0.3mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L生根，培养条件均为25℃±1℃，光照强度为2000lx，光照时间为16h/d。本发明方法能够快速、高效、大规模地生产种性纯正、健康、整齐一致的高质量白背三七种苗。
文档编号A01G31/00GK102246694SQ20111011584
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月5日 优先权日2011年5月5日
发明者何长征, 刘东波, 刘明月, 宋勇, 李炎林, 熊兴耀, 秦玉芝, 胡新喜, 黄科 申请人:湖南农业大学