专利名称：一种诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸ｂ产量的方法
技术领域：
本发明属于利用细胞培养法生产天然产物技术领域，具体涉及一种诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法。
背景技术：
丹参(fehia miltiorrhiza bunge)的根是中国传统的中草药，临床主要用来治疗胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛等症。丹参中的次生代谢物——酚酸类化合物具有抗血栓形成的作用，对小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤有保护作用(Chen等，2000)，其中丹酚酸B具有很强的清除自由基和抗氧化作用(黄诒森等，1992)。 以丹酚酸B为代表的酚酸类成分被认为是丹参中发挥药效的活性物质基础，逐渐受到研究者们的关注(杜冠华等，2000)。目前，利用细胞培养法成为定向生产目标次生代谢物的有效方法，但往往由于培养细胞中次生代谢物的产量很低而成为制约其大规模生产的主要因素(董娟娥等，2009)。 利用添加外源生长调节物质、改变细胞的培养条件等方法可在一定程度上提高丹参培养细胞中丹酚酸B的产量，但提高的幅度很有限(柳福智等，2006)。利用诱导子诱发成为大幅度提高细胞培养物中次生代谢产物含量的重要方法(董娟娥等，2009)。利用酵母提取物、寡半乳糖醛酸、真菌提取物等生物诱导子能提高丹参培养细胞丹参酮的产量，但不产生丹参酚酸类物质(Chen 等，2000 ；Chen 等，2001 ；宴琼等，2006)。参考文献
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发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种操作简单、 成本低、诱导时间短、效率高的诱导提高丹参培养细胞中丹酚酸B (丹参酚酸类物质)的方法。该方法克服了添加酵母提取物、寡半乳糖醛酸等诱导子诱导后不产生丹酚酸B的问题， 利用该方法可使丹参培养细胞中的丹酚酸B含量增加5倍左右。实现上述发明目的的技术解决方案是一种诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸 B产量的方法，具体包括以下步骤
1)培养无菌苗步骤；
2)诱导愈伤组织步骤；
3)愈伤组织继代培养步骤；
4)愈伤组织悬浮培养步骤；
5)诱导产生丹酚酸B步骤；
6)收获培养细胞步骤；
所述培养无菌苗步骤是将新鲜的丹参种子用水冲洗2、h，用纱布去除表面的蜡质层， 用自来水冲洗3次，然后在无菌操作间进行灭菌处理。灭菌处理的步骤是，用70%乙醇冲泡 30 s (秒)，用无菌水冲洗3次，再用0. 1%的HgCl2溶液灭菌1(T15 min后，再用无菌水冲洗 3次，接种在MS固体培养基上。在培养温度为23 27°C、光照时间为1(T12 h、光照强度为 2000^3000 Lx的条件下培养2个月，长出无菌苗。所述诱导愈伤组织步骤是取出生长2个月的无菌苗，将叶片剪成0.5 cm X0. 5 cm 的小块，接种于MS固体诱导培养基上诱导形成愈伤组织。所述愈伤组织继代培养步骤是将诱导出的愈伤组织每20 d (天)继代培养一次， 继代培养3次后形成具有稳定形态特征和生长速率的愈伤组织，然后在培养温度为23 27°C、光照时间为12 16 h、光照强度为200(T3000 Lx的培养条件下培养1个月，待用。所述愈伤组织悬浮培养步骤是选择新鲜疏松的固体愈伤组织，在无菌状态下分散，进行悬浮培养。所述诱导产生丹酚酸B步骤是当培养细胞生长接近静止期时，向培养基中加入终浓度为6. 25^25 mg/L的水杨酸诱导子进行诱导培养。所述收获培养细胞步骤是收集全部培养液，置离心管中，在1200Xg离心后，倾倒出上清的培养基，收集沉淀培养细胞，将培养细胞在4(T60°C真空干燥箱中干燥至恒量。所述MS固体诱导培养基由0. 5 1. 5 mg/L的ΝΑΑ、0. 5 1. 5 mg/L的6_BA、0. 5 1. 5 mg/L的2，4-D、5. 5 g/L的琼脂、30 g/L的蔗糖组成。所述诱导形成愈伤组织的诱导条件是培养温度为23 27°C、光照时间为12 16 h、光照强度为2000 3000 Lx0所述悬浮培养是按愈伤组织重量培养液体积=5、g 100 ml的比例，将分散的愈伤组织转接到MS液体培养基上，在摇床中进行黑暗悬浮培养。所述MS液体培养基不含琼脂和生长调节物质，含30 g/L蔗糖。所述悬浮培养条件培养温度为25°C，转速为125 rpm,培养圹8 d。向培养基中加入水杨酸诱导子进行诱导培养是条件是培养温度为25°C，转速为 125 rpm，培养 1 3 d。与现有技术相比较，本发明的效果和益处是工艺过程简单、诱导时间短、易于操作、成本低、效率高，完全避免了利用细胞培养法生产丹酚酸B含量过低而导致效率不高的问题，适合于大规模工业化生产。在此工艺参数下，丹参培养细胞中丹酚酸B的含量为8. 16 g/kg，是传统培养法含量(1. 53 g/kg)的5. 3倍。
图1为加入不同浓度的水杨酸(SA)后对丹参培养细胞生长的影响。图2为水杨酸(SA)诱导时间对丹酚酸B产量的影响。图3为水杨酸(SA)诱导浓度对丹酚酸B产量的影响。图4水杨酸诱导与其他方法诱导的效果比较图。
具体实施例方式以下结合发明人给出的具体试验例和实施例，进一步对本发明的技术方案的有益效果。试验例1
本发明中影响丹酚酸B产量的因素主要有培养基中生长调节物质的浓度、蔗糖浓度、 水杨酸的加入时间、水杨酸的诱导浓度、培养温度、摇床转速和培养细胞的干燥温度等。在诱导愈伤组织的步骤中，植物生长调节物质的种类和使用浓度是影响丹参愈伤组织诱导与分化频率的关键因素。2，4-D对丹参愈伤组织有强的诱导作用，以0.5 2.0 mg/L的2，4-D 诱导的出愈率较高，且生长状况好。高浓度的2，4-D会诱导愈伤组织内多酚氧化酶活性升高，从而导致愈伤组织褐化。0.5 1.0 mg/L的NAA诱导的愈伤组织生长好，呈乳白色，有光泽。NAA的浓度为3.0 mg/L以上时，愈伤组织生长缓慢、逐渐褐化。培养液中6-BA的浓度为l.(T2.0 mg/L时出愈率高，愈伤组织生长好。如果浓度过低，容易形成多核体阻止细胞分化，加速细胞衰老，逐渐死亡。高浓度的6-BA使细胞体积因强烈的分裂活动而急剧缩小， 已形成的愈伤组织不能正常生长，逐渐变褐。在进行悬浮细胞培养过程中，接入培养细胞的浓度是影响细胞生长繁殖的关键因素。随着接入培养细胞重量的增大，生长速率逐渐下降。 愈伤组织浓度越大，抑制细胞生长的程度越高。但愈伤组织浓度过低，繁殖的细胞数量也较低。故接入愈伤组织与培养液的重量体积比为5、g/100 ml培养基时较合适。在诱导产生丹酚酸B的过程中，加入水杨酸的浓度和诱导时间是影响丹酚酸B产生的两个关键因素。 高浓度的水杨酸明显抑制愈伤组织的生长，随着水杨酸浓度的增大，培养细胞的鲜重增长率逐渐降低。水杨酸的终浓度为50 mg/L时，培养细胞鲜重增长率约为对照的48%。水杨酸的浓度在(Γ25 mg/L范围内诱导后的丹参细胞内丹酚酸B含量均高于对照。过高浓度的水杨酸(50 mg/L)抑制丹酚酸B的积累。适宜于诱导丹酚酸B积累的水杨酸浓度为6. 25 25 mg/L，见图1。随着诱导时间的延长，丹酚酸B在广3 d有诱导高峰。在(Tl d时，细胞中丹酚酸B含量逐渐增加，显著高于对照。随着诱导时间的进一步延长至2 d，细胞中丹酚酸 B含量急剧上升达到高峰，随后缓慢下降。培养3 d后，细胞中丹酚酸B的含量降低，见图2 和图3。收集的培养细胞在干燥的过程中应注意干燥温度，干燥温度过高，会导致丹酚酸B 进一步分解成为丹参素等其他酚酸类物质，因此，干燥温度以4(T60°C为宜。试验例2
将本发明的诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法与其他方法诱导作对比，详见图4。从图4可以看出，利用本发明的方法可使丹参培养细胞中的丹酚酸B含量增加5倍左右，明显优与其它方法。实施例1
将新鲜的丹参种子在MS固体培养基上诱导长出无菌苗。选取健壮无菌苗的叶片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小块，接种于MS固体诱导培养基上(含有1. 0 mg/L的NAA、0. 5 mg/L 的6-BA、0.5 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的琼脂、30 g/L的蔗糖)，诱导形成愈伤组织。将具有稳定形态特征和生长速率的愈伤组织在培养温度为26°C、光照时间为12 16 h、光照强度为 2000^3000 Lx的培养条件下培养1个月。选择新鲜疏松的固体愈伤组织，在无菌状态下分散，按愈伤组织重量培养液体积=5 g 100 ml的比例，将分散的愈伤组织转接到MS液体培养基上(不含琼脂和生长调节物质，含30 g/L蔗糖)，在摇床中进行黑暗悬浮培养。悬浮培养条件培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养5 d。向培养基中加入终浓度为10 mg/ L的水杨酸诱导子进行诱导培养。培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养2 d。收集全部培养液，置离心管中，在1200Xg离心后，倾倒出上清的培养基，收集沉淀部分(培养细胞)。 将收集到的培养细胞在50 °C真空干燥箱中干燥至恒量。实施例2
将新鲜的丹参种子在MS固体培养基上诱导长出无菌苗。选取健壮无菌苗的叶片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小块，接种于MS固体诱导培养基上(含有1. 5 mg/L的NAA、0. 5 mg/L 的6-BA、0.5 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的琼脂、30 g/L的蔗糖)，诱导形成愈伤组织。将具有稳定形态特征和生长速率的愈伤组织在培养温度为M°C、光照时间为12 16 h、光照强度为 2000^3000 Lx的培养条件下培养1个月。选择新鲜疏松的固体愈伤组织，在无菌状态下分散，按愈伤组织重量培养液体积=7 g 100 ml的比例，将分散的愈伤组织转接到MS液体培养基上(不含琼脂和生长调节物质，含30 g/L蔗糖)，在摇床中进行黑暗悬浮培养。悬浮培养条件培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养8 d。向培养基中加入终浓度为12. 5 mg/L的水杨酸诱导子进行诱导培养。培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养1 d。收集全部培养液，置离心管中，在1200Xg离心后，倾倒出上清的培养基，收集沉淀部分(培养细胞)。将收集到的培养细胞在60°C真空干燥箱中干燥至恒量。实施例3
将新鲜的丹参种子在MS固体培养基上诱导长出无菌苗。选取健壮无菌苗的叶片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小块，接种于MS固体诱导培养基上(含有1. 0 mg/L的NAA、1. 5 mg/L 的6-BA、0.5 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的琼脂、30 g/L的蔗糖)，诱导形成愈伤组织。将具有稳定形态特征和生长速率的愈伤组织在培养温度为27°C、光照时间为12 16 h、光照强度为 2000^3000 Lx的培养条件下培养1个月。选择新鲜疏松的固体愈伤组织，在无菌状态下分散，按愈伤组织重量培养液体积=7 g 100 ml的比例，将分散的愈伤组织转接到MS液体培养基上(不含琼脂和生长调节物质，含30 g/L蔗糖)，在摇床中进行黑暗悬浮培养。悬浮培养条件培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养4 d。向培养基中加入终浓度为6. 25 mg/L的水杨酸诱导子进行诱导培养。培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养2 d。收集全部培养液，置离心管中，在1200Xg离心后，倾倒出上清的培养基，收集沉淀部分(培养细胞)。将收集到的培养细胞在40°C真空干燥箱中干燥至恒量。实施例4
将新鲜的丹参种子在MS固体培养基上诱导长出无菌苗。选取健壮无菌苗的叶片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小块，接种于MS固体诱导培养基上(含有1. 5 mg/L的NAA、0. 5 mg/L 的6-BA、0.5 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的琼脂、30 g/L的蔗糖)，诱导形成愈伤组织。将具有稳定形态特征和生长速率的愈伤组织在培养温度为23°C、光照时间为12 16 h、光照强度为 2000^3000 Lx的培养条件下培养1个月。选择新鲜疏松的固体愈伤组织，在无菌状态下分散，按愈伤组织重量培养液体积=8 g 100 ml的比例，将分散的愈伤组织转接到MS液体培养基上(不含琼脂和生长调节物质，含30 g/L蔗糖)，在摇床中进行黑暗悬浮培养。悬浮培养条件培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养6 d。向培养基中加入终浓度为25 mg/ L的水杨酸诱导子进行诱导培养。培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养1 d。收集全部培养液，置离心管中，在1200Xg离心后，倾倒出上清的培养基，收集沉淀部分(培养细胞)。 将收集到的培养细胞在40°C真空干燥箱中干燥至恒量。实施例5
将新鲜的丹参种子在MS固体培养基上诱导长出无菌苗。选取健壮无菌苗的叶片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小块，接种于MS固体诱导培养基上(含有1. 0 mg/L的NAA、1. 0 mg/L 的6-BA、1.0 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的琼脂、30 g/L的蔗糖)，诱导形成愈伤组织。将具有稳定形态特征和生长速率的愈伤组织在培养温度为25°C、光照时间为12 16 h、光照强度为 2000^3000 Lx的培养条件下培养1个月。选择新鲜疏松的固体愈伤组织，在无菌状态下分散，按愈伤组织重量培养液体积=7 g 100 ml的比例，将分散的愈伤组织转接到MS液体培养基上(不含琼脂和生长调节物质，含30 g/L蔗糖)，在摇床中进行黑暗悬浮培养。悬浮培养条件培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养6 d。向培养基中加入终浓度为6. 25 mg/L的水杨酸诱导子进行诱导培养。培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养2 d。收集全部培养液，置离心管中，在1200Xg离心后，倾倒出上清的培养基，收集沉淀部分(培养细胞)。将收集到的培养细胞在60°C真空干燥箱中干燥至恒量。
权利要求
1.一种诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法，具体包括以下步骤1)培养无菌苗步骤；2)诱导愈伤组织步骤；3)愈伤组织继代培养步骤；4)愈伤组织悬浮培养步骤；5)诱导产生丹酚酸B步骤；6)收获培养细胞步骤；所述培养无菌苗步骤是将新鲜的丹参种子用水冲洗2、h，用纱布去除表面的蜡质层， 再用水冲洗3次，进行灭菌处理后用70%乙醇中冲泡30 s,无菌水冲洗3次，再用0. 1%的 HgCl2溶液中灭菌1(T15 min，再用无菌水冲洗3次后，接种在MS固体培养基上，在培养温度为23 27°C、光照时间为1(T12 h、光照强度为200(T3000 Lx的条件下培养2个月，长出无菌苗；所述诱导愈伤组织步骤是取出生长2个月的无菌苗，将叶片剪成0.5 cm X 0.5 cm的小块，接种于MS固体诱导培养基上诱导形成愈伤组织；所述愈伤组织继代培养步骤是将诱导出的愈伤组织每20 d继代培养一次，继代培养3 次后形成具有稳定形态特征和生长速率的愈伤组织，然后在培养温度为23 27°C、光照时间为12 16 h、光照强度为200(T3000 Lx的培养条件下培养1个月，待用；所述愈伤组织悬浮培养步骤是选择新鲜疏松的固体愈伤组织，在无菌状态下分散，进行悬浮培养；5)所述诱导产生丹酚酸B步骤是当培养细胞生长接近静止期时，向培养基中加入终浓度为6. 25^25 mg/L的水杨酸诱导子进行诱导培养；6)所述收获培养细胞步骤是收集全部培养液，置离心管中，在1200Xg离心后，倾倒出上清的培养基，收集沉淀培养细胞，将培养细胞在4(T60°C真空干燥箱中干燥至恒量。
2.根据权利要求1所述诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法，其特征在于,所述MS固体诱导培养基由0. 5 1. 5 mg/L的ΝΑΑ、0. 5 1. 5 mg/L的6_BA、0. 5 1. 5 mg/L 的2，4-D、5. 5 g/L的琼脂、30 g/L的蔗糖组成。
3.根据权利要求1所述诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法，其特征在于，所述诱导形成愈伤组织的诱导条件是培养温度为23 27°C、光照时间为12 16 h、光照强度为2000 3000 Lx。
4.根据权利要求1所述诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法，其特征在于，所述悬浮培养是按愈伤组织重量培养液体积=5、g 100 ml的比例，将分散的愈伤组织转接到MS液体培养基上，在摇床中进行黑暗悬浮培养。
5.根据权利要求4所述诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法，其特征在于，所述MS液体培养基不含琼脂和生长调节物质，含30 g/L蔗糖。
6.根据权利要求1或4所述诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法，其特征在于，所述悬浮培养条件培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养圹8 d。
7.根据权利要求1所述诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B产量的方法，其特征在于，向培养基中加入水杨酸诱导子进行诱导培养的条件是培养温度为25°C，转速为125 rpm，培养1 3 d。
全文摘要
本发明公开了一种诱导提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸Ｂ产量的方法，具体包括以1)培养无菌苗步骤；2)诱导愈伤组织步骤；3)愈伤组织继代培养步骤；4)愈伤组织悬浮培养步骤；5)诱导产生丹酚酸B步骤；6)收获培养细胞步骤。该方法克服了添加酵母提取物、寡半乳糖醛酸、真菌提取物等诱导子诱导后不产生丹酚酸B的问题，利用该方法可使丹参培养细胞中的丹酚酸B含量增加5倍左右。本发明中的工艺条件经放大后适宜于利用细胞培养法工业化大规模生产丹酚酸B。
文档编号A01H4/00GK102428871SQ20111028607
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月24日 优先权日2011年9月24日
发明者梁宗锁, 焦蒙丽, 碗国伟, 董娟娥, 陈红艳 申请人:西北农林科技大学