专利名称：一种抑制烟草愈伤组织继代培养中褐化的方法
技术领域：
本发明涉及植物细胞工程技术领域，更具体涉及一种抑制烟草愈伤组织继代培养中褐化的方法。适用于烟草等茄科植物愈伤组织继代培养中褐化现象的抑制。
背景技术：
烟草是茄科烟草属的一年生草本植物，本属约有60种。原产于美洲和大洋洲，中国栽培4种烟草、黄花烟草、光烟草和花烟草，其中烟草种植面积最大。烟草具有药用、工业用、保腱美容等价值，其中卷烟是烟草的主要产品，从烟叶中提取的蛋白质其营养价值高于任何奶类的蛋白质，而烟碱有杀菌止血的功能，是医院必备的药品。在中国烟叶和卷烟的销量很大，是国家的高积累、高税率商品，在国民经济中占有重要的地位。此外，烟草作为植物组织培养的“模式植物”之一，在植物细胞工程的研究中占有重要地位。有关烟草组织和细胞培养有不少研究和报道。褐变这一在许多木本植物组培中常见的现象，也是烟草组织培养的一大障碍。褐变是指外植体在培养过程中，自身组织从表面培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。为了提高组织培养的成功率及维持愈伤组织较高的新陈代谢活性，必须对褐变现象加以严格控制。目前，国内外针对烟草组织培养过程中褐变现象的发生及引起褐变的因素有一定研究和报道。烟草细胞继代培养过程中的褐化诱因可归结为两大因素1.材料的遗传基础及生长发育等内在因子；2.培养方式及条件等外部因子。尽管引起烟草愈伤组织继代培养中褐变的因素很多，但如下这一点是清楚的选择适宜的培养基，再配合使用一些抗氧化剂，调节外源激素的种类与含量，在适宜的温度及黑暗中培养，方能使愈伤组织处于旺盛生长状态，且能够有效地控制褐变。我们研究发现，固体培养基的凝固情况对愈伤材料生长的影响较大。如果培养基偏软，植物愈伤材料会因沉入培养基中造成缺氧，胞内多酚氧化酶被激活，细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，最终愈伤组织生长不好，直至死亡。如果培养基偏硬，则植物材料吸收水分和养分困难，同样生长不好。培养基的凝固状况(体现为软硬度)与琼脂用量和培养基的PH值有关。在实际操作过程中，培养基的pH值都是在灭菌前调至预定值的，但高温灭菌后由于培养基营养成分发生化学变化，会导致培养基的PH值也随之改变，这是造成高温灭菌后固体培养基凝固不好、甚至不凝固的主要原因之一。调高培养基PH值或增加琼脂用量均可改善培养基的凝固效果。因此在配制培养基时琼脂的用量、培养基灭菌前PH值的设定以及灭菌时如何控制培养基成分的有效性及各营养成分的顺序都是抑制烟草愈伤组织继代培养褐化的关键。另外，向培养基中加入适量吸附剂聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，以吸收愈伤组织生长过程中产生的有毒物质也是抑制烟草愈伤组织继代过程中褐化的一个新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制烟草愈伤组织继代培养过程中褐化的方法。方法简单易行，操作方便，有效抑制了烟草愈伤组织继代过程中的褐变，效果好，烟草愈伤组织增殖率可达11.29(倍)；另外，该发明为烟草愈伤组织悬浮培养提供了优良的细胞种源。该方法培养的烟草愈伤组织松软，为获得分散均匀的悬浮细胞系提供了良好的条件。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施一种抑制烟草愈伤组织继代培养过程中褐化的方法，其步骤是A :配制KCMS培养基。培养基的成分组成及工作浓度如下大量元素为硝酸铵(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸钾(KNO3) I. 9g/L、二水合氯化钙(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、 七水合硫酸镁(MgSO4 · 7H20) O. 37g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4) O. 17g/L ;微量元素碘化钾(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、四水合硫酸锰(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合锰酸钠(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸铜 (CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化钴(COCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;铁盐七水合硫酸亚铁 (FeSO4 ·7Η20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA ·2Η20) 37. 3mg/L ;肌醇 O. 5mg/ L ;维生素B1L 3mg/L ;2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. 2mg/L、激动素(KT)O. lmg/L ;聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)O. 5g/L ;磷酸二氢钾(KH2PO4) 200mg/L ;琼脂8_10g/L ;蔗糖30g/L。灭菌前将培养基PH调节至5. 6-6。B =KCMS培养基灭菌将A步骤中所述KCMS培养基成分分成三部分独立灭菌。 三部分分别为铁盐(七水合硫酸铁(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠 (Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L)、微量元素(碘化钾(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、 四水合硫酸锰(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合锰酸钠(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸铜(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化钴 (CoCl2 · 6H20)O. 025mg/L)和KCMS培养基其他营养成分(大量元素、肌醇、维生素B1^, 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激动素(KT)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、 琼脂和蔗糖)。以上三部分KCMS培养基营养成分分别进行湿热灭菌。铁盐部分灭菌条件为121. 30C 30min，微量元素部分灭菌条件为121. 3°C 30min, KCMS培养基其他营养成分部分灭菌条件为121. 30C 20min。灭菌完成后待以上三部分KCMS培养基营养成分均冷却至 50-60°C，在无菌操作台上将它们混合均匀，并分装至IOOmL锥形瓶(锥形瓶提前121. 3°C灭菌30min)，每瓶分装20mL KCMS培养基。C :待B步骤中IOOmL三角瓶内KCMS培养基自然冷却至室温(20_25°C，以下相同) 并黑暗水平搁置2-3天后，可将烟草愈伤组织转移到凝固好的KCMS培养基表面，放置在光照培养箱中培养。培养条件为22-26h黑暗，培养箱温度24-26°C，培养箱湿度18% ~20%o 20-24天继代一次。此方法下培养的烟草愈伤组织生长分裂旺盛，增殖率可达11. 29 (倍)。 全过程中培养基始终维持亮黄色，表明烟草愈伤组织向培养基中分泌的有毒褐化物质少， 褐化现象得到明显的抑制；此外，新分裂形成的烟草愈伤组织为乳白色且松软，利于进行下一代转接。本发明具有如下的优点和效果I.有关本发明的效果请见下表材料颜色材料状态材料褐化悬浮培养增殖率 (增重倍数)培养基状态本方法乳白- 浅黄松软轻，继代 26天出现褐化悬浮细胞分散均勻，颗粒细小11.29亮黄色，弹性适中常规方法黄-白紧实重，继代 10-12天出现褐化悬浮细胞成团5.64白色，较坚硬2.本发明无需增加专用设备，操作方便，有效抑制了烟草愈伤组织继代过程中的褐化，则大大保证了烟草愈伤组织培养的成功率；同时该方法也促进了烟草愈伤组织的快速生长。3.本发明中获得的烟草愈伤组织松软，可为液体悬浮培养模式提供优良的细胞种源。主要体现在本方法下获得的烟草愈伤组织经过液体悬浮培养时能分散均匀，不黏粘成团；并且仅5-8个烟草细胞构成I个颗粒，故颗粒细小。这样不仅保证了烟草细胞与培养基中营养成分的有效接触，也保证了烟草细胞生长的同步性。因此，无论是作为科研材料还是用于工厂化大规模培养以提取烟碱等的烟草细胞种源，都是最佳选择。
具体实施例方式实施例I :下面对本发明的实施例作进一步详细描述一种抑制烟草愈伤组织继代过程中褐化的方法，它采用如下步骤步骤一以烟草种子播种后萌发出的子叶为外植体，用体积比为75%的酒精浸泡 20或24或26或28或30s后，再用质量体积比为O. I %的氯化汞消毒6或7分钟，用无菌水冲洗8或9或10次。步骤二 配制MS固体培养基(大量元素硝酸铵(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸钾 (KNO3) I. 9g/L、二水合氯化钙(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、七水合硫酸镁(MgSO4 · 7H20) O. 37g/ L、磷酸二氢钾(KH2PO4)O. 17g/L ;微量元素碘化钾(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、 四水合硫酸锰(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合锰酸钠(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸铜(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化钴 (CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;铁盐七水合硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L ;有机物质肌醇O. lg/L、烟酸O. 5mg/L、维生素 B6O. 5mg/L、维生素B1O. lmg/L、甘氨酸2. Omg/L ;鹿糖30g/L ;琼脂7g/L)。将MS培养基湿热灭菌(121. 3°C，灭菌20min)并冷却至室温后，将步骤一中消毒好的烟草种子转移到MS培养基中培养。步骤三此过程在无菌条件下完成取步骤二中生长20d后的烟草子叶切成Imm 左右，在以下培养基中诱导烟草愈伤组织大量元素硝酸铵(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸钾 (KNO3) I. 9g/L、二水合氯化钙(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、七水合硫酸镁(MgSO4 · 7H20) O. 37g/ L、磷酸二氢钾(KH2PO4)O. 17g/L ;微量元素碘化钾(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、
5四水合硫酸锰(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合锰酸钠(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸铜(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化钴 (CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;铁盐七水合硫酸亚铁(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L ;有机物质肌醇O. lg/L、烟酸O. 5mg/L、维生素 B6O. 5mg/L、维生素 B1O. lmg/L、甘氨酸 2. Omg/L ;激素:2,4-二氯苯氧乙酸(2,4_D)0. 5mg/L、 激动素(KT)0.05mg/L ;葡萄糖2% (质量体积比)；琼脂7g/L。本步骤中培养基pH值调节到5. 6，培养条件为25 °C，14小时光照，光强40 μ E · m_2 · s'步骤四配制KCMS培养基。培养基的成分组成及工作浓度如下大量元素 硝酸铵(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸钾(KNO3) I. 9g/L、二水合氯化钙(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、 七水合硫酸镁(MgSO4 · 7H20) O. 37g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4) O. 17g/L ;微量元素碘化钾(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、四水合硫酸锰(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合锰酸钠(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸铜 (CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化钴(CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;铁盐七水合硫酸亚铁 (FeSO4 ·7Η20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA ·2Η20) 37. 3mg/L ;肌醇 O. 5mg/ L ;维生素B1L 3mg/L ;2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. 2mg/L、激动素(KT)O. lmg/L ;聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)O. 5g/L ;磷酸二氢钾(KH2PO4) 200mg/L ;琼脂8_10g/L ;蔗糖30g/L。灭菌前将培养基pH调节至5.8。步骤五KCMS培养基灭菌。将步骤四中所述KCMS培养基成分分成三部分独立灭菌。三部分分别为铁盐(七水合硫酸铁(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L)、微量元素(碘化钾(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/ L、四水合硫酸锰(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合锰酸钠(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸铜(CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化钴 (CoCl2 ·6Η20)0. 025mg/L)和KCMS培养基其他营养成分(大量元素、肌醇、维生素&、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激动素(KT)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、琼脂和蔗糖-各成分工作浓度请见步骤四)。以上三部分KCMS培养基营养成分分别进行湿热灭菌。铁盐部分灭菌条件为121. 3 °C 30min，微量元素部分灭菌条件为121. 3 °C 30min，KCMS培养基其他营养成分部分灭菌条件为121. 30C 20min。灭菌完成待以上三部分KCMS培养基营养成分均冷却至50或52或54或56或58或60°C后在无菌操作台上将它们混合均匀，并分装至IOOmL三角瓶，每瓶分装20mL KCMS培养基。步骤六待步骤五中IOOmL三角瓶内KCMS培养基自然冷却至室温并黑暗水平搁置 2或4天后，将步骤三中诱导形成的烟草愈伤组织转移到凝固好的KCMS培养基表面，放置在光照培养箱中培养。培养条件为24h黑暗，培养箱温度25°C，培养箱湿度18% -20%, 20 或21或22或23或24天继代一次。实验例经实验证实，常规方法诱导出的烟草愈伤组织增殖过程中的褐化率为52. 4%，本方法中的烟草愈伤组织的褐变率为12. 1%。
权利要求
1 .一种抑制烟草愈伤组织继代培养过程中褐化的方法，其步骤是A :配制KCMS培养基培养基的成分组成及工作浓度如下大量元素为硝酸铵I. 65g/ L、硝酸钾I. 9 g/L、二水合氯化钙O. 44 g/L、七水合硫酸镁O. 37 g/L、磷酸二氢钾0.17 g/ L ;微量元素碘化钾O. 83 mg/L、硼酸6. 2 mg/L、四水合硫酸锰22. 3 mg/L、七水合硫酸锌 8.6 mg/L、二水合锰酸钠O. 25 mg/L、五水合硫酸铜O. 025 mg/L、六水合氯化钴O. 025 mg/ L ;铁盐七水合硫酸亚铁27. 8 mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L ;肌醇O. 5 mg/L ； 维生素B1 I. 3 mg/L ;激素2，4-二氯苯氧乙酸O. 2mg/L、激动素O. I mg/L ;聚乙烯基卩比咯烧酮O. 5g/L ;磷酸二氢钾200 mg/L ;琼脂8_10g/L ;蔗糖30g/L ;灭菌前将培养基pH值调节至5.6~6 ；B =KCMS培养基灭菌将A步骤中所述KCMS培养基成分分成三部分灭菌，三部分分别为铁盐七水合硫酸铁27. 8 mg/L、二水合乙二胺四乙酸二钠37. 3 mg/L ;微量元素碘化钾O.83 mg/L、硼酸6. 2 mg/L、四水合硫酸锰22. 3 mg/L、七水合硫酸锌8. 6 mg/L、二水合锰酸钠O. 25 mg/L、五水合硫酸铜O. 025 mg/L、六水合氯化钴O. 025 mg/L和KCMS培养基其他营养成分大量元素、肌醇、维生素氏、2，4-二氯苯氧乙酸、激动素、聚乙烯基吡咯烷酮、磷酸二氢钾、琼脂和蔗糖，以上三部分KCMS培养基营养成分分别进行湿热灭菌，铁盐部分灭菌条件为121. 30C 30min，微量元素部分灭菌条件为121. 3°C 30min, KCMS培养基其他营养成分部分灭菌条件为121. 3°C 20min，灭菌完成后以上三部分KCMS培养基营养成分均冷却至 50-60°C，在无菌操作台上混合均匀，并分装至100 mL三角瓶，每瓶分装20 mL KCMS培养C :待B步骤中100 mL三角瓶内KCMS培养基自然冷却至室温，并黑暗水平搁置2_3天后，将烟草愈伤组织转移到凝固好的KCMS培养基表面,放置在光照培养箱中培养,培养条件为22-26h黑暗，培养箱温度24-26°C，培养箱湿度18%_20%，20-24天继代一次。
全文摘要
本发明公开了一种抑制烟草愈伤组织继代过程中褐化的方法，其步骤A、选取烟草种子萌发出的子叶为组织培养的外植体；B、通过平衡灭菌前培养基pH值和琼脂含量使培养基达到适合愈伤组织生长的最佳凝固效果；C、铁盐与微量元素分开灭菌；D、在培养基中加入0.5g/LPVP，并使培养箱湿度控制在18%-20%。该方法简单易行，操作方便，有效抑制了烟草愈伤组织继代过程中的褐变，效果好，烟草愈伤组织增殖系数可达到11.29(倍)；另外，该发明为烟草愈伤组织悬浮培养提供了优良的细胞种源。该方法培养的烟草愈伤组织松软，为获得分散均匀的悬浮细胞系提供了良好的条件。
文档编号A01H4/00GK102577953SQ20121003096
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者刘永定, 尹黎燕, 毕永红, 胡征宇, 黄文敏 申请人:中国科学院水生生物研究所