专利名称：一种水稻抗稻瘟病基因Pi9的功能分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农作物分子遗传育种学领域，具体涉及一种水稻抗稻瘟病基因的功能分子标记及其应用。
背景技术：
水稻是我国最重要的粮食作物之一，其对保障我国粮食安全具有至关重要的意义。长期以来，水稻生产遭受一些病虫害的严重威胁。稻瘟病是世界范围内对水稻生产危害最严重的病害之一，其危害不但降低水稻产量，而且影响稻米品质，给水稻生产造成严重损失。长期的生产实践表明，培育和合理利用抗病品种是控制稻瘟病最经济有效和对环境安全的途径。近60多年以来，各国科学家从多种水稻抗病资源中鉴定了 70多个抗病基因，一些抗稻瘟病基因也已被应用到水稻抗病育种中。由于不同抗病基因间存在一定的抗谱重叠性，常规育种方法存在表型鉴定困难、选择效率扁低的局限性，尤其难以实现多个抗病基因聚合在同一品种中。通过分子标记辅助选择可以克服这一困难。近年来，不少抗性基因已被精细定位或被克隆，与这些基因紧密连锁的SSR或其它分子标记的应用促进了多抗病基因聚合育种的发展。另一方面，基因克隆的结果显示抗病基因往往是成簇存在，且不同复等位基因之间、功能型序列与非功能型之间序列高度同源，一般的连锁标记仍然难以准确甄别各种抗病功能基因，且存在一定的预测误差率。基于功能基因DNA序列与其等位非功能基因DNA序列之间特异多态性的功能标记(Functional marker)是一种可以直接判断某一特定功能基因存在与否的标记，开发和应用抗病基因的功能标记可以大大提高分子标记辅助选育多抗病基因聚合水稻品种的效率。
是一个抗谱很广的抗病基因。研究表明，该基因对来自13个国家的43个稻瘟病菌株均表现出很高的抗性(Liu et al.2002)。位于第6染色体，这一位点同时还实有Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi26(t)、P1-40 (t)和⑷等多个复等位基因。开发/ 夕基因的功能分子标记，对充分利用这一抗性基因，改良我国水稻抗病性有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻抗稻瘟病基因的功能分子标记及其应用。通过检测该功能分子标记，可以准确判断所选择水稻植株是否具有抗病基因Pi9，加快抗稻瘟病水稻品种选育进度。本发明通过功能基因与非功能等位序列相比，发现水稻抗稻瘟病功能基因存在一个IObp的插入/缺失位点，位于该基因启动子-516/-517间，核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示。由此本发明提供了一种用于鉴别水稻抗稻瘟病功能基因的引物组合，所述引物组合由如SEQ ID N0.2所示的DNA序列和如SEQ ID N0.3所示的DNA序列组成。正向引物F9-F序列是5 ' -TGATTATGTTTTTTATGTGGGG-3 '，反向引物F9-R序列是5' -ATTAGTGAGATCCATTGTTCC-3;。根据上述引物组合，本发明还提供了一种建立水稻抗稻瘟病基因功能分子标记的方法，包括以下步骤:
1)提取水稻样品基因组DNA；
2)利用所述的引物组合对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增产物是否为一条128bp条带，判断其样品基因组是否具有功能基因，即如果能够扩增出一个128bp的标记片段，则标志着其样品基因组存在抗稻 瘟病基因/具体方案如下:
1)取水稻叶片组织，提取水稻样品的基因组DNA；
2)利用引物组合F9-F/F9-R对水稻样品DNA进行PCR扩增；
3)PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺胶上进行电泳检测，如果扩增产物是一个128bp的标记片段，则标志所检测水稻植株具有抗稻瘟病Pi9功能基因。本发明另外保护了所述引物组合在选育抗稻瘟病水稻中的应用，其通过以下步骤:
O以携带抗稻瘟病功能基因的水稻抗病品系75-1-127或其衍生系与其他水稻品种杂交或回交并繁衍后代群体；
2)提取上述所获得群体中单个植株的基因组DNA，用所述引物组合进行PCR反应，如果能够扩增出一个128bp的标记片段，则标志着所检测水稻植株存在抗稻瘟病基因本发明的有益效果:
本发明通过比较水稻抗稻瘟病产相功能基因和非功能产相等位基因间的DNA序列，在Pi9功能基因启动子区确定了一个特有的缺失多态性，并开发了基于PCR引物组合F9-F/F9-R的功能标记。通过该功能性分子标记可以准确检测不同水稻品种的基因组中是否含有Ρ 9功能基因以及其纯合状态，可应用于筛选水稻杂交转育后代植株，提高水稻抗稻瘟病材料的选育效率，获得含Pi9功能基因的抗稻瘟病水稻品种。I)本发明提供的标记位于A 没基因的启动子区，在遗传上与抗病性呈共分离，选择效率达到100%。前人报道的标记均与基因存在一定的遗传距离，用于选择基因时存在一定的预测误差率。2)本发明提供的标记是一种共显示标记，准确性高、重复性好，并且能够区分出杂合体和纯合体，可以快速获得具有纯合功能基因的抗稻瘟病水稻植株。3)应用本发明提供的标记选育具基因的抗稻瘟病水稻品种，具有选择目标明确，选择效率高以及节约成本的优势。在常规水稻抗病育种中，一般是根据育种材料在苗期或抽穗期所表现出来的抗瘟性状进行选择，其受环境影响较大，不同年份间差别也较大，筛选鉴定的可靠性低。常规方法应用于聚合多抗病基因材料育种尤其受限制。其原因在于不同抗病基因间存在一定的抗谱重叠性，常规表型筛选到的材料并不一定同时聚合多抗性基因。基于本发明提供的抗稻瘟病基因/功能分子标记，可以在苗期取样，提取水稻植株DNA,通过PCR快速鉴定出携带功能基因单株，能够有效控制育种群体规模，显著节约育种筛选成本。通过结合应用其它抗病基因标记，Ρ 9功能分子标记还能应用于水稻聚合多抗病基因育种，提高水稻抗稻瘟病株系选择效率。
图1为部分水稻品种等位基因启动子区序列分析。其中，75-1-127:75-1-127 ；NPB:日本晴；9311:9311 ;D62_B:D62A ;TF_B:天丰A ；SE21S:SE21S ;G46_B:冈 46A ；MH63:明恢 63 ；MY46:密阳 46 ;J23_B:金 23A ；GH998:广恢 998 ；GF-B:谷丰 A ；F838:辐 838 ；C64:测 64 ；SH527:蜀恢 527 ；PA64S:培矮 64S ;II3_B:I1-32A ；GZ63S:广占 63S ；ZGB:早冈 A ；LTP-B:龙特浦 A ；02428:02428 ；C039:C039。图2为基于F9-F/F9-R引物组合功能分子标记检测部分水稻品种基因组DNA的电泳图谱。其中，M:分子量 Marker ；1:75-1-127 ；2:日本晴；3:9311 ；4:D62A ；5:天丰 A ；6:SE21S ；7:冈 46A ；8:明恢 63 ；9:密阳 46 ；10:金 23A ；11:广恢 998 ；12:谷丰 A ;13:辐 838 ；14:测 64 ；15:蜀恢 527 ；16:培矮 64S ；17:1I_32A ；18:广占 63S ；19:早冈 A。含有/ 沒功能基因的75-1-127样本显示一条128bp条带，其它携带/7^非功能等位基因品种的样本显示一条137bp或138bp的条带。
具体实施例方式 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1 功能基因序列标记性结构确定
通过分析来源于水稻品种75-1-127的功能基因区段序列(Genbank DQ454157)和来源于水稻品种日本晴的非功能/7ZP等位区段序列(Genbank DQ454158),发现在启动子区域，两者具有较多差异。进一步针对功能基因启动子-7至-793区段设计特异性引物组合 Pro9-F: 5’-CGGTTATAGATGAATATAGTTC-3’，Pro9-R: 5’-GTTCGACTCTCCCTTCAAGC-3’，以携带产相功能基因水稻品种75-1-127基因组DNA以及其它27个水稻品种(日本晴、9311、02428、BL123、丽江团黑谷 、Katy、珍97A、龙特浦A、早冈A、I1-32A、谷丰A、天丰A、D62A、冈46A、金23A、广占63S、明恢63、蜀恢527、明恢86、ZR101、广恢998、辐838、测64、密阳46、SE21S、培矮64S、C039)基因组DNA为模板，进行PCR扩增并对PCR产物测序。分析上述28个水稻品种PCR产物测序结果，发现非功能等位区段均在相对应于功能基因启动子-516/-517间，具有一个序列为5’ -YGATGGTTTC-3’(其中Y代表碱基C或者T)的IObp插入片段，(附图1显示部分品种序列分析结果)，即功能基因在其启动子区存在一个IObp大小的标记性缺失。实施例2 功能分子标记建立
根据/功能基因启动子区与等位非功能/7^相应区段的测序分析结果，设计了一对特异性引物组合 F9-F: 5 ' -TGATTATGTTTTTTATGTGGGG-3 '，F9-R:5’ -ATTAGTGAGATCCATTGTTCC-3’。F9_F/ F9-R引物组合特异性对应Ρ 9功能基因启动子-451至-578序列，扩增片段包括了功能基因启动子-516/-517的特异性缺失位点(附图1)。利用F9-F/ F9-R引物组合对28个水稻品种75-1-127、日本晴、9311、02428、BL123、丽江团黑谷、Katy、珍97A、龙特浦A、早冈A、I1-32A、谷丰A、天丰A、D62A、冈46A、金23A、广占63S、明恢63、蜀恢527、明恢86、ZR101、广恢998、辐838、测64、密阳46、SE21S、培矮64S、C039的基因组DNA进行PCR扩增。PCR 反应体系为 25 μ L，含有模板 DNA 50 ng，2 X Reaction Mix 12.5 μ L (含MgCl2、dNTP 等)，10 “] 引物卩9-卩和卩9-1 各1 yL，0.5U Golden DNA Polymerase (2.5U/12.5 μ L，TIANGEN生物技术公司)，ddH20补齐至25 μ L0反应条件为:94°C 5min，94°C 30S,58°C 30S,72°C 30S，共30个循环，最后72°C延伸8 min。扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分型。实施例结果表明，含有功能基因的75-1-127样本显示一条128bp条带,其它携带非功能等位区段品种的样本显示一条137bp或138bp的条带(附图1显示部分品种扩增样品凝胶电泳分析结果)，两者带型可以在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中明显区分开。该标记是一个共显示标记，可以检测出水稻植株是否携带功能基因以及以及其基因型是纯合或杂合，即如果扩增产物是128bp的单一标记片段，标志着水稻植株染色体中的基因是纯合的，如果扩增产物是包含一个128bp片段和一个137bp或138bp片段，则标志着水稻植株染色体中的基因是杂合型。实施例3 功能分子标记验证及应用
以不含功能基因的水稻品种日本晴和功能基因供体品种75-1-127为亲本配置F2群体，以稻瘟菌菌株KJ201对F2群体247个植株进行苗期人工接种，获得了 176个抗性植株。提取这些抗性植株的基因组DNA，以引物组合F9-F/F9-R进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分型。实施例结果表明，176个抗性植株的PCR扩增样品均能检测到代表功能基因的128bp特异条带，选择效率达到100%。利用75-1-127和水稻恢复系闽恢3301配置组合，将产相功能基因向闽恢3301转育。配组并筛选获得了 BC3F1代材料。利用引物组合F9-F/F9-R对BC3F1代植株的基因组DNA进行PCR扩增，检测到20个单株的样品具有代表功能基因的128bp特异条带，与这些单株的抗病性生物学鉴定结果一致。应用功能分子标记能够快速准确鉴定出携带 基因的水稻植株，加速水稻抗稻瘟病品种培育的进程。
权利要求
1.一种水稻抗稻瘟病基因/7^的功能分子标记，其特征在于:水稻抗稻瘟病功能基因Z7^存在一个IObp的插入/缺失位点，位于该基因启动子-516/-517间，核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
2.一种用于鉴别水稻抗稻瘟病功能基因的引物组合，其特征在于:所述引物组合由如SEQ ID N0.2所示的DNA序列和如SEQ ID N0.3所示的DNA序列组成。
3.一种建立水稻抗稻瘟病基因功能分子标记的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)提取水稻样品基因组DNA； 2)利用权利要求2所述的引物组合对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增产物是否为一条128bp条带，判断其样品基因组是否具有功能基因，S卩如果能够扩增出一个128bp的标记片段，则标志着其样品基因组存在抗稻瘟病基因
4.如权利要求2所述的引物组合在选育抗稻瘟病水稻中的应用，其通过以下步骤: O以携带抗稻瘟病功能基因的水稻抗病品系75-1-127或其衍生系与其他水稻品种杂交或回交并繁衍后代群体； 2)提取上述所获得群体中单个植株的基因组DNA，用权利要求2所述引物组合进行PCR反应，如果能够扩 增出一个128bp的标记片段，则标志着所检测水稻植株存在抗稻瘟病基因 Ρ 9。
全文摘要
本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pi9的功能分子标记及其应用，属于农作物分子遗传育种学领域。本发明通过发现水稻抗稻瘟病功能基因Pi9存在一个10bp的插入/缺失位点，位于该基因启动子-516/-517间，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，并在此基础上开发了Pi9基因的功能分子标记的方法。通过检测该功能分子标记，可以准确检测不同水稻品种的基因组中是否含有Pi9功能基因以及其纯合状态，可应用于筛选水稻杂交转育后代植株，提高水稻抗稻瘟病材料的选育效率，有效控制育种群体规模，显著节约育种筛选成本，获得含Pi9功能基因的抗稻瘟病水稻品种。
文档编号A01H1/04GK103146695SQ201310065310
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者陈松彪, 王 锋, 田大刚, 陈在杰, 林艳, 宋亚娜, 胡昌泉 申请人:福建省农业科学院生物技术研究所