介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法

介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法
【专利摘要】本发明涉及一种介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法，所述核苷酸序列编码下述RNA分子，所述RNA分子抑制植物MS45基因表达，包括SEQ?ID?NO:1所示的至少19个连续核苷酸和/或其互补序列。本发明首次利用RNAi技术构建了MS45雄性不育系，所述MS45雄性不育系抑制了玉米MS45基因的表达，可获得完全雄性不育的植株，不仅能够缩短杂交育种的周期，更有针对性的解决当前雄性不育系资源匮乏，杂交制种纯度不高的现状，而且省去了杂交制种过程中去雄的步骤，降低了机械去雄对玉米植株的机械损伤和产量影响，保证了杂交种质的纯度和产量，从而实现最大程度的经济效益。
【专利说明】介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法，特别是涉及一种利用RNAi技术特异性剔除或关闭育性基因的表达来生产雄性不育植株的遗传方法。
【背景技术】
[0002]杂种优势是指Fl杂交种的表现比产生Fl的亲本的表现优秀。在作物植物中杂种优势通常在生产中显示为较大的植物、胁迫耐受性、疾病抗性、一致性和提高的产量，这些被统称为杂交种活力。
[0003]杂种优势在很多重要的作物品种中已被观察到并记载，杂交种的发展已被植物育种家们视为常规。但是，当植物中存在有效的和经济的授粉控制方法以保证异花授粉和防止自花授粉时，杂交种才能被用于上述植物。授粉控制机制包括机械的、化学的和遗传的方 法。
[0004]如果植物已空间隔离雄性和雌性的花或者分离雄性和雌性植株，则可以适用杂交种植物生产的机械方法。例如，在玉米植株的顶端花序中具有生产花粉的雄花，雌花在沿着茎的叶轴部。玉米的异交是通过对母本机械去雄以防止自交来确保的。尽管目前去雄被用于植物的杂交种种子生产中，如玉米,但是依据母本去雄的实际去雄成本和产量损失,上述过程是劳动密集型的且是昂贵的。另外，大部分作物植物的功能性雄性和雌性器官均在同一朵花中，因此去雄不是一个简单的过程。尽管可以在散粉前用手除去花粉形成器官，但上述杂交种生产的方法是极端劳动密集型的和昂贵的。
[0005]生产杂交植物的化学方法包括使用化学药品杀死或阻止可育花粉的形成。这些化学药品被称为杀配子剂，被用于给予暂时的雄性不育。由于化学药品的费用和有效性、以及应用的持续时长和可靠性，使用杀配子剂进行的杂交植物的商业化生产是受限制的。杀配子剂的一个严重的局限性在于其具有植物毒性的影响，其严重程度取决于基因型。其它局限性包括这些化学药品对于延长花期中的作物不一定是有效的，因为生长的新花可能没有被影响。因此，需要重复应用上述化学药品。
[0006]上世纪九十年代，Mariani等人开创了人工制备雄性不育系的新途径，他们利用来自烟草的花药绒毡层的特异启动子(TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)构建表达盒转化烟草和油菜，导致转基因植株的花药绒毡层被破坏，形成雄性不育系，而并未影响转基因植株的其它性状。除利用Barnase构建雄性不育系之外，当前很多研究表明其它的功能基因也可被广泛应用于基因工程方法来构建转基因雄性不育植株。
[0007]Van der Meer等通过RNA干扰的方法抑制与花粉发育相关基因查耳酮合酶(CHS)的表达,实现了矮牵牛的雄性不育；Kitashiba等将反义交替氧化酶(alternativeoxidase)与TA29相连构成嵌合基因转化烟草，造成转基因烟草部分花粉败育。自从MS45基因被克隆出来，主要用该基因来恢复MS45突变体的育性，至今未发现利用RNAi技术构建MS45雄性不育系的相关报道。
【发明内容】

[0008]本发明的目的是提供一种介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法，即利用RNAi技术以获得新的MS45雄性不育株系。
[0009]为实现上述目的，本发明提供了一种核苷酸序列，其特征在于，其编码下述RNA分子，所述RNA分子抑制植物MS45基因表达，包括SEQ ID NO:1所示的至少19个连续核苷酸和/或其互补序列。
[0010]进一步地，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO:1第1-800位所示的至少19个连续核苷酸和/或其互补序列。
[0011]更进一步地，所述核苷酸序列包括SEQ ID N0:2和/或其互补序列。
[0012]优选地，所述核苷酸序列为SEQ ID N0:3。
[0013]为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述核苷酸序列。
[0014]为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述核苷酸序列或所述表达盒的重组载体。
[0015]为实现上述目的，本发明还提供了一种核糖核苷酸序列，其抑制植物MS45基因表达，由下述DNA序列转录，所述DNA序列包括所述核苷酸序列。
[0016]为实现上述目的，本发明还提供了一种用于抑制植物MS45基因表达的方法，包括利用所述核糖核苷酸序列来抑制植物MS45基因的表达。
[0017]为实现上述目的，本发明还提供了一种诱导植物雄性不育的方法，包括利用所述核糖核苷酸序列来抑制植物MS45基因的表达。
[0018]进一步地，所述核糖核苷酸序列包括第一核糖核苷酸序列和第二核糖核苷酸序列，所述第一核糖核苷酸序列抑制植物MS45基因的表达，所述第二核糖核苷酸序列与所述第一核糖核苷酸序列互补。
[0019]更进一步地，所述核糖核苷酸序列还包括间隔序列。
[0020]优选地，所述核糖核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
[0021]为实现上述目的，本发明还提供了一种产生雄性不育植株的方法，包括将所述表达盒引入植物细胞以产生转基因植株。
[0022]优选地,所述植物为大豆、小麦、大麦、玉米、烟草、水稻、油菜或向日葵。
[0023]本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
[0024]在植物中进行转录后基因遏制的优选方法使用正义定向和反义定向的、经过稳定的转录来的RNA，例如作为发卡和茎环结构。用于进行转录后基因遏制的优选DNA构建体是下述这样的，其中，第一段片段编码展示出反义定向的RNA，其展示出与待遏制的目标基因片段之间的高度相同性，所述第一段片段与第二段片段相连，第二段片段编码展示出与第一段片段具有高度互补性的RNA。此类构建体被预计会形成茎环结构(这是通过第一段片段与第二段片段杂交形成的)和来自连接两者的环结构。
[0025]本发明中“核酸”指从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单或双链聚合物。可选地，“核酸”还可含有非天然存在的或被改变的碱基，其允许通过聚合酶的正确阅读，不会降低该核酸编码的多肽的表达。“核苷酸序列”指作为单独的单链存在或存在于二体中的核酸的正义和反义链。“核糖核酸”(RNA)包括RNAi (RNA干扰)、dsRNA (双链 RNA)、siRNA (小干扰 RNA)、mRNA (信使 RNA)、miRNA (微小 RNA)、tRNA (转运 RNA、被或未被相应的酰化氨基酸加上电荷的)以及cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂交体。“核酸片段”、“核酸序列片段”或更常见的“片段”将被本领域技术人员理解为:其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转运RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列和更小的工程改造过的核苷酸序列，所述序列表达或可被改造为表达蛋白质、多肽或肽。
[0026]本发明中“表达”指从本发明公开的核酸获得的正义或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以表示mRNA向多肽或蛋白质的翻译。本发明中“正义”RNA指对应于下述序列或片段的RNA转录本，所述序列或片段以能通过植物细胞翻译成蛋白质的mRNA的形式存在。本发明中“反义” RNA指与植物中正常产生的mRNA的全部或一部分互补的RNA。反义RNA的互补可以是针对特定基因转录本的任何部分的，即5’非编码序列、3’非编码序列、内含子或编码序列。本发明中“RNA转录本”指对DNA序列进行的由RNA聚合酶催化的转录得到的产物。当RNA转录本是DNA序列的完全互补拷贝时，其被称为一级转录本，或者其可以是对一级转录本进行转录后加工获得的RNA，其被称为成熟RNA。
[0027]用于本发明的DNA片段长度为至少大约19至大约23个核苷酸，或者大约23至大约100个核苷酸，但是要小于大约2000个核苷酸。
[0028]本发明中“对基因表达的抑制”指目标基因的蛋白和/或mRNA产物水平不存在(或可观察到的降低)。特异性指:抑制目标基因而对细胞其它基因无作用并且对产生dsRNA分子的细胞内任何基因没有影响的能力。[0029]本发明中dsRNA或SiRNA分子包含双链的经聚合核糖核苷酸，其可以包括对磷酸酯糖主链或核苷的修饰。RNA结构中的修饰可被加上尾巴，以允许特异性遗传抑制。
[0030]本发明中可通过酶方法对dsRNA分子进行修饰，可以产生siRNA。siRNA可针对目标基因有效介导负调作用。这种酶方法可通过在真核RNAi途径中利用植物细胞中存在的RNAse III酶或DICER酶来完成。该方法还可利用通过重组DNA技术引入到植物细胞中的重组DICER或RNAse III来进行，这是本领域技术人员容易知道的。天然存在于植物细胞中的或通过重组DNA技术制造的DICER酶或RNAse III能将较大的dsRNA链切割为较小的寡核苷酸。DICER酶能特异性地将dsRNA分子切割为siRNA片段，其中，每个siRNA片段大约为19-25个核苷酸长，而RNAse III酶通常将dsRNA分子切割为12-15个碱基对的siRNA。通过上述任何酶产生的siRNA分子具有2-3个核苷酸的3’悬挂和5’磷酸和3’羟基末端。通过RNAse III酶产生的siRNA与在真核RNAi途径中通过DICER制造的相同，因此可被靶向，并在松散之后被内在的细胞内RNA降解机制降解，分离为单链RM,以及与目标基因转录的RNA序列杂交。这种方法可对目标基因核苷酸序列编码的RNA序列进行有效降解或除去。结果即为目标基因沉默。
[0031]dsRNA分子可以通过体内或体外合成。dsRNA可以由单条自身互补的RNA链形成，或者可以由两条互补的RNA链形成。细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内转录，或者克隆的RNA聚合物可被用于体内或体外转录。可以通过下述方法来靶向抑制:在器官、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件的刺激(例如，感染、胁迫、温度、化学诱导剂);和/或在发育阶段进行的工程性转录。RNA链可以是或不是聚腺苷化的；RNA链可以能或不能被细胞的翻译装置翻译为多肽。
[0032]本发明的RNA、dsRNA、SiRNA或miRNA由本领域技术人员通过化学方法或酶方法来生产，这是通过人工或自动的反应或在另一生物体内来进行的。还可通过部分或完全的有机合成来制造RNA ;可通过体外酶合成或有机合成引入任何经过修饰的核糖核苷酸。可以通过细胞内RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如T3、T7、SP6)来合成RNA。表达构建体的使用和制造是本领域已知的。如果通过化学合成或通过体外酶合成，可在引入细胞之前对RNA进行纯化。例如可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱或其组合，从混合物中纯化出RNA。或者，可以在不纯化或仅进行最小限度的纯化的情况下来使用RNA，以避免由于样品加工导致的损失。RNA可被干燥以贮藏，或者溶解于水溶液中。溶液可以含有缓冲剂和盐，以促进二体链的稳定和/或退火。 [0033]本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述目标基因的调节序列。
[0034]所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米ubi启动子、水稻G0S2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(Pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。
[0035]所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0036]所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV (玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP);苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4);烟草花叶病毒(TMV)前导序列。
[0037]所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。
[0038]对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Actl内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。
[0039]所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
[0040]本发明的核苷酸序列可以包含被“间隔序列”分离开的反向重复。间隔序列可以是包含下述任何核苷酸序列的区域，如果需要的话，所述核苷酸序列能促进每段重复之间二级结构形成。间隔序列是用于mRNA的正义或反义编码序列的一部分。或者，间隔序列可以包含能与核酸分子共价连接的核苷酸或其同源物的任何组合。间隔序列可包含长度为至少大约10-100个核苷酸的核苷酸序列，或者长度为至少大约100-200个核苷酸，长度为至少大约200-400个核苷酸，或者长度为至少大约400-500个核苷酸。
[0041]本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示:启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
[0042]核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
[0043]本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45°C条件下用6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50°C条件下用
2.0 X SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0XSSC、50°C到高度严格条件的约0.2XSSC、50°C。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22°C，升高到高度严格条件的约65°C。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。
[0044]将本发明中所述构建体或所述重组载体导入植物，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
[0045]本发明中所述的将核苷酸序列“引入”植株时，其表示可通过直接转化的方法发生，所述方法例如对植物组织的农杆菌介导的转化、微粒发射轰击、电穿孔等；或者可通过将具有异源核苷酸序列的植株与另一植株杂交来进行，使得后代具有并入它们基因组的核苷酸序列。此类育种技术是本领域技术人员公知的。
[0046]本发明提供了一种介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法，具有以下优点:
[0047]1、本发明首次利用RNAi技术构建了 MS45雄性不育系。
[0048]2、败育彻底。本发明利用RNAi技术构建的MS45雄性不育系抑制了玉米MS45基因的表达，可获得完全雄性不育的植株。
[0049]3、效益好，纯度高。本发明利用RNAi技术构建的MS45雄性不育系不仅能够缩短杂交育种的周期，更有针对性的解决当前雄性不育系资源匮乏，杂交制种纯度不高的现状；而且省去了杂交制种过程中去雄的步骤，降低了机械去雄对玉米植株的机械损伤和产量影响，保证了杂交种质的纯度和产量，从而实现最大程度的经济效益。
[0050]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【专利附图】

【附图说明】
[0051]图1为本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的重组克隆载体DBNOl-T构建流程图；
[0052]图2为本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的重组表达载体DBN100348构建流程图；
[0053]图3为本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的转基因玉米植株Ttl代的花粉和花药发育图；
[0054]图4为本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的转基因玉米植株Tl代的花粉和花药发育图。
【具体实施方式】
[0055]下面通过具体实施例进一步说明本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的技术方案。
[0056]第一实施例、rZmMS45核苷酸序列的合成
[0057]根据已知ZmMS45核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)，获得本发明RZmMS45核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示；所述rZmMS45核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3所示，所述rZmMS45核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述rZmMS45核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)的5’端还连接有RsrII酶切位点，所述rZmMS45核苷酸序列(SEQ ID N0:3)的3’端还连接有BsaI酶切位点。
[0058]第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0059]1、构建含有rZmMS45核苷酸序列的重组克隆载体DBNOl-T
[0060]将合成的rZmMS45核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM_T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；fl表示噬菌体fl的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；rZmMS45为rZmMS45核苷酸序列(SEQ ID N0:3) ；MCS为多克隆位点)。[0061]然后将重组克隆载体DBNOl-T用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其热激条件为:50 μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ I质粒DNA(重组克隆载体DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C振荡培养I小时(IOOrpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal(5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37 °C条件下培养过夜。碱法提取其质粒:将菌液在12000rpm转速下离心Imin,去上清液,沉淀菌体用100 μ I冰预冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (4Μ醋酸钾，2Μ醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min ;于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min ;于温度4V、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70%的乙醇洗涤后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于温度37°C下水浴30min，消化RNA ;于温度_20°C保存备用。
[0062]提取的质粒经RsrII和BsaI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的所述rZmMS45核苷酸序列为序列表中SEQID NO: 3所示的核苷酸序列，即rZmMS45核苷酸序列正确插入。
[0063]2、构建含有rZmMS45核苷酸序列的重组表达载体DBN100348
[0064]用限制性内切酶RsrII和BsaI分别酶切重组克隆载体DBNO 1_T和表达载体DBNBC-01 (载体骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供))，将切下的rZmMS45核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01的RsrII和BsaI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100348，其构建流程如图2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右边界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因启动子(SEQ ID N0:4)；rZmMS45:rZmMS45核苷酸序列(SEQ ID NO:3) ;Nos:胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ IDNO: 5) ；PM1:磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:6) ；LB:左边界)。
[0065]将重组表达载体DBN100348用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条件为:50μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ I质粒DNA (重组表达载体DBN100348)，42 °C水浴30秒；37°C振荡培养I小时(IOOrpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L, NaC110g/L,琼脂15g/L,用NaOH调pH至7.5)上于温度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶RsrII和BsaI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100348在RsrII和BsaI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列，即rZmMS45核苷酸序列。
[0066]3、重组表达载体转化农杆菌
[0067]对己经构建正确的重组表达载体DBN100348用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其转化条件为:100 μ L 农杆菌 LBA4404、3 μ L质粒DNA (重组表达载体);置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶EcoRI和AatII对重组表达载体DBN100348酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100348结构完全正确。
[0068]第三实施例、转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株的获得及验证
[0069]1、获得转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株
[0070]按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31 (Z31)的幼胚与第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100348中的T-DNA (包括rZmMS45核苷酸序列、玉米Ubiquitin基因的启动子序列、PMI基因和Nos终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株；同时以野生型玉米植株作为对照。
[0071]对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将rZmMS45核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1:侵染步骤)。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(0D660=0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、鹿糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L, pH5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2:共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐
4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、琼脂8g/L,pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3:恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4:选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、琼脂8g/L ，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5:再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。
[0072]筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培养至约IOcm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28°C下培养16小时，再于20°C下培养8小时。
[0073]2、用TaqMan验证转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株 [0074]取转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株的叶片约IOOmg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测rZmMS45核苷酸序列的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
[0075]检测rZmMS45核苷酸序列拷贝数的具体方法如下:
[0076]步骤11、分别取转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各lOOmg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
[0077]步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA,具体方法参考其产品说明书；
[0078]步骤13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；
[0079]步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80_100ng/μ I ；
[0080]步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是:
[0081]以下引物和探针用来检测rZmMS45核苷酸序列:
[0082]引物I (MFl):CATCGTCCAGCACTGCTATTACC 如序列表中 SEQ ID N0:7 所示；
[0083]引物2 (MRl):TTTGCTCCATAGATCGTATGATGTG 如序列表中 SEQ ID NO:8 所示；
[0084]探针I (MPl):CAGCCAGACTGTCGGATGGACCACAC 如序列表中 SEQ ID NO:9 所示；
[0085]PCR反应体系为:
[0086]JumpStart?Taq ReadyMix? (Sigma) 10 μ I
[0087]50 X弓丨物/探针混合物I μ I
[0088]基因组DNA3μ I
[0089]水(ddH20)6μ I
[0090]所述50Χ引物/探针混合物包含ImM浓度的每种引物各45 μ 1，100 μ M浓度的探针50μ I和860 μ IlXTE缓冲液，并且在4°C，贮藏在琥珀试管中。
[0091]PCR反应条件为:
[0092]步骤温度时间
[0093]2195 0C5 分钟
[0094]2295 0C30 秒[0095]2360 °CI 分钟
[0096]24回到步骤22，重复40次
[0097]利用SDS2.3 软件(Applied Biosystems)分析数据。
[0098]实验结果表明，rZmMS45核苷酸序列己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株获得了含有单拷贝rZmMS45核苷酸序列的转基因玉米植株。
[0099]第四实施例、分析转基因玉米植株
[0100]针对植株整体形态对第三实施例中的具有单拷贝的所述转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株(Ttl) 12株加以评估，针对花药和花粉进行分析。除了雄性生育力的程度之外，在所述转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米对照植株之间没有观察到其它形态不同。结果表明:具有单拷贝的所述转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株(Ttl)均表现为完全雄性不育，所有植株(100%)都没有形成花粉(图3，花药干瘪呈黄色，无花粉染色)。而野生型玉米对照植株则是完全雄性可育的(图3，花药饱满呈绿色，正常花粉染色)。由完全雄性不育的所述转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株获得T1代种子，播种后长成T1代植株，所有T1代植株都没有花粉形成(图4)。
[0101]由此证明利用RNAi技术构建的转入rZmMS45核苷酸序列的玉米植株抑制了玉米MS45基因的表达，可获得完全雄性不育的植株。
[0102]综上所述，本发明首次利用RNAi技术构建了 MS45雄性不育系，所述MS45雄性不育系抑制了玉米MS45基因的表达，可获得完全雄性不育的植株；所述MS45雄性不育系不仅能够缩短杂交育种的周期，更有针对性的解决当前雄性不育系资源匮乏，杂交制种纯度不高的现状，而且省去了杂交制种过程中去雄的步骤，降低了机械去雄对玉米植株的机械损伤和产量影响，保证了杂交种质的纯度和产量，从而实现最大程度的经济效益。
[0103]最后所应说明的是，以上实施例仅用说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种核苷酸序列，其特征在于，其编码下述RNA分子，所述RNA分子抑制植物MS45基因表达，包括SEQ ID NO:1所示的至少19个连续核苷酸和/或其互补序列。
2.根据权利要求1所述核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包括SEQID N0:1第1-800位所示的至少19个连续核苷酸和/或其互补序列。
3.根据权利要求2所述核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包括SEQID NO:2和/或其互补序列。
4.根据权利要求3所述核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQID NO:3。
5.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求1-4任一项所述核苷酸序列。
6.一种包含权利要求1-4任一项所述核苷酸序列或权利要求5所述表达盒的重组载体。
7.一种核糖核苷酸序列，其特征在于，其抑制植物MS45基因表达，由下述DNA序列转录,所述DNA序列包括权利要求1-4任一项所述核苷酸序列。
8.一种用于抑制植物MS45基因表达的方法，其特征在于，包括利用权利要求7所述核糖核苷酸序列来抑制植物MS45基因的表达。
9.一种诱导植物雄性不育的方法，其特征在于，包括利用权利要求7所述核糖核苷酸序列来抑制植物MS45基因的表达。
10.根据权利要求9所述诱导植物雄性不育的方法，其特征在于，所述核糖核苷酸序列包括第一核糖核苷酸序列和第二核`糖核苷酸序列，所述第一核糖核苷酸序列抑制植物MS45基因的表达，所述第二核糖核苷酸序列与所述第一核糖核苷酸序列互补。
11.根据权利要求10所述诱导植物雄性不育的方法，其特征在于，所述核糖核苷酸序列还包括间隔序列。
12.根据权利要求11所述诱导植物雄性不育的方法，其特征在于，所述核糖核苷酸序列为 SEQ ID NO:3。
13.—种产生雄性不育植株的方法，其特征在于，包括将权利要求5所述表达盒引入植物细胞以产生转基因植株。
14.根据权利要求13所述产生雄性不育植株的方法，其特征在于，所述植物为大豆、小麦、大麦、玉米、烟草、水稻、油菜或向日葵。
【文档编号】A01H5/00GK103667277SQ201310750350
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】于彩虹, 李建勇, 李梅, 杨进孝, 陈淑阳 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心