棉蚜病毒全基因序列及其检测、分离和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种分离的DNA分子或其功能片段，其特征在于所述分离的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的分离的DNA分子及其功能片段可用于防治棉蚜虫害的用途。本发明还涉及一种棉蚜病毒，其特征在于所述棉蚜病毒的基因组序列如SEQ ID NO.1所示，以及产生所述棉蚜病毒的方法，和用于检测所述棉蚜病毒的引物、探针和试剂盒。棉蚜病毒基因信息的获得为开发棉蚜检测技术，棉蚜病毒应用技术的开发提供坚实的基础。对棉蚜病毒基因组的解析和相关检测方法的开发将能促进对该类病毒的研究和应用。
【专利说明】棉蚜病毒全基因序列及其检测、分离和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒基因组领域，具体涉及棉蚜病毒全基因序列及其检测和应用。
【背景技术】
[0002] 病毒是一类数量巨大的非细胞生物类群，在生态系统中占有重要的位置，只要有 生命的地方，就有病毒存在。与农业生产密切相关的病毒有2类，一类是造成动植物病害的 病毒，另一类是作为生物防治资源的病毒。植物病毒病是目前危害较为严重的一类植物病 害，由于缺少有效的防治方法，给农业生产造成了重大损失。昆虫生防病毒资源丰富，最早 进行生物防治的病毒为杆状病毒，棉铃虫核多角体病毒和颗粒体病毒是我国报道较多的生 防病毒种类，在生产上发挥一定的效果。因此，对作为生物防治资源的病毒的研究对于农业 生产具有极为重要的作用。
[0003] 棉姆Aphis gossypii Glover是广泛分布于世界各国的一种常见害虫，其取食和 传播植物病毒，对农业生产造成严重影响。由于棉蚜的植物寄主广泛，据记载全世界有棉蚜 的寄主植物76科285种，棉花和葫芦科瓜类为棉蚜的主要侨居寄主，这就使得棉蚜作为病 毒传毒媒介造成的危害十分严重。棉蚜具有聚集取食和转主迁移的特征，这又为使用病毒 进行生物防治棉蚜创造良好的条件。蚜虫病毒是一类特异感染蚜虫的Densovirus类病毒， 不同的蚜虫种类具有对应的转化型病毒。已有研究证明蚜虫病毒可以降低蚜虫的繁殖速 度，控制蚜虫的翅型分化。因此蚜虫病毒在蚜虫防治中具有广阔前途。在病毒应用和研究 过程中，需要实时了解病毒的存在，存在数量等信息。由于病毒颗粒较小，普通显微镜无法 直接观察，只有使用电镜进行检测。而电镜价格昂贵，样品处理复杂，而且已确颗粒结构病 毒种类较少，亲缘关系较近病毒外形相似，较难区分。棉蚜病毒基因信息的获得为开发棉蚜 检测技术，棉蚜病毒应用技术的开发提供坚实的基础。
【发明内容】
[0004] 本申请一方面提供了一种分离的DNA分子或其功能片段，所述分离的DNA分子的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述分离的DNA分子为在棉蚜体内克隆得到的棉蚜病毒 (Aphis gossypii virus，AGV)基因组序列。
[0005] 本申请另一方面提供了一种棉蚜病毒，其特征在于所述棉蚜病毒的基因组序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 本申请另一方面提供了一种产生本申请的棉蚜病毒的方法，其特征在于从棉蚜体 内分离所述棉蚜病毒。
[0007] 本申请另一方面提供了上述分离的DNA分子及其功能片段在用于防治棉蚜虫害 中的用途。
[0008] 本申请的病毒为一类新型蚜虫病毒，特异感染棉蚜，命名为棉蚜病毒（Aphis gossypii virus，AGV)。AGV 属于正链 ssRNA 病毒，无 DNA 阶段，属于 Densovirus 类病毒。
[0009] 根据已有文献报道，豌豆蚜病毒和桃蚜病毒可以破坏蚜虫的翅发育，具有防治蚜 虫的潜在作用，使得此类病毒在生产和科研应用具有较广前景。对该类病毒基因组的解析 和相关检测方法的开发将能促进对该类病毒的研究和应用。
[0010] 血清学检测和分子检测为实际应用较多检测方法，相对于要制备抗体的血清学检 测方法，分子检测耗时较短，成本较低。分子检测常用方法有普通PCR方法和荧光定量PCR 方法，荧光定量PCR方法是由普通PCR方法发展而来，是直接用荧光标记探针，可以对样品 中特定病毒进行定性、定量检测，检测灵敏度高于普通PCR，而且检测过程用时较少。
[0011] 本发明又一方面提供了一种用于检测本申请的棉蚜病毒的引物，其含有SEQ ID NO. 1或其反义序列所示核苷酸序列的15-45个，优选18-24个连续核苷酸。优选地，所述 引物为由SEQ ID N0. 2或其反义序列所示的核苷酸序列构成的正向引物和由SEQ ID N0. 3 或其反义序列所示的核苷酸序列构成的反向引物，正向引物和反向引物符合Tm值在55 - 65°C，二者Tm值不超过2°C，GC含量在40%- 60%。
[0012] 本发明又一方面提供了一种探针，与引物配合使用，用于检测本申请的棉蚜病毒， 所述探针含有SEQ ID NO. 1或其反义序列所示核苷酸序列的15-45个，优选20-30个连续 核苷酸，位于正向引物和反向引物之间。优选地，所述引物含有SEQ ID N0.4或其反义序列 所示的核苷酸序列，Tm值在65-70°C，通常比引物TM值高5-10°C (至少要5°C )，GC含量在 40% - 70%，探针的5'端应避免使用鸟嘌呤。
[0013] 本发明又一方面提供一种用于检测本申请的棉蚜病毒的试剂盒，其含有SEQ ID NO. 1或其反义序列所示核苷酸序列的15-45个，优选18-24个连续核苷酸构成的引物。优 选地，所述引物为由SEQ ID N0. 2或其反义序列所示的核苷酸序列构成的正向引物和由SEQ ID N0. 3或其反义序列所示的核苷酸序列构成的反向引物。
[0014] 在一些实施方案中，所述试剂盒还含有SEQ ID NO. 1或其反义序列所示核苷酸序 列的15-45个，优选20-30个连续核苷酸构成的探针。
[0015] 优选地，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID N0. 4或其反义序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1显示病毒检测试剂盒荧光定量PCR扩增情况，其中不同颜色代表不同反应孔 中样品的荧光变化，浓度1_5分别代表10、10 2、103、104和105倍稀释的样品。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本 发明。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本发明的精神 或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本发明来说不必要的细节，说明书可能 省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意 义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。
[0018] 下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。下述实施例 中的试验，均设置三次重复实验。
[0019] 实施例1棉蚜病毒全基因制备方法
[0020] 病毒RNA的提取
[0021] 2013年6月10日，将采集自中国农业科学院棉花研究所试验农场棉田的棉蚜加 入液氮进行组织研磨，然后以体积比1:50加入无菌水。于4°C，6000rpm离心30min，取上 清。将上清过0. 45 μ Μ滤膜，然后提取上清中的总RNA。RNA的提取采用Promega公司的 RNA gents Total RNA Isolation System kit 进行。
[0022] 反转录合成cDNA
[0023] 使用Promega公司反转录试剂盒（货号：A3500)，取5 μ g的总RNA反转录获 得 cDNA 的第一链，反应体系如下：总 RNA10 μ L (5 μ g)、Oligo (dT) (20 μ mol/L) 1. 5 μ L、 10父1311打6^.5 4]^、(11'〇1:>1111叉（2.51111]1。1凡）2 4]^、灭菌水8 4]^。）
[0024] 将上述反应体系的各成分的混合物在42°C水浴lmin后，向其中加入1 μ L(200U) Superscript? II RT，轻轻混合，42°C保温50min ;70°C水浴15min，终止该反应；获得cDNA 的第一链。
[0025] PCR 扩增
[0026] 使用Primer5. 0设计引物进行PCR扩增，引物序列如下：
[0027]
【权利要求】
1. 一种分离的DNA分子或其功能片段，其特征在于所述分离的DNA分子的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -种棉蚜病毒，其特征在于所述棉蚜病毒的基因组序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. -种产生权利要求2所述的棉蚜病毒的方法，其特征在于从棉蚜体内分离所述棉蚜 病毒。
4. 权利要求1所述的分离的DNA分子及其功能片段在用于防治棉蚜虫害中的用途。
5. -种引物，其用于检测权利要求2所述的棉蚜病毒，其特征在于所述引物含有SEQ ID NO. 1或其反义序列所示核苷酸序列的15-45个，优选18-24个连续核苷酸。
6. -种探针，其用于检测权利要求2所述的棉蚜病毒，其特征在于所述探针含有SEQ ID NO. 1或其反义序列所示核苷酸序列的15-45个，优选20-30个连续核苷酸。
7. -种用于检测权利要求2所述的棉蚜病毒的试剂盒，其特征在于含有权利要求5所 述的引物和权利要求6所述的探针。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述引物为由SEQ ID NO. 2或其反义序列 所示的核苷酸序列构成的正向引物和由SEQ ID NO. 3或其反义序列所示的核苷酸序列构成 的反向引物。
9. 如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4 或其反义序列。
【文档编号】A01P7/04GK104232660SQ201410489557
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】张帅, 崔金杰, 王春义, 雒珺瑜, 吕丽敏, 李春花 申请人:中国农业科学院棉花研究所