一种分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法
【专利摘要】本发明涉及一种分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法，包括：选择形态特征好、遗传多样性高的草鱼作为亲本，标记为G1，注射激素进行催熟，人工授精获得受精卵，进行1龄种鱼培育；同年12月优选G1中具有生长优势的个体进行抗性实验，存活的个体通过草鱼亲子鉴定的技术找出对应的亲本G1A，通过对G1A及其第二年子代g1A进行验证确定优良品系。使用本发明的草鱼优良品系选育及验证方法，周期短，且可根据不同的养殖环境需要选育出具有相应抗性的优良草鱼品系。
【专利说明】一种分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及草鱼优良品种选育及效果验证的方法，具体地说，是一种分子辅助选 育草鱼优良品系及选育效果验证的方法。 【【背景技术】】
[0002] 草鱼是我国四大家鱼之一，在我国已有近两千年的养殖历史。早期草鱼养殖用鱼 苗主要是从天然水体中捕捞，靠天吃饭一直限制草鱼养殖行业的发展；草鱼人工繁殖技术 突破后，我国出现了大规模草鱼养殖状况；目前，草鱼产量已多年保持在淡水养殖第一位。 但目前草鱼养殖行业仍面临较多困扰，最重要的问题是草鱼种质资源正在不断衰退。不注 重亲鱼的选育与更新、甚至进行逆向选育或近亲繁殖，是导致草鱼种质资源不断衰退的主 要原因。
[0003] 草鱼选育工作中最重要的环节是亲本的选择。在传统选育方法中，亲本的选择主 要依据其形态特征，但亲本之间的亲缘关系不容易确定，会导致选育结果的不稳定性；且草 鱼性成熟年龄较长，传统选育过程消耗大量的人力物力，选育结果也很难验证；尤为重要的 是，我国草鱼养殖环境复杂，不同时间、地域有其独特性，需要有不同的优良品系，而传统选 育方法自身特点很难满足这一要求。随着现代生物技术的发展，细胞、生化、分子等技术也 逐渐应用于草鱼选育工作，已出现了抗性强或生长快的转基因草鱼品系。但大众对转基因 的认同率普遍较低，转基因草鱼的发展受到一定限制。
[0004] 中国专利文献200910197874. X，公开了一种养殖草鱼家系的构建和良种选育方 法，该种方法能选育出优质、高产、稳产的草鱼新品种，但其需要分别对鱼种的夏花、1龄鱼、 2龄鱼、3龄鱼、4龄鱼五个阶段进行优选，耗时长，而且该种方法没有涉及对草鱼的抗病毒、 耐盐、耐低氧等优良品系的选育。因此，开发一种能针对不同地域环境，快速选育出具有生 长优势及不同抗性的草鱼选育的方法是十分必要的。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分子辅助选育草鱼优良品系及 选育效果验证的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0007] 一种分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)亲本的选择：选择体型匀称，活泼健康，体重高于平均体重15?20%，并达到 性成熟的草鱼作为待选亲本；使用pit标记对每条待选亲本进行编号，并剪取每条鱼的胸 鳍，用12对微卫星对剪下来的胸鳍进行STR分型，对分型结果用Cervus 3.0软件分析这 些待选亲本的遗传多样性；对遗传多样性较低的待选亲本进行舍去，有较高遗传多样性的 作为亲本，并标记为G tl;所述G ^为待选亲本中遗传多样性较高，用于后续选育实验的基本群 体；所述12对微卫星序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 24所示。
[0009] (2)建立家系：Gtl亲本性腺成熟后，一次人工注射激素进行催熟，人工授精获得受 精卵；每个家系的受精卵放入一个孵化桶，室温下进行孵化，孵化桶底部进入流水，水从桶 上面流出；不同家系受精卵的卵膜破裂4天后，每家系随机取500条混于相同大小池塘饲 养，池塘提前进行消毒，提前一周使用畜粪培育生物饵料，饲养过程中随时关注塘内生物饵 料的变化情况，及时补充肥料；至夏花阶段，同一家系鱼苗平均分配到两个或两个以上池塘 进行1龄种鱼培育，并标记为G 1;所述G为G ^第一年子代。
[0010] (3)优良品系的筛选：同年12月对G1的生长数据进行统计，并挑选个体较大、活泼 健康的G1进行抗性试验，取存活下来种鱼，并标记为G A ;取G1A的部分胸鳍，用无水乙醇保 存，草鱼亲子鉴定技术找出G1A相对应的亲本，并标记为G/，G 1中除去G A所剩下的群体标 记为G1B, Gtl中除去G /所剩下的群体标记为GtlB ;所述G1A为G1中具有生长优势且抗性试验 存活的群体；所述GtlA为G 1A对应的亲本。
[0011] ⑷优良品系的验证：第2年分别两个群体进行人工授精、建立家系、受 精卵孵化和1龄种鱼培育（方法同步骤2)，分别标记为 glA和glB ;同年12月份分别对glA 和glB两个群体的体长、体宽、体高和体重进行测量，比较glA群体的生长优势；glA和 glB各 随机取1000尾种鱼进行抗性试验（方法同步骤3)，比较glA群体的抗性优势；所述的 glA、 S1B分别为GtlA和GtlB两群体亲本第二年对应的子后。
[0012] (5)优良品系的确定：通过对待选亲本的筛选和验证，GtlA群体中同时满足下列两 个条件的即可作为兼具生长优势、抗性的优良品系：a.第一年子代与G 1B相比有生长优势 和抗性；b.第二年子代与glB相比兼具生长优势和抗性。
[0013] 所述的抗性试验为抗嗜水气单胞菌攻毒试验、抗盐试验、抗低氧试验、耐高温试 验。
[0014] 步骤（1)中所述的Gtl亲本的雌雄比例为1. 5?2. 0:1。
[0015] 步骤（2)中所述的人工受精是用干毛巾擦拭雄性草鱼的腹部和生殖孔，使用干净 的注射器吸取精液，并低温保存；用干毛巾擦拭雌性草鱼的腹部和生殖孔，轻压腹部，用干 燥的脸盆收集卵子；快速将需要建立的不同家系的精子、卵子混合，并用干燥的羽毛搅拌， 加入少量清水搅拌，即可获得不同家系的受精卵。
[0016] 步骤（2)中所述的激素为促黄体生成素释放激素类似物和地欧酮；所述激素的 注射量为雌鱼每kg体重注射促黄体生成素释放激素类似物3 μ g，当水温偏低或性腺发 育较差时，每千克体重加3mg地欧酮；雄鱼每kg体重注射促黄体生成素释放激素类似物 1. 5 μ g，当水温偏低或性腺发育较差时，每千克体重加 I. 5mg地欧酮。
[0017] 本发明优点在于：
[0018] 1、本发明的草鱼选育及验证方法周期短，只需通过第一年筛选和第二年的验证即 可确定优良品系，大大缩短了选育年限。
[0019] 2、本发明的草鱼选育及验证方法简单可靠，且可根据不同的养殖环境需要选育出 相应抗性的优良草鱼品系。
[0020] 3、本发明的草鱼选育及验证方法切实可行，不涉及转基因技术，社会认同度高。 【【具体实施方式】】
[0021] 下面对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0022] 实施例1具有生长优势及抗嗜水气单胞菌的草鱼优良品系的选育及效果验证
[0023] (1)收集600对珠江水系草鱼，从中选出体型匀称，活泼健康，体重高于平均体重 15?20%，并达到性成熟的雌雄草鱼250对作为待选亲本；使用PIT标记（上海逐海仪 器设备有限公司，HPT8)对每条待选亲本进行编号，并剪取每条鱼的胸鳍，使用12对微卫 星（表1)对剪下来的胸鳍进行STR分型，对分型结果用Cervus 3.0软件分析这些待选亲 本的遗传多样性（参见文献，任昆等，草鱼的微卫星亲权鉴定，南方农业学报，2013, 44(8): 1367-1371);选出100对有较高遗传多样性的作为亲本，并标记为Gp
[0024] 表1 12对用于草鱼亲子鉴定的多重PCR微卫星序列
[0025]
【权利要求】
1. 一种分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法，包括以下步骤： (1) 亲本的选择：选择体型匀称，活泼健康，体重高于平均体重15?20%，并达到性成 熟的草鱼作为待选亲本；使用PIT标记对每条待选亲本进行编号，并剪取每条鱼的胸鳍，用 12对微卫星对剪下来的胸鳍进行STR分型，对分型结果用Cervus 3. 0软件分析这些待选亲 本的遗传多样性；对遗传多样性较低的待选亲本进行舍去，有较高遗传多样性的作为亲本， 并标记为Gy所述G ^为待选亲本中遗传多样性较高，用于后续选育实验的基本群体；所述 12对微卫星序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 24所示； (2) 建立家系：G。亲本性腺成熟后，一次人工注射激素进行催熟，人工授精获得受精卵； 每个家系的受精卵放入一个孵化桶，室温下进行孵化，孵化桶底部进入流水，水从桶上面流 出；不同家系受精卵的卵膜破裂4天后，每家系随机取500条混于相同大小池塘饲养，池塘 提前进行消毒，提前一周使用畜粪培育生物饵料，饲养过程中随时关注塘内生物饵料的变 化情况，及时补充肥料；至夏花阶段，同一家系鱼苗平均分配到两个或两个以上池塘进行1 龄种鱼培育，并标记为G1;所述G :为G ^第一年子代； (3) 优良品系的筛选：同年12月对匕的生长数据进行统计，并挑选个体较大、活泼健康 的h进行抗性试验，取存活下来种鱼，并标记为G ;取G:A的部分胸鳍，用无水乙醇保存，草 鱼亲子鉴定技术找出G:A相对应的亲本，并标记为G/，匕中除去G A所剩下的群体标记为 GiB，^中除去G /所剩下的群体标记为GJ ;所述G:A为匕中具有生长优势且抗性试验存活 的群体； (4) 优良品系的验证：第2年分别对G/、G#两个群体进行人工授精、建立家系、受精 卵孵化和1龄种鱼培育（方法同步骤2)，分别标记为glA和glB ;同年12月份分别对glA和 两个群体的体长、体宽、体高和体重进行测量，比较gA群体的生长优势；glA和glB各随 机取1000尾种鱼进行抗性试验（方法同步骤3)，比较glA群体的抗性优势；所述的glA、 glB 分别为G/和G#两群体亲本第二年对应的子后； (5) 优良品系的确定：通过对待选亲本的筛选和验证，G/群体中同时满足下列两个条 件的即可作为兼具生长优势、抗性的优良品系：a.第一年子代与G#相比有生长优势和抗 性；b.第二年子代与glB相比兼具生长优势和抗性。
2. 根据权利要求1所述的分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法，其特征 在于，所述的抗性试验为抗嗜水气单胞菌攻毒试验、抗盐试验、抗低氧试验、耐高温试验。
3. 根据权利要求1所述的分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法，其特征 在于，步骤（1)中所述的心亲本的雌雄比例为1.5?2.0:1。
4. 根据权利要求1所述的分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法，其特征 在于，步骤（2)中所述的人工受精是用干毛巾擦拭雄性草鱼的腹部和生殖孔，使用干净的 注射器吸取精液，并低温保存；用干毛巾擦拭雌性草鱼的腹部和生殖孔，轻压腹部，用干燥 的脸盆收集卵子；快速将需要建立的不同家系的精子、卵子混合，并用干燥的羽毛搅拌，加 入少量清水搅拌，即可获得不同家系的受精卵。
5. 根据权利要求1所述的分子辅助选育草鱼优良品系及选育效果验证的方法，其特征 在于，步骤（2)中所述的激素为促黄体生成素释放激素类似物和地欧酮；所述激素的注射 量为雌鱼每kg体重注射促黄体生成素释放激素类似物3 y g，当水温偏低或性腺发育较差 时，每千克体重加3mg地欧酮；雄鱼每kg体重注射促黄体生成素释放激素类似物1. 5 y g， 当水温偏低或性腺发育较差时，每千克体重加1. 5mg地欧酮。
【文档编号】A01K61/00GK104488759SQ201410667437
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】李家乐, 张猛, 沈玉帮, 傅建军, 孙俊龙, 徐晓雁, 党云飞 申请人:上海海洋大学