技术领域：
本发明涉及A环三羟基取代五环三萜化合物在制药中的应用，特别是在制备抗菌或抗烟草花叶病毒药物中的应用，属于化合物的药物用途
技术领域：
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背景技术：
：五环三萜化合物广泛分布于自然界中，它们具有多种生物学活性，包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降压、降血糖等(DzubakPetr,HajduchMarian,VydraDavid.etal.Pharmacologicalactivitiesofnaturaltriterpenoidsandtheirtherapeuticimplications.Nat.Prod.Rep.,2006,23,394–411.)。近年来，由于五环三萜化合物抗菌谱广，对某些细菌或真菌抑制作用较强(WolskaKI.,GrudniakAM,FiecekB,Kraczkiewicz-DowjatA,KurekA.Antibacterialactivityofoleanolicandursolicacidsandtheirderivatives.CentralEuropeanJournalofBiology,2010,5(5):543-553；ShaiLJ,McGawLJ,AderogbaMA,MdeeLK,EloffJN.FourpentacyclictriterpenoidswithantifungalandantibacterialactivityfromCurtisiadentata(Burm.f)C.A.Sm.Leaves.JournalofEthnopharmacology2008,119:238-244.)，尤其是能够抑制耐药菌的生长(FontanayS,GrareM,MayerJ,FinanceC,DuvalRE.Ursolic,oleanolicandbetulinicacids:Antibacterialspectraandselectivityindexes.JournalofEthnopharmacology,2008,120:272-276)，其抗菌活性备受关注。A环三羟基取代五环三萜化合物在自然界中分布较少，但是研究者们发现该类化合物一般具有较好的抗炎(BannoN,AkihisaT,TokudaH,etal.Anti-inflammatoryandantitumor-promotingeffectsofthetriterpeneacidsfromtheleavesoferiobotryajaponica.Biol.Pharm.Bull.,2005,28(10):1995-1999.)、抗艾滋病病毒(KashiwadaY,WangH,NagaoT,etal.Anti-AIDSAgents.30.Anti-HIVactivityofoleanolicacid,pomolicacid,andstructurallyrelatedtriterpenoids.J.Nat.Prod.1998,61:1090-1095.)和抗菌活性(AhmadM,AhmadW,KhanS,ZeeshanM,NisarM,ShaheenF,AhmadM.NewantibacterialpentacyclictriterpenesfromMyricariaelegansRoyle.(tamariscineae).Journalofenzymeinhibitionandmedicinalchemistry,2008,23(6):1023-1027.)。而该类化合物在抗植物致病菌和抗烟草花叶病毒方面的研究未曾见报道。本发明人在CN102070699A(三羟基取代五环三萜类化合物及其制备方法和应用)的基础上，对A环三羟基取代五环三萜化合物的生物学活性进行了更深入的研究，发现该类化合物不仅仅具有抗肿瘤活性、肝损伤保护活性。技术实现要素：本发明的目的在于：提供A环三羟基取代五环三萜化合物在制备抗菌或抗烟草花叶病毒药物中的应用。本发明人经过一系列的活性研究及筛选试验，发现A环三羟基取代五环三萜化合物具有较强的抗菌和抗烟草花叶病毒活性，尤其是在抑制革兰氏阳性细菌、烟草黑胫病菌、烟草花叶病毒方面表现出极强的活性，在医药和农药领域具有良好的应用前景。本发明的技术方案：A环三羟基取代五环三萜化合物在制备抗菌或抗烟草花叶病毒药物中的应用；所述化合物为A环三羟基取代熊果酸、A环三羟基取代齐墩果酸以及二者的醛、醇、酯、酰胺类衍生物，其通式为下述结构式Ⅰ：其中：C1、C2、C3的羟基各为α构型或β构型；R1、R2选自氢或甲基，且R1与R2不同；R3选自—COOH、—CH2OH、—CHO、—COOR1、—CONH2、—CONHR1、—CONR1R2中任一种；R1、R2选自含有1-15个碳原子的烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的苯烷基中的一种，R1与R2可相同或不同；所述取代苯基、取代苯烷基中的取代基选自卤素、羟基、氰基、氨基、硝基、巯基或含1-15个碳的苯基、酰基、芳基、烷氧基、烷基。前述应用中，所述的抗菌药物为抗细菌或抗真菌的药物。前述应用中，所述的抗细菌药物为防治由革兰氏阳性细菌所致的农作物病害的农用药物或者治疗由革兰氏阳性细菌引起的感染性疾病的医用药物；所述的抗真菌药物为防治由烟草黑胫病菌所致的农作物病害的农用药物。前述应用中，所述的抗烟草花叶病毒药物为防治烟草花叶病毒所致的烟草病害的农用药物。前述应用中，制备抗细菌药物时，式Ⅰ化合物优选为：C1、C2、C3的羟基分别为α、β、α，α、β、β或α、α、α构型；R3选自—COOH、—COOR1、—CONHR1中任一种，R1选自含有1-4个碳原子的烷基；更优选的式Ⅰ化合物为：C1、C2、C3的羟基分别为α、β、α构型；R3为—COOR1，R1选自含有1-4个碳原子的直链烷基或异丙基。前述应用中，制备抗真菌药物时，式Ⅰ化合物优选为：C1、C2、C3的羟基分别为α、β、α构型；R3选自—COOH或—COOR1，R1选自含有1-5个碳原子的直链烷基或支链烷基。前述应用中，制备抗烟草花叶病毒药物时，式Ⅰ化合物优选为：C1、C2、C3的羟基分别为α、α、β，β、α、α，β、β、α或β、β、β构型；R3选自—CONHR1、—COOR1中任一种，R1选自含有1-5个碳原子的烷基、取代或未取代的苯烷基中的一种，所述取代苯烷基中的取代基选自卤素或硝基。前述应用中，所述的农用药物还含有常用的农药助剂；所述的医用药物还含有常用的药用载体或赋形剂。农用药物可以是粉剂、悬浮剂、烟雾剂、粒剂或乳剂；医用药物可以是固体口服制剂(如片剂、胶囊剂、滴丸剂等)、液体口服制剂或注射剂。以上所述式Ⅰ化合物中代表性的化合物有：Ⅰa.lα,2α,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-羧酸；Ⅰb.lα,2β,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-羧酸；Ⅰc.lβ,2α,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-羧酸；Ⅰd.lβ,2β,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-羧酸；Ⅰe.1β,2β-二羟基-熊果酸；Ⅰf.lα,2β-二羟基-熊果酸；Ⅰg.lβ,2α-二羟基-熊果酸；Ⅰh.1α,2α-二羟基-熊果酸；Ⅰi.lα,2α,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-羧酸；Ⅰj.lα,2β,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-羧酸；Ⅰk.lβ,2β,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-羧酸；Ⅰl.lβ,2α,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-羧酸；Ⅰm.lβ,2β-二羟基-齐墩果酸；Ⅰn.lα,2β-二羟基-齐墩果酸；Ⅰo.lβ,2α-二羟基-齐墩果酸；Ⅰp.1α,2α-二羟基-齐墩果酸；Ⅰ1.lα,2β,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-羧酸苄酯；Ⅰ2.lβ,2α,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-羧酸乙酯；Ⅰ3.1α,2α,3α-三羟基-熊果酸甲酯；Ⅰ4.N-甲基-1β,2β-二羟基-熊果酰胺；Ⅰ5.1α,2α-二羟基-熊果酸丁酯；Ⅰ6.lβ,2β-二羟基-齐墩果酸苄酯；Ⅰ7.N,N-二甲基-lβ,2α-二羟基-齐墩果酰胺；Ⅰ8.1α,2α-二羟基-齐墩果醇；Ⅰ9.lα,2β-二羟基-熊果醇；Ⅰ10.lβ,2α-二羟基-熊果醛；Ⅰ11.lβ,2β,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-醛；Ⅰ12.lα,2β,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-羧酸对氯苯甲酯；Ⅰ13.lα,2α,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-乙酰胺；Ⅰ14.N-正戊基-lα,2β,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-酰胺；Ⅰ15.lβ,2α,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-甲酸己酯；Ⅰ16.lβ,2β,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-甲酸十五烷基酯；Ⅰ17.N-甲基-lβ,2β,3α-三羟基-熊果烷-12-烯-28-酰胺；Ⅰ18.1β,2β-二羟基-熊果酸戊酯；Ⅰ19.N-甲基-lα,2β-二羟基-熊果酸酰胺；Ⅰ20.lβ,2α-二羟基-熊果酸己酯；Ⅰ21.N-乙基-1α,2α-二羟基-熊果酸酰胺；Ⅰ22.N-甲基-lα,2α,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胺；Ⅰ23.lα,2β,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-羧酸异丙酯；Ⅰ24.N,N-二甲基-lα,2β,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胺；Ⅰ25.lβ,2β,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-羧酸丙酯；Ⅰ26.N-苄基-lβ,2β,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胺；Ⅰ27.N-甲基-lβ,2α,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胺；Ⅰ28.N-甲基-lβ,2α,3α-三羟基-齐墩果烷-12-烯-28-羧酸甲酯；Ⅰ29.lβ,2β-二羟基-齐墩果酰胺；Ⅰ30.N-辛基-1α,2β-二羟基-齐墩果酰胺；Ⅰ31.N-辛基-1α,2β-二羟基-齐墩果m-氰基苄酯；Ⅰ32.lβ,2α-二羟基-齐墩果酸甲酯；Ⅰ33.1α,2α-二羟基-齐墩果酸3,5-二氯苄酯；Ⅰ34.N-乙基-lα,2α-二羟基-齐墩果酰。其结构式分别如下：上述式Ⅰ化合物的合成以熊果酸(UA)或齐墩果酸(OA)为原料，参照CN102070699A所公开的方法制备。以下是本发明人对式Ⅰ化合物的生物活性进行筛选及测试的结果：1、A环三羟基取代五环三萜化合物的抗细菌活性筛选实验受试化合物：熊果酸(UA)、齐墩果酸(OA)、代表性化合物Ⅰa～Ⅰp、Ⅰ1～Ⅰ34以及化合物Ⅰb和Ⅰj的酯类化合物，其结构如下：实验菌株：革兰氏阳性细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、疮痂病链霉菌(Streptomycesscabiei)；革兰氏阴性细菌：大肠杆菌(Escherichiacoli)、烟草青枯菌(Ralstoniasolanacearum)。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和烟草青枯菌(Ralstoniasolanacearum)均由贵州大学生命科学学院微生物实验室提供；疮痂病链霉菌(Streptomycesscabiei)购买于北京北纳创联生物技术研究院。主要仪器与试剂：自动三重纯水蒸馏器(SZ-97,上海亚荣生化仪器厂)；超净工作台(SW-CJ-1F，苏州净化设备有限公司)；磁力加热搅拌器(C-MAGHS4，德国IKA公司)；恒温振荡培养箱(HZQ-F160，江苏太仓市实验设备厂)；电子天平(SL-114,美国DENVER公司)；各型号微量移液器(德国eppendorf公司)；96孔培养板为美国CorningCostar公司产品；Model550酶标仪为美国BIO-RAD公司产品；蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖均购自英国Oxoid公司；二甲基亚砜、氨苄青霉素、硫酸链霉素均为sigma公司产品。细菌培养基的配制：(1)牛肉膏蛋白胨培养基的配制：称取牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，加入50mL蒸馏水，加热并不断搅拌使其完全熔化，溶化后调节溶液pH值至7.2，最后补足蒸馏水至1000mL，分装，加塞高压灭菌。(2)马铃薯培养基(PDA培养基)的配制：取去皮并洗净的马铃薯200g，切成小块，放入1000mL蒸馏水中煮沸30min后用4层纱布过滤得到滤液，向滤液中加入葡萄糖20g，搅拌溶解，补足缺失的水至1000mL，分装，加塞高压灭菌。以上方法配制的培养基均为液体培养基，加入15％-20％的琼脂即得相应的固体培养基。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和烟草青枯菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养，最适温度37℃；疮痂病链霉菌用马铃薯培养基培养，最适温度28℃。方法：菌悬液的制备：取上述6种供试细菌的备用菌株，用接种环各取菌苔少许接种至相应的固体培养基斜面上，在最适温度下活化。然后将活化后的菌株接一环于7mL液体培养基中，在恒温振荡器中培养至培养基浑浊，即制成菌悬液。首先采用96微孔浊度法对化合物的抗菌活性进行初步筛选。设受试化合物组(100μM)、阳性药对照组(硫酸链霉素和氨苄青霉素浓度均为100μM)和空白对照组(菌液中只加入溶媒)。化合物均以DMSO助溶，DMSO浓度不超过1％。将菌悬液浓度调整至106CFU/ml，以135μL/孔加入96孔板中，然后每孔加入受试化合物和阳性药溶液15μL，使各化合物终浓度为100μM，空白对照组则以相同体积的培养基代替，每种化合物设3个复孔，加毕，用酶标仪于600nm测定每孔的吸光度值A1，然后将此96孔板以物体支撑水平固定于恒温振荡器中，以200rpm转速，最适温度下培养。当细菌生长达到对数生长期时，停止培养，无菌操作下将每孔菌液吹打均匀，用酶标仪于600nm再次测定吸光度值A2，计算前后两次吸光度值之差ΔA，根据下列公式求出抑制率：抑制率＝(空白组ΔA－药物组ΔA)*100％/空白组ΔA每组实验重复三次，计算平均抑制率。结果：受试化合物对5种细菌的抑制活性结果见表1—表5。由表可知受试化合物在100μM浓度下对大肠杆菌和烟草青枯菌有微弱的抑制活性，而大部分化合物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和疮痂病链霉菌有显著的抑制活性，部分化合物的抑制活性和阳性对照药物相近，如化合物Ⅰb、Ⅰ3、U1、U2、U3、U4、A1、A2和A3对枯草芽孢杆菌的抑制活性均超过95％；Ⅰa、Ⅰj、Ⅰ3、Ⅰ15、Ⅰ17、Ⅰ18、Ⅰ23、U1、U2、U3、U4、U5、A2、A3和A4对金黄色葡萄球菌的抑制作用与阳性对照药物没有显著性差异；Ⅰ3、Ⅰ10、Ⅰk、Ⅰ16、Ⅰ17、Ⅰ19、Ⅰ22、Ⅰ27、U1、A1对疮痂病链霉菌有很强的抑制作用。以上结果表明式Ⅰ化合物对革兰氏阴性细菌没有或者具有微弱的抑制活性，而对革兰氏阳性细菌具有较强的抑制活性。表1A环三羟基取代五环三萜化合物对大肠杆菌的抑制作用(浓度：100μM)与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。表2A环三羟基取代五环三萜化合物对枯草芽孢杆菌的抑制作用(100μM)与阳性对照药比较，*P<0.05；**P<0.01。表3A环三羟基取代五环三萜化合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用(100μM)与阳性对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。表4A环三羟基取代五环三萜化合物对烟草青枯菌的抑制作用(100μM)与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。表5A环三羟基取代五环三萜化合物对疮痂病链霉菌的抑制作用(100μM)与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。根据初步活性筛选结果，对抑制活性超过95％的化合物进行最小抑菌浓度(MIC)测定，测定结果见表6—表8。表6受试化合物对枯草芽孢杆菌的MIC值化合物MIC(μM)Ⅰb64Ⅰ340U132U264-100U332U41A164-100A264-100A364-100硫酸链霉素2表7受试化合物对金黄色葡萄球菌的MIC值表8受试化合物对疮痂病链霉菌的MIC值化合物MIC(μM)Ⅰ364Ⅰ1064-100Ⅰk64-100Ⅰ1664Ⅰ174Ⅰ1940Ⅰ228Ⅰ274U164A12硫酸链霉素4MIC测试结果表明化合物Ⅰb、A1、A2、A3、U1、U2和U3对枯草芽孢杆菌表现中等抑制活性；化合物U4的抑制活性是硫酸链霉素的2倍。受试化合物对金黄色葡萄球菌的抑制活性较强，其中化合物U2、U4、A2和A3的抑制活性是阳性对照药氨苄青霉素的2-4倍，化合物Ⅰ17的抑菌活性与氨苄青霉素相当。化合物Ⅰ17和Ⅰ27对疮痂病链霉菌的抑制活性与硫酸链霉素相当，而化合物A1的抑制活性则是硫酸链霉素的2倍。以上结果表明本发明所述式Ⅰ化合物能显著抑制革兰氏阳性细菌的生长，有望开发成抗菌药物应用于农业和医药领域。2、A环三羟基取代五环三萜化合物的抗真菌活性筛选实验受试化合物：熊果酸(UA)、齐墩果酸(OA)、代表性化合物Ⅰa～Ⅰp、Ⅰ1～Ⅰ34以及化合物Ⅰb和Ⅰj的酯类化合物。实验菌株：小麦赤霉病菌(Gibberellazeae)，辣椒枯萎病菌(Fusariumoxyspoyum)，烟草黑胫病菌(Phytophthoranicotiana)均由贵州大学真菌资源研究室提供。主要仪器与试剂：荧光倒置相差显微镜为日本尼康公司产品(型号：Ti-U)；自动三重纯水蒸馏器(SZ-97,上海亚荣生化仪器厂)；超净工作台(SW-CJ-1F，苏州净化设备有限公司)；磁力加热搅拌器(C-MAGHS4，德国IKA公司)；恒温振荡培养箱(HZQ-F160，江苏太仓市实验设备厂)；电子天平(SL-114,美国DENVER公司)；各型号微量移液器(德国eppendorf公司)；96孔培养板为美国CorningCostar公司产品；Model550酶标仪为美国BIO-RAD公司产品；二甲基亚砜、葡萄糖、百菌清、多菌灵均为sigma公司产品。培养基的配制：取去皮并洗净的马铃薯200g，切成小块，放入1000mL蒸馏水中煮沸30min后用4层纱布过滤得到滤液，向滤液中加入葡萄糖20g，搅拌溶解，补足缺失的水至1000mL，分装，加塞高压灭菌即得马铃薯液体培养基(PDA培养基)，加入15％-20％的琼脂即得相应的固体培养基。方法：孢子悬液的制备：无菌操作下，将菌种活化后接种于斜面PDA固体培养基，于28℃恒温培养箱中培养，待菌丝长满培养基后将斜面置于强光照射下培养2d以促进其产生孢子。镜检观察其生长至成熟产生丰富的孢子后，向试管中加入5mL无菌生理盐水，无菌条件下用接种环轻轻刮下斜面上的孢子，将含有孢子的无菌生理盐水吸入无菌三角瓶中，再向试管中加入无菌生理盐水并刮取孢子，如此操作重复几次，然后将含有孢子的生理盐水合并到三角瓶中，向其中加入5粒直径为3mm的无菌玻璃珠，将三角瓶加塞，置于恒温振荡器中以200rpm振摇1h，最后用无菌纱布过滤以除去菌丝体即得孢子悬液。采用96微孔浊度法对化合物的抗真菌活性进行测定。设受试化合物组(100μM)、阳性药对照组(百菌清和多菌灵浓度均为100μM)和空白对照组。化合物以DMSO助溶于PDA培养基中配置成溶液，DMSO浓度不超过1％。首先用PDA液体培养基制备孢子悬液使孢子浓度为2×106个/mL，向96孔板中加入孢子悬液，每孔135μL，然后每孔加药物溶液15μL，使药物终浓度为100μM，空白对照组则以相同体积的溶媒代替，每种化合物设3个复孔，加毕，用酶标仪于620nm测定每孔的吸光度值A1，然后将此96孔板置于恒温培养箱中28℃培养。通过显微镜观察孢子萌发情况，待空白对照组孢子萌发后，立即再次测定每孔620nm的吸光度值A2，计算前后两次吸光度值之差ΔA，根据下列公式求出抑制率：抑制率＝(空白组ΔA－药物组ΔA)*100％/空白组ΔA每组实验重复三次，计算平均抑制率。结果：受试化合物对3种真菌的抑制活性结果见表9—表11。表9A环三羟基取代五环三萜化合物对烟草黑胫病菌的抑制作用(100μM)与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。表10A环三羟基取代五环三萜化合物对辣椒枯萎病菌的抑制作用(100μM)与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。表11A环三羟基取代五环三萜化合物对小麦赤霉病菌的抑制作用(100μM)与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。测试结果表明受试化合物对三种真菌表现出不同程度的抑制活性，其中对烟草黑胫病菌的抑制作用较强，化合物Ⅰ23、Ⅰ20、Ⅰp抑制作用较显著。3、A环三羟基取代五环三萜化合物的抗烟草花叶病毒活性筛选实验受试化合物：熊果酸(UA)、齐墩果酸(OA)以及代表性化合物Ⅰa～Ⅰp、Ⅰ1～Ⅰ34。烟草花叶病毒(TMV)由贵州省烟草科学研究所提供，供试烟草心叶烟(Nicotinanglutinosa)为本实验室温室栽种，苗龄8周。主要仪器与试剂：阳性对照药物为2％宁南霉素，黑龙江强尔生化有限公司；智能光照培养箱GXZ-280C，浙江宁波江南仪器厂；各型号微量移液器(德国eppendorf公司)；吐温20，天津市化学试剂三厂；二甲基亚砜(sigma)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠购买于天津市致远化学试剂有限公司；软毛笔、硬排笔，金刚沙(320目)和刷药板为市售。运用半叶枯斑法分别测试受试化合物体外对TMV的钝化作用、体内对TMV侵染烟草的预防作用和治疗作用。(1)受试化合物体外对TMV的钝化作用实验方法：将浓度500μg/mL的受试化合物与病毒(浓度6μg/mL)共培养30min。选生长一致的心叶烟的中部展开叶作为处理叶片(每株选用叶位相近的3-5片叶，每次选用3株)，利用人工摩擦法对所有处理叶片右半叶接种含有受试化合物的TMV，同时左半叶接种不含受试化合物的TMV作为空白对照。随后在光照培养箱中培养，培养条件为：白天08:00-22:00，温度为25℃，光照10000Lux；黑夜22:00-次日08:00，温度为22℃，无光照。培养3-4d后观察并记录枯斑的数目C，计算枯斑抑制率。枯斑抑制率＝(C空白组－C药物组)×100％/C空白组(2)受试化合物体内对TMV侵染烟草的预防作用实验方法：选生长一致的心叶烟的中部展开叶作为处理叶片(每株选用叶位相近的3-5片叶，每次选用3株)，接种病毒前24h进行右半叶喷涂化合物溶液处理，左半叶则以0.5％羧甲基纤维素钠溶液代替，受试化合物事先均以DMSO助溶于0.5％的羧甲基纤维素钠溶液中，浓度500μg/mL。涂药24h后利用人工摩擦法对所有处理叶片整叶接种TMV(6μg/mL)，随后在光照培养箱中培养，培养条件为：白天08:00-22:00，温度为25℃，光照10000Lux；黑夜22:00-次日08:00，温度为22℃，无光照。培养3-4d后观察并记录枯斑的数目，计算枯斑抑制率。(3)受试化合物体内对TMV侵染烟草的治疗作用实验方法：选生长一致的心叶烟的中部展开叶作为处理叶片(每株选用叶位相近的3-5片叶，每次选用3株)，利用人工摩擦法对所有处理叶片整叶接种适宜浓度的TMV(6μg/mL)，接种病毒后12h进行右半叶喷涂化合物溶液处理，左半叶则以0.5％羧甲基纤维素钠溶液代替，受试化合物事先均以DMSO助溶于0.5％的羧甲基纤维素钠溶液中，浓度500μg/mL。涂药后将烟草置于光照培养箱中培养，培养条件为：白天08:00-22:00，温度为25℃，光照10000Lux；黑夜22:00-次日08:00，温度为22℃，无光照。培养3-4d后观察并记录枯斑的数目，计算枯斑抑制率。结果：测试结果见表12，结果表明受试化合物中大部分化合物对TMV侵染烟草具有预防作用、治疗作用和体外钝化作用。化合物Ⅰc、Ⅰe、Ⅰl、Ⅰ4、Ⅰ18、Ⅰ22、Ⅰ25、Ⅰ26、Ⅰ29、Ⅰ33、Ⅰ34对TMV侵染烟草的治疗作用明显优于阳性对照药物宁南霉素(P<0.05)，而化合物Ⅰc、Ⅰe、Ⅰf、Ⅰ30对TMV侵染烟草的预防作用明显优于宁南霉素(P<0.05)，化合物Ⅰb、Ⅰp、Ⅰ2、Ⅰ5、Ⅰ9、Ⅰ13、Ⅰ14、Ⅰ18、Ⅰ19、Ⅰ22、Ⅰ26对TMV的钝化作用明显优于宁南霉素(P<0.05)，这些化合物有望开发成为抗TMV药物应用于农业。表12A环三羟基取代五环三萜化合物对烟草花叶病毒的抑制作用(500μgmL-1)与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。与现有技术相比，本发明经过一系列的活性研究及筛选试验，发现A环三羟基取代五环三萜化合物对革兰氏阳性细菌(如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、疮痂病链霉菌)、革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌、烟草青枯菌)、植物致病真菌(如小麦赤霉病菌、烟草黑胫病菌、辣椒枯萎病菌)以及烟草花叶病毒均有抑制活性，尤其是对革兰氏阳性细菌、烟草黑胫病菌、烟草花叶病毒的抑制活性较强，不仅对感染烟草花叶病毒的烟叶具有较强的治疗作用，且能较强地抑制烟草花叶病毒对烟草的侵染；所述化合物既可作为医药抗菌剂，也可作为农药杀菌剂，在医药和农药领域具有良好的应用前景。具体实施方式本发明所述的式Ⅰ化合物在医药上的应用为将具有通式Ⅰ的任意一种化合物加药用载体、赋形剂等药剂学相应的辅料制成各种剂型，应用于抗菌剂等方面。通过制剂方法可加工成固体口服制剂(如片剂、胶囊剂、滴丸剂等)、液体口服制剂或注射剂，在治疗由革兰氏阳性细菌引起的感染性疾病方面具有良好的效果。本发明的实施例1：取化合物Ⅰ17、U2、U4、A2、A3中的任一种，按药剂学方法加入适量淀粉和微晶纤维素充分混匀，将羟甲基纤维素溶液与上述的粉末混匀，过80目筛制得湿颗粒于50-60℃干燥，将羧甲基淀粉盐、硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片即得片剂。该制剂口服，一日2次，每次服药量以原料药计为5-30毫克。用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病如化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等。实施例2：取化合物Ⅰ3、Ⅰ15、Ⅰ18、Ⅰ23、U1、U3、U5、A4中的任一种，按药剂学方法加入适量柠檬酸钠、聚乙二醇、蒸馏水混匀并充分溶解，调节溶液pH值为7.5-8.5后过滤，原料药浓度为1mg/ml，按每安瓿2ml分装，灭菌即得注射剂。该制剂注射用，一日2次，每次注射量以原料药计为5-30毫克。用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病。实施例3：取化合物Ⅰa、Ⅰc、Ⅰj、Ⅰo、Ⅰp、Ⅰ13、A1、A5、A7中的任一种，粉碎过80目筛，按药剂学方法加入适量含10％蜂蜡的植物油，混合均匀；以明胶∶甘油∶蒸馏水∶防腐剂＝1∶0.4∶0.8∶0.003制备囊材，加入前述化合物和植物油的混合物，压制即得软胶囊剂。该制剂口服，一日2次，每次服药量以原料药计为5-30毫克。用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病。实施例4：取具有通式Ⅰ的任意一种化合物，粉碎过80目筛，按药剂学方法加入适量聚乙二醇，混匀，在保温条件下于植物油中滴制成丸，即得滴丸剂。该制剂口服，一日2次，每次服药量以原料药计为5-30毫克。用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病。本发明所述的式Ⅰ化合物在农药上的应用为将具有通式Ⅰ的任意一种化合物加表面活性剂、缓冲试剂等药剂学相应的辅料制成各种剂型，应用于杀菌剂和抗病毒剂等方面。通过制剂方法可加工成可湿性粉剂、乳油、悬浮剂、水分散粒剂和水乳剂等剂型，在杀菌剂和抗病毒剂方面的应用具有良好的效果。所述的农药制剂以具有通式Ⅰ的任意一种化合物为主要有效成分，所加入的表面活性剂可以加速有效成分在叶和茎的表面或穿透其表面扩散。阳离子表面活性剂如甜菜碱、酰胺基甜菜碱、吡咯酮；阴离子表面活性剂，如硫酸月桂酯钠；非离子表面活性剂，如烷基醇酰胺(FFA)、脂肪醇聚氧乙烯醚(AE)、烷基酚聚氧乙烯醚(APE或OP)、脂肪酸、游离脂肪酸、吐温-80、羧甲基纤维素、乙二醇、烷基聚氧乙烯醚、乙氧基化豆油、蓖麻氢化油、植物油、硅油、甲基籽油；促渗剂，如吡咯、N-烷基吡咯酮、甲基化吡咯酮、聚乙烯吡咯烷酮等。这些表面活性剂，可单独使用或混合使用。实施例5：按重量百分比称取：(1)化合物Ⅰ17、Ⅰ22、Ⅰ27、A1中的任一种1.00％，⑵蓖麻氢化油4.00％，(3)聚乙二醇辛基苯基醚1.00％，(4)辛基吡咯酮1.00％，(5)乙醇2.00％，(6)水91.00％；混合制成水乳剂。施用时将制剂稀释1:50-100，用于防治马铃薯疮痂病。实施例6：按重量百分比称取：(1)化合物Ⅰk、Ⅰ3、Ⅰ10、Ⅰ16、Ⅰ19、U1中的任一种10.00％，⑵聚乙二醇1.00％，(3)磷酸二氢钠2.00％，(4)十二烷基磺酸钠10.00％，(5)白炭黑5.00％，(6)淀粉7.00％，(7)硅藻土65.00％；混合制成水分散粒剂。施用时将制剂稀释1:50-100，用于防治马铃薯疮痂病。实施例7：按重量百分比称取：(1)具有通式Ⅰ的任意一种化合物1.0％，(2)聚乙二醇辛基苯基醚2.5％，(3)茶皂素10.0％，(4)白糖2.0％，(5)硅藻土84.5％；混合制成可湿性粉剂。施用时将制剂稀释1:100；用于防治马铃薯疮痂病。实施例8：按重量百分比称取：(1)化合物Ⅰc、Ⅰe、Ⅰl、Ⅰ4、Ⅰ18、Ⅰ22、Ⅰ25、Ⅰ26、Ⅰ29、Ⅰ33、Ⅰ34、Ⅰb、Ⅰp、Ⅰ2、Ⅰ5、Ⅰ9、Ⅰ13、Ⅰ14、Ⅰ19中的任一种18.0％，(2)甲基萘磺酸钠甲醛2.5％，(3)膨润土1.0％，(4)农乳OX-6565.0％，(5)丙三醇4.0％，(6)磷酸三丁酯0.2％；水补足至100％，混合制成乳悬剂。施用时将制剂稀释1:100；用于烟草花叶病的治疗。实施例9：按重量百分比称取：(1)化合物Ⅰc、Ⅰe、Ⅰf、Ⅰ30中的任一种42％，(2)十二烷基苯磺酸钠1.8％，(3)对叔丁基醚2.0％，(4)白碳黑10.0％，(5)木质素磺酸钠10.0％，轻质碳酸钙补足至100％，混合制成可湿性粉剂。施用时将制剂稀释1:50-100；用于预防并治疗烟草花叶病。实施例10：按重量百分比称取：(1)具有通式Ⅰ的任意一种化合物40.0％，(2)N-甲基-油酰基-牛磺酸钠2.0％，(3)萘酚磺酸甲醛缩合物2.0％，(4)可溶性淀粉3.0％，(5)硫酸钠2.0％，高岭土补足至100％，混合制成水分散性粒剂。施用时将制剂稀释1:50-100；用于防治烟草花叶病。实施例11：按重量百分比称取：(1)化合物Ⅰ23、Ⅰ20、Ⅰp中的任意一种20.0％，(2)有机硅消泡剂0.2％，(3)十二烷基苯磺酸钙8.0％，(4)HYJ黄原胶0.1％，(5)乙二醇5.0％，水补足至100％，充分混合制成悬浮剂。施用时将制剂稀释1:50-100；用于防治烟草黑胫病。实施例12：按重量百分比称取：(1)化合物Ⅰb、Ⅰ3、Ⅰ7、Ⅰ11、Ⅰ14、Ⅰ21、Ⅰ34、A4中的任意一种45.0％，(2)木质素磺酸钠1.0％，(3)十二烷基磺酸钠1.0％，(4)亚甲基二萘磺酸钠0.5％，(5)白碳黑3.0％，(6)硅藻土补足至100％，充分混合，粉碎至有效成分粒径小于45μm制成可湿性粉剂。施用时将制剂稀释1:50-100；用于防治烟草黑胫病。实施例13：按重量百分比称取：(1)具有通式Ⅰ的任意一种化合物60.0％，(2)木质素磺酸钠4.0％，(3)十二烷基磺酸钠1.0％，(4)聚乙烯醇1.0％，(5)白碳黑3.0％，(6)硅藻土补足至100％，充分混合，粉碎得到800-1000目的细粉，所得细粉与黏合剂的水溶液混匀，制粒，干燥制成水分散粒剂。施用时将制剂稀释1:50-100；用于防治烟草黑胫病。当前第1页1 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