蜡样芽胞杆菌防治棉花病害及其促生长的应用的制作方法

本发明属于农业应用技术领域，涉及一种细菌在生防领域中的应用，具体涉及蜡样芽胞杆菌在防治棉花黄萎病和立枯丝核病的应用，同时该菌株还具有促进棉花植株生长的作用。

背景技术：

棉花黄萎病是危害棉花生产的主要病害之一，被称为“棉花癌症”，也是棉花生长发育过程中发生最严重、损失严重的重要病害之一。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(v.dahliae)引起的一种真菌性病害，大丽轮枝菌可通过土壤和流水作远距离传播，病害传播速度极快，大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是几乎所有棉花生产国棉花生产的主要限制因素。防治棉花黄萎病主要依靠抗病品种，但由于高抗黄萎病的棉花品种较少，且对黄萎病致病的机理以及棉花抗黄萎病的遗传方式的了解还比较少，目前对棉花黄萎病的防治还是以化学防治和生物防治为主。

棉花立枯丝核病是棉花苗期的主要病害之一，其病原菌为立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)。立枯丝核菌也是一种严重为害农作物的土传病原菌，可引起稻麦棉和多种蔬菜瓜果等的病害，一般用化学农药防治。

常规化学防治法能在一定程度上防治棉花黄萎病，施药见效快，但其使用成本高、毒性大、残留高，对环境存在污染等诸多不足。生物防治具有成本低，没有环境污染等优点，但现有的生物菌剂对棉花黄萎病、立枯丝核病的防治效果均不够理想，因此，发现高抗棉花黄萎病、立枯丝核病的微生物菌株，开发能够有效防治棉花黄萎病、立枯丝核病的生防制剂，具有广阔的应用前景。

现有文献已有多篇关于棉花黄萎病生物防治的研究报道，涉及的微生物类别主要有细菌、真菌和链霉菌。细菌类微生物例如枯草芽孢杆菌41b-1(菌种保藏号：cgmccno.5582)、枯草芽孢杆菌yb-04(cgmccno.6497)、枯草芽孢杆菌bs-03(cgmccno.3038)、坚强芽孢杆菌(cgmccno.0924)、解淀粉芽孢杆菌lh-1(cgmccno.8548)。真菌类类微生物例如球毛壳菌b221(cgmccno.5582)、简青霉菌cef818(cgmccno.5582)、变黑轮枝菌cef08111(cgmccno.5610)。链霉菌例如链霉菌42561(cgmccno.6556)、娄彻氏链霉菌(cgmccno.6556)等。

此外，目前已有多种生防菌联合使用的报道。例如，专利cn101990907a给出一种抗棉花枯黄萎病的复合生防菌剂，其生防菌包括热带假丝酵母、乳糖细黄链霉菌、绿色木霉菌和枯草芽孢杆菌。专利cn103525742a公开一种防治棉花黄萎病的菌剂，涉及的菌株包括枯草芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、灰绿链霉菌和荧光假单胞杆菌。上述专利均说明了复合生防菌剂对棉花枯黄萎病的防治效果，但并没有明确单个生防菌在其中发挥的作用和效果。

有关棉花立枯丝核病生物防治的研究亦有报道。例如，专利cn104430549a提供了一种抑制立枯丝核菌的微生物制剂的制备方法，涉及的生防菌为哈茨木霉accc30371。经检索，截止目前，尚未发现关于用蜡样芽胞杆菌防治棉花立枯丝核病的研究报道。

技术实现要素：

针对目前还没有单独使用蜡样芽胞杆菌防治棉花黄萎病和立枯丝核病的研究现状，本发明提供蜡样芽胞杆菌防治棉花病害的用途。在研究过程中，发明人所在团队还惊奇的发现，所用蜡样芽胞杆菌还有促进棉花植株生长的作用。

首先，本发明给出蜡样芽胞杆菌在防治棉花病害方面的应用，其所用的蜡样芽胞杆菌即为专利cn103937699a所述的蜡样芽胞杆菌zy-1，相应的菌株保藏信息为cctccno:m2014007，特别地，发明人研究发现蜡样芽胞杆菌zy-1可抑制病原菌大丽轮枝菌、立枯丝核菌的活性。

鉴于本专利发明人参与了蜡样芽胞杆菌zy-1的分离纯化与鉴定工作，为了更充分全面地说明蜡样芽胞杆菌zy-1在防治棉花黄萎病和立枯丝核病的应用，本专利在此描述该菌的分离纯化与鉴定过程。

蜡样芽胞杆菌zy-1的分离与纯化：将采自湖北省枣阳市的10g麦田土样，放置于200ml的六偏磷酸钠溶液(分散剂)中震荡悬浮5min；在悬浮状态下，吸取20ml加入80ml的0.1％的水琼脂中，震荡悬浮5min；在悬浮搅拌状态下，吸取0.3ml悬浮液，按10倍梯度(10^-1、10^-2和10^-3)稀释；将梯度稀释液分别置于80℃的烘箱中30min取出；待冷却后，涂3个平板(每个稀释浓度3个平板)，为1/10的tsa选择性培养基；所有平板置于22℃培养箱中培养，2～3d后挑选单菌落，编号保存。

蜡样芽胞杆菌zy-1的生理生化检测：在na平板培养基上，28℃培养36h，菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落大，3～7mm，边缘不整齐呈扩散状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃或蜡状，不分泌色素；为革兰氏阳性细菌，杆状，1.0～1.3×3.0～5.0μm，成链，运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显；能耐受7％nacl的培养，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、麦芽糖发酵阳性、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、vp试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚试验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》，初步鉴定为芽孢杆菌属。

蜡样芽胞杆菌zy-1的16srdna序列的测定：将菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，180rpm28℃培养24h，离心收集菌体。采用上海生工ezup柱式基因组dna抽提试剂盒(细菌)提取基因组。以提取到的基因组为模板，采用正向引物27bf5’-agagtttgatcctggctcag-3’；1492br5’-ggttaccttgttacgactt-3’对菌株的16srdna基因进行pcr扩增。pcr条件为：94℃3min；94℃45s，54℃30s，72℃1min30sec，35个循环；72℃延伸5min，4℃停止。pcr产物送上海英俊生物技术有限公司测序，长度为1466bp。测序结果在ebiocloud中与bacilluscereus相似性为99.7％。

基于蜡样芽胞杆菌zy-1对大丽轮枝菌、立枯丝核菌的抑制活性，本专利将蜡样芽胞杆菌zy-1作为生防菌株，用于防治棉花病害，尤其用于防治棉花黄萎病、立枯丝核病。

作为防治棉花病害的应用方式之一，在播种前，棉花种子粘附蜡样芽胞杆菌zy-1菌株。

进一步地，棉花种子粘附蜡样芽胞杆菌zy-1菌株的优选实施方式之一，即在播种前，采用蜡样芽胞杆菌zy-1菌液浸泡棉花种子。经实验证实，所用蜡样芽胞杆菌zy-1菌液浓度为6×10⁸cfu·ml^-1。

作为另一种防治棉花病害的应用方式，可用蜡样芽胞杆菌zy-1菌液对棉花植株进行灌根。经实验证实，所用蜡样芽胞杆菌zy-1菌液浓度为6×10⁸cfu·ml^-1。

另一方面，本发明还给出了所述蜡样芽胞杆菌zy-1促进棉花植株生长的应用。

作为所述的促生长应用方式之一，在播种前，采用蜡样芽胞杆菌zy-1菌液浸泡棉花种子。经实验证实，所用蜡样芽胞杆菌zy-1菌液浓度为6×10⁸cfu·ml^-1。

与现有技术相比，本发明至少具有下述的有益效果或优点。专利cn103937699a仅给出了蜡样芽胞杆菌zy-1在抑制草莓灰霉病方面的用途。经发明人进一步的研究发现，蜡样芽胞杆菌zy-1还可高效防治棉花病害，通过离体、盆栽和小区试验证实了蜡样芽胞杆菌zy-1对棉花黄萎病和立枯丝核病具有很好防治作用，尤其对棉花黄萎病的防效更为突出。因此，本发明拓展了蜡样芽胞杆菌zy-1在生防领域的应用。再者，本发明还证实了蜡样芽胞杆菌zy-1还具有促进棉花植株生长的作用，较为全面地研究了蜡样芽胞杆菌zy-1棉花生长期的影响，为开发新疆连作棉田棉花黄萎病、立枯丝核病优良生防菌剂奠定了实验基础。

附图说明

图1是本发明蜡样芽胞杆菌zy-1发酵液对棉花黄萎病菌的体外活性实验结果，左边为对照，右边为发酵液处理。

图2是本发明蜡样芽胞杆菌zy-1发酵液对棉花立枯丝核病菌的体外活性实验结果，左边为对照，右边为发酵液处理。

图3是本发明蜡样芽胞杆菌zy-1防治棉花黄萎病的盆栽试验效果图，图3-a为发酵液处理组，图3-b为接菌清水处理组，图3-c为不接菌清水处理组。

图4是本发明蜡样芽胞杆菌zy-1促进棉花根系生长图，图4-a为蜡样芽胞杆菌zy-1处理组，图4-b为清水处理组。

以下将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

具体实施方式

实施例1，离体抑菌活性试验

分别制备棉花黄萎病菌、立枯丝核病菌菌液：所用棉花黄萎病菌、立枯丝核病菌均由石河子大学农学院植物病理实验室提供。将病菌接种于pda培养基平板上，25℃培养15d，平板加入无菌水，刮取孢子，用血球计数板计数，调整菌液浓度为6×10⁶孢子·ml^-1，备用。

将分离纯化的单菌落接种于na培养基上，180r·min37℃培养48h，用6mm打孔器制成菌饼。pda培养基上涂布200μl6×10⁶ml^-1病菌孢子悬浮液，再将蜡样芽胞杆菌zy-1反接于pda培养基平板内，25℃培养4d，观察是否产生抑菌圈。

蜡样芽胞杆菌zy-1发酵液制备：将蜡样芽胞杆菌zy-1菌株接种于na培养液中，37℃，180r·min^-1条件下培养48h，离心10min(5000g)，取上清液，上清液经微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌，分装，置于4℃冰箱保存备用。

生长速率法抗菌试验：向9mlpda培养基中加入1ml无菌蜡样芽胞杆菌zy-1发酵液，摇匀后倒入灭菌的平板中，待其铺平凝固，在其中央接入病菌菌饼。以不加入蜡样芽胞杆菌zy-1发酵液为对照组，每个处理重复6次；25℃培养15d，测量菌落生长直径。

菌落直径的计算：菌落直径(cm)＝测量菌落直径平均值-0.09。

生长抑制率的计算：菌落生长抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100。

由实验结果可知(图1和2)，蜡样芽胞杆菌zy-1发酵液对棉花黄萎病和立枯丝核病菌都具有显著的抑制效果，无菌发酵液稀释10倍后，对黄萎病和立枯丝核病菌的抑制率分别为68.62±3.48％、79.23±2.12％。

实施例2，盆栽试验

本实施例描述蜡样芽胞杆菌zy-1防治棉花黄萎病的盆栽试验。试验在人工气候室进行，温室湿度为60～80％，温度为25℃，棉花种子为新陆中36，棉花种子用1％次氯酸钠消毒10min，蒸馏水冲洗，晾干。

棉花黄萎病原菌株接种于pda培养基中，25℃培养15d，用6mm打孔器打孔制成菌饼；再接种于pdb培养基中，25℃160r·min^-1振荡培养15d，8层无菌纱布过滤，收集分生孢子，用血球计数板调整菌浓度为6×10⁶ml^-1。

蜡样芽胞杆菌zy-1菌液的制备：将蜡样芽胞杆菌zy-1接种nb培养基中，37℃180r·min^-1振荡培养48h，5000g离心10min，菌体悬浮于无菌2％羧甲基纤维素钠(cmc)中。

将棉花种子浸泡于蜡样芽胞杆菌zy-1悬浮液4h(10ml2％cmc中包含200粒棉种和1g蜡样芽胞杆菌zy-1)，以不加蜡样芽胞杆菌zy-1为对照组，晾干。播种前通过稀释平板计数法调整菌液浓度为6×10⁸cfu·ml^-1。

棉花黄萎病的防治试验：(1)对照组：棉花黄萎病菌；(2)处理组：棉花黄萎病菌+蜡样芽胞杆菌zy-1；(3)不接菌对照组：清水处理但不接种棉花黄萎病菌。棉花黄萎病菌分生孢子接种于无菌土壤的菌浓度为6×10⁶g^-1(每克土壤中约6×10⁶个孢子)。菌蜡样芽胞杆菌zy-1的接种浓度为6×10⁸cfu/ml，3ml/株。每个处理5钵棉花，重复3次(每个处理共15盆)，接种30d、60d、80d、90d和120d后，统计病情指数和相对防治效。

病情指数＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)。

防治效果(％)＝(对照平均病情指数-处理平均病情指数)/对照平均病情指数。

由温室盆栽试验结果(表1、图3)可知，蜡样芽胞杆菌zy-1对棉花黄萎病有一定生防作用。接种后30～120d对照组棉花黄萎病病情指数为10.23～42.88，而蜡样芽胞杆菌zy-1处理组病情指数为3.85～9.33，表明蜡样芽胞杆菌zy-1能降低棉花黄萎病的发生，接种后30～120d，蜡样芽胞杆菌zy-1发酵液对棉花黄萎病菌相对防效为62.36～85.23％。

表1蜡样芽胞杆菌zy-1防治棉花黄萎病的盆栽试验生防效果

实施例3，小区试验

蜡样芽胞杆菌zy-1对棉花黄萎病的田间药效试验，选择常年发生黄萎病较重的地块进行。设定小区面积为30m²，随机区组排列。播种时间为2015年4月15日，棉花品种为新陆中36，土壤为沙壤土，肥力中等，灌溉条件较好。一膜4行，每行30株棉花，每个处理120株棉花，重复3次，当棉苗长至5～6片真叶时，处理组棉苗用蜡样芽胞杆菌zy-1菌液灌根，每株棉苗灌50ml(菌浓度为6×10⁸ml^-1)蜡样芽胞杆菌zy-1菌液。所用蜡样芽胞杆菌zy-1菌液的制备同实施例2。对照组用等量的清水灌根，不接种蜡样芽胞杆菌zy-1菌液。接种60d、90d和140d后，统计病情指数和相对防治效果。

病情指数＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)。

防治效果(％)＝(对照平均病情指数-处理平均病情指数)/对照平均病情指数。

试验结果见表2，蜡样芽胞杆菌zy-1对棉花黄萎病有一定生防作用，接种60～140d后，对照组棉花黄萎病病情指数为13.8～52.08，病情指数呈增长趋势，接种140d后病情指数达到最大值52.08，而蜡样芽胞杆菌zy-1处理病情指数分别为3.85～10.28，其相对防效为72.10～80.26％。

表2蜡样芽胞杆菌zy-1防治棉花黄萎病的田间试验结果

实施例4，促生长实验

试验在人工气候室进行，温室湿度为60～80％，温度为25℃，棉花种子为新陆中36，棉花种子用1％次氯酸钠消毒10min，蒸馏水冲洗，晾干。蜡样芽胞杆菌zy-1菌液的制备，以及棉花种子的浸种处理参见实施例2。以清水浸种处理为对照。播种前通过稀释平板计数法调整菌液浓度为6×10⁸cfu·ml^-1。播种出苗30天后，调查50株棉株，统计植株高度和鲜重。

表3蜡样芽胞杆菌zy-1对棉苗的促生长实验结果

促生试验结果(表3、图4)可知，蜡样芽胞杆菌zy-1棉花黄萎病有一定促生作用，处理组棉株根系更为发达，棉苗长势旺盛，苗壮。播种后30天，测量棉花的株高和鲜重，可以看到蜡样芽胞杆菌zy-1处理组株高和鲜重都比清水对照组显著增加。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。